楊惠婕，張玉蕾，劉碧洪，李長(zhǎng)玲，黃翔鵠

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

赤潮生物包括原生動(dòng)物，細(xì)菌及如甲藻、硅藻等藻類。其中有毒、有害赤潮藻類以甲藻居多，其次為硅藻、藍(lán)藻、金藻和隱藻等[1]。藻華有害的原因是有毒微藻的大量增殖，產(chǎn)生的藻毒素可能會(huì)污染水環(huán)境或魚(yú)、蝦、貝類等的食物，導(dǎo)致其窒息死亡，食用此類水產(chǎn)品也可能造成人類患病[2-5]。甲藻作為典型的赤潮生物種，能夠產(chǎn)生甲藻毒素。例如，短裸甲藻（Gymnodinium breνe）分泌的毒素為神經(jīng)性貝毒；利馬原甲藻（Prorocentrum lima）可產(chǎn)生腹瀉性貝毒。太平洋亞歷山大藻（Alexandrium pacificum）是塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）復(fù)合體中的一種[6]，其毒素類型為麻痹性貝毒（PSP），毒素譜主要成分為N-磺基氨基甲酰基衍生物(C1/C2，B1)、膝溝藻毒素（GTX1/GTX4）和新石房蛤毒素（NEO）[7-8]。亞歷山大藻一旦暴發(fā)，其產(chǎn)生的PSP 可經(jīng)過(guò)食物鏈在魚(yú)、蝦、貝類等生物體內(nèi)蓄積，會(huì)造成嚴(yán)重的水環(huán)境問(wèn)題，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失[9-11]。更甚者，從甲藻中提取的PSP 毒素可導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦的死亡[12]。研究表明，水生生物暴露于PSP 后，主要的應(yīng)激反應(yīng)包括產(chǎn)生大量活性氧（ROS），誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激（包括酶促和非酶促防御）反應(yīng)[13]、細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡[14]和導(dǎo)致細(xì)胞損傷（即脂質(zhì)過(guò)氧化）[15]。

作為評(píng)估環(huán)境脅迫對(duì)生物體產(chǎn)生氧化脅迫的一類生物標(biāo)志物，抗氧化系統(tǒng)通過(guò)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化水平和抗氧化酶活力的改變，從而評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)[16-17]。研究表明，亞歷山大藻會(huì)影響魚(yú)、蝦、貝類的生長(zhǎng)及免疫功能[10,18-20]。但太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus νannamei）的整體抗氧化酶系的影響還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究將凡納濱對(duì)蝦急性暴露在高濃度的太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h，從對(duì)蝦重要的解毒器官和代謝中心——肝胰腺入手，檢測(cè)其丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽—S 轉(zhuǎn)移酶（GST）、堿性磷酸酶（AKP）、多酚氧化酶（PPO）多種抗氧化酶活力的變化；同時(shí)觀察對(duì)蝦重要器官組織的病理?yè)p傷情況。通過(guò)抗氧化水平和病理兩方面的結(jié)果，分析太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性效應(yīng)，以期為研究赤潮有毒藻對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的毒性作用機(jī)制提供思路，為甲殼類動(dòng)物在太平洋亞歷山大藻脅迫下存在的解毒機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

太平洋亞歷山大藻的基本培養(yǎng)條件：溫度22 ℃，鹽 度25，光 照50 μmol·m-2·s-1，光暗比14 h∶10 h，采用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)搖瓶3次。

凡納濱對(duì)蝦由廣東省湛江市東海島試驗(yàn)基地提供，體長(zhǎng)（5.3 ± 0.3）cm，體質(zhì)量（2.5 ± 0.5）g，對(duì)蝦在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周，養(yǎng)在消毒處理的海水中。待處于穩(wěn)定狀態(tài)后，選取健康、活潑、生長(zhǎng)狀況相似的對(duì)蝦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

養(yǎng)殖海水采自廣東省湛江市東海島，鹽度調(diào)至25后消毒處理。

1.2 太平洋亞歷山大藻破碎液制備

將太平洋亞歷山大藻藻液在4 ℃、4 000 r/min條件下離心2 min，分別收集上清以及藻細(xì)胞，濃縮藻細(xì)胞到5.0×105/mL。濃縮后混入0.5 mm 氧化鋯珠，用組織破碎儀進(jìn)行破碎，破碎條件為70 Hz、2 min。

1.3 太平洋亞歷山大藻暴露實(shí)驗(yàn)

1.4 酶活測(cè)定

在0、3、6、9、12、24、48、72 h 分別從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)平行中各隨機(jī)選取6 尾蝦，取其肝胰腺液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

肝胰臟解凍后準(zhǔn)確稱取組織重量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶10比例加入預(yù)冷生理鹽水，高速研磨儀處理，然后以2 500 r/min離心10 min，取上清液用于酶活力測(cè)定。總蛋白以牛血清白蛋白BSA 為標(biāo)準(zhǔn)，Bradfords 法測(cè)定。SOD、GST、AKP、PPO 活力和MDA、GSH 含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按照各說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。每項(xiàng)酶促測(cè)定均進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

1.5 病理切片觀察

在暴露72 h 后分別從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)平行中各隨機(jī)選取2尾蝦，取其腸道、肝胰腺、鰓、神經(jīng)和肌肉，置于Bouins固定液，4 ℃保存。石蠟包埋切片，HE 染色，Olympus顯微鏡拍照，觀察其組織病理變化。

1.6 數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。使用GraphPad Prism 軟件繪制存活率曲線圖。對(duì)于不符合正態(tài)分布的存活率結(jié)果，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換處理。所有數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±SD）”表示，酶活以及存活率數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差（One-way ANOⅤA）分析和Duncan 多重比較檢驗(yàn)處理，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性差異用星號(hào)表示（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活的影響

如圖1 所示，太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦的存活率具有顯著影響（P＜0.01）；在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行9 h后，實(shí)驗(yàn)組的對(duì)蝦出現(xiàn)死亡，且存活率隨暴露時(shí)間的增加而降低。

圖1 太平洋亞歷山大藻破碎液對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活的影響Fig.1 Effect of Alexandrium pacificum on the survival of Litopenaeus νannamei

2.2 太平洋亞歷山大藻脅迫下凡納濱對(duì)蝦的抗氧化酶的變化

在實(shí)驗(yàn)處理3 h 時(shí)，SOD 活力極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；在處理6 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦的SOD 活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；在9 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SOD 活力極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；在48 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SOD 活力與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05）；在72 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的SOD 活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）（圖2(A)）。

由此可見(jiàn)，努力提高失地農(nóng)民再就業(yè)培訓(xùn)的“參與比率”，對(duì)于建構(gòu)長(zhǎng)效再就業(yè)培訓(xùn)系統(tǒng)、緩解失地農(nóng)民結(jié)構(gòu)性失業(yè)問(wèn)題、落實(shí)“就業(yè)是最大民生”的治國(guó)理念而言，都具有重要的實(shí)踐意義。

圖2 太平洋亞歷山大藻破碎液處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺抗氧化水平的影響Fig.2 Effects of solution of crushed Alexandrium pacificum on antioxidant levels in hepatopancreas of Litopenaeus νannamei

太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦MDA 質(zhì)量摩爾濃度的影響如圖2(B)。在實(shí)驗(yàn)處理3 h 時(shí)，MDA質(zhì)量摩爾濃度極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；在連續(xù)處理6 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦的MDA 質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；在9、12、24和48 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組MDA質(zhì)量摩爾濃度均極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦GST 活力的影響如圖2(C)。在實(shí)驗(yàn)處理3、6 h 時(shí)，GST 活力極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；在9、12、24 和72 h 時(shí)，GST 活力極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；在48 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的GST活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦GSH 質(zhì)量摩爾濃度的影響如圖2(D)。在實(shí)驗(yàn)處理6 h 時(shí)，GSH質(zhì)量摩爾濃度極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；在連續(xù)處理12 h 時(shí)，GSH 質(zhì)量摩爾濃度極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；在48 h 時(shí)，GSH 質(zhì)量摩爾濃度與對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.05）；72 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的GSH 質(zhì)量摩爾濃度極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦AKP 活力的影響如圖2(E)。在實(shí)驗(yàn)處理3 h 時(shí)，AKP 活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；6 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組AKP 活力極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；在9、12、48 和72 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組AKP的活力均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦PPO 活力的影響如圖2(F)。PPO 活力在實(shí)驗(yàn)處理9 h 時(shí)開(kāi)始被誘導(dǎo)。在9 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；在48 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的PPO 活力與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05）。

2.3 太平洋亞歷山大藻脅迫下凡納濱對(duì)蝦的組織病理變化

對(duì)照組對(duì)蝦的腸上皮細(xì)胞緊密連接，排列整齊、致密，外層結(jié)締組織厚，可見(jiàn)血竇分布（圖3(A)）；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h后，對(duì)蝦腸上皮細(xì)胞間黏附力下降，細(xì)胞空泡化或自溶，組織細(xì)胞間隙變大、解體（圖3(B)）。

圖3 太平洋亞歷山大藻暴露72 h后凡納濱對(duì)蝦組織結(jié)構(gòu)的變化Fig.3 Changes in tissue structure of Litopenaeus νannamei after 72 h exposure to Alexandrium pacificum

對(duì)照組對(duì)蝦的鰓絲排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞和核明顯（圖3(C)）；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h 后，對(duì)蝦的鰓絲排列紊亂，有的區(qū)域出現(xiàn)黏連，核固縮，變小或消失（圖3(D)）。

對(duì)蝦的肝胰腺為復(fù)管狀腺，由多級(jí)分支的小管組成；肝小管外壁由單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，其上皮細(xì)胞按功能分為吸收細(xì)胞和分泌細(xì)胞。各肝胰腺小管之間有結(jié)締組織與脂肪組織包裹與分隔，管腔呈五角或四角星形。對(duì)照組對(duì)蝦的肝胰腺小管結(jié)構(gòu)完整，基底膜完整，邊界清晰，管腔呈星形（圖3(E)）；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h后，對(duì)蝦肝小管管腔擴(kuò)大，形狀不規(guī)則，吸收細(xì)胞和分泌細(xì)胞出現(xiàn)空泡化（圖3(F)）。

對(duì)照組對(duì)蝦肌肉組織及肌纖維紋路清晰、排列致密（圖3(G)）；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h 后，對(duì)蝦肌束萎縮，相鄰肌束間距較大，肌纖維排列雜亂（圖3(H)）。

對(duì)照組腹神經(jīng)由多個(gè)節(jié)間神經(jīng)纖維束連成的神經(jīng)節(jié)構(gòu)成，兩側(cè)融合，纖維束分成兩束，縱向把各個(gè)神經(jīng)節(jié)聯(lián)系起來(lái)，髓質(zhì)明顯(圖3(I))；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h 后，對(duì)蝦神經(jīng)束間隙變大，神經(jīng)節(jié)分布散亂（圖3(J)）。

3 討論

太平洋亞歷山大藻是一種喜高光微藻，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的照度一般為50 μmol·m-2·s-1[21]，在溫度為17～25 ℃[22]、鹽度為23～27 條件下生長(zhǎng)最佳[23]；當(dāng)溫度低于10 ℃或者高于30 ℃，藻細(xì)胞則會(huì)停止生長(zhǎng)甚至短時(shí)間內(nèi)死亡[22]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)情況，溫度22 ℃，鹽度25，照度50 μmol·m-2·s-1，光暗比為14 h∶10 h 時(shí)藻生長(zhǎng)最佳。太平洋亞歷山大藻及其產(chǎn)生的毒素，如麻痹性貝毒、溶血素等，可對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生急性毒性作用，導(dǎo)致水生動(dòng)物行為改變、生殖中斷、生長(zhǎng)遲緩和酶活力降低，甚至直接造成海洋生物死亡[24]。研究發(fā)現(xiàn)，亞歷山大藻對(duì)黑褐新糠蝦（Neomysis awatschensis）有致死作用[25]，其去藻過(guò)濾液也能顯著提高糠蝦的死亡率；亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦蚤狀幼體的96 h 致死半濃度LC50為7 500 mL-1[26]；斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）暴露于10 000 mL-1亞歷山大藻中，12 h 后出現(xiàn)蝦死亡現(xiàn)象[27]，并且在死亡對(duì)蝦的鰓和胃里發(fā)現(xiàn)亞歷山大藻細(xì)胞。結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇1.0×104mL-1作為急性研究濃度。

在甲殼類動(dòng)物中，肝胰腺是重要的解毒器官，也是清除多余ROS 的重要代謝中心，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28-29]。凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和代謝之間存在動(dòng)態(tài)平衡。受到太平洋亞歷山大藻毒素PSP 氧化脅迫時(shí)，對(duì)蝦體內(nèi)ROS 和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡被打破[30]，表現(xiàn)為氧化應(yīng)激，可誘導(dǎo)抗氧化酶活力的改變?？寡趸竿ㄟ^(guò)滅活ROS和修復(fù)氧化生物分子來(lái)保護(hù)生物體免受氧化損傷[31]。因此，抗氧化酶活力的變化能夠反映機(jī)體氧化損傷的水平[32-33]。

丙二醛（MDA）作為機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物，其含量變化水平能直接反映出PSP引起的組織細(xì)胞膜損傷情況[18]。研究表明，微囊藻（Microcystis）可導(dǎo)致羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicus）組織脂質(zhì)過(guò)氧化[34]；有毒裸甲藻可誘導(dǎo)扇貝過(guò)氧化脂質(zhì)增加[14]。本研究中，6 h 時(shí)，對(duì)蝦肝胰腺組織MDA 含量顯著高于對(duì)照組，表明太平洋亞歷山大藻誘導(dǎo)了凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺脂質(zhì)過(guò)氧化，這也是造成對(duì)蝦組織細(xì)胞的膜溶解、破裂的重要原因。超氧陰離子（O2-）是ROS 主要的自由基，過(guò)氧化物歧化酶（SOD）的作用是把O2-歧化成H2O2和O2，免除多余的高活性氧化物質(zhì)對(duì)機(jī)體的迫害[35]。本研究中，6 h 時(shí)，對(duì)蝦肝胰腺組織SOD 活力較于對(duì)照組顯著增高，表明對(duì)蝦發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化后，SOD 能積極發(fā)揮作用清除生物體內(nèi)過(guò)量的O2-；有研究表明，在大量O2-被SOD 歧化過(guò)程中，生成的H2O2會(huì)抑制SOD 活力[36]。本研究中，9 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中SOD 活力以及MDA 含量顯著低于對(duì)照組，表明對(duì)蝦受到氧化脅迫后，SOD 被迅速誘導(dǎo)，一定程度上抑制了脂質(zhì)過(guò)氧化作用；同時(shí)，清除活性氧所產(chǎn)生的H2O2也使SOD活力降低。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）不僅能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，清除體內(nèi)氧自由基，還有解毒功能。GST 催化谷胱甘肽（GSH）與多種內(nèi)源性和外源性親電化合物的偶聯(lián)，減少親電分子與細(xì)胞內(nèi)生物大分子（如DNA）等結(jié)合形成脂類過(guò)氧化物，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用[37-39]。GST還可催化GSH與毒性化合物的活力產(chǎn)物共軛結(jié)合，從而達(dá)到解毒作用。本研究中，6 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦的GST 活力顯著高于對(duì)照組。GST 活力被誘導(dǎo)是機(jī)體對(duì)氧化脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)[40-42]，表明凡納濱對(duì)蝦受到太平洋亞歷山大藻毒素脅迫后，一方面為清除大量產(chǎn)生的氧自由基，對(duì)蝦肝胰腺增強(qiáng)GST 活力來(lái)抵抗傷害，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化；另一方面，GST 被激活參與了太平洋亞歷山大藻所產(chǎn)有毒物質(zhì)的代謝及解毒過(guò)程[24,43]。GST 活力變化與GSH結(jié)果相呼應(yīng)，GSH可作為反應(yīng)底物通過(guò)GST 催化清除自由基和過(guò)氧化物，具有抗氧化作用和整合解毒作用，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[44-45]。此外，GSH 還會(huì)在甲殼動(dòng)物代謝過(guò)程中誘導(dǎo)毒素轉(zhuǎn)化[46-47]。江天久等[48]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)龍蝦（Panulirus stimpsoni）受PSP 脅迫后，GSH 誘導(dǎo)毒素由GTX2,3 轉(zhuǎn)換成了GTX1,4。本研究中，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦肝胰腺組織GSH含量在6 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，表明對(duì)蝦在太平洋亞歷山大藻的脅迫下，機(jī)體產(chǎn)生了過(guò)量的氧自由基，誘導(dǎo)了GSH 的生成以加速消除多余的氧自由基，對(duì)抗氧自由基對(duì)肝胰腺的損害。這與梁忠秀等[49]將中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）暴露于亞歷山大藻中測(cè)得結(jié)果一致。

堿性磷酸酶（AKP）能有效地清除入侵甲殼動(dòng)物的污染物和毒素[50]。AKP 作為溶酶體酶的重要組成部分，參與一系列的生理代謝活動(dòng)，如膜的分子滲透、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，以及一些磷素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運(yùn)輸?shù)?。本研究中? h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組AKP活力顯著高于對(duì)照組，表明在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，溶酶體膜的通透性增強(qiáng)，溶酶體酶進(jìn)入胞漿后AKP被激活。

在72 h，SOD、GST、AKP 活力以及GSH 含量均顯著低于對(duì)照組，表明對(duì)蝦暴露在高濃度的太平洋亞歷山大藻后受到了嚴(yán)重的氧化脅迫，高強(qiáng)度脅迫導(dǎo)致對(duì)蝦應(yīng)激系統(tǒng)紊亂，溶酶體失去穩(wěn)定，這可能是一種潛在的細(xì)胞凋亡的早期信號(hào)，說(shuō)明隨后產(chǎn)生積累的氧自由基會(huì)促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[51]。此外，GST活力被抑制，可影響機(jī)體的解毒功能[24]，增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)需經(jīng)GST代謝的外源性毒物的敏感性[52]。

多酚氧化酶（PPO）是一種雙功能的含銅酶[53]，是酚氧化酶原激活系統(tǒng)識(shí)別異物和免疫反應(yīng)的起點(diǎn)，其活力高低影響著對(duì)蝦免疫系統(tǒng)對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的異物反應(yīng)速度和強(qiáng)度，以及激活后續(xù)反應(yīng)如凝集、吞噬、黑化等作用的效率。在甲殼動(dòng)物中，PPO 以酚氧化物酶原的形式存在，能夠被一些蛋白質(zhì)或多糖激活而轉(zhuǎn)變成活力的多酚氧化物酶。在9 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組肝胰腺的PPO 活力顯著低于對(duì)照組。分析其原因，一方面可能是由于對(duì)蝦在受到氧化脅迫時(shí)，誘導(dǎo)了GSH 等抗氧化酶的活力，肝胰腺內(nèi)蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子與GSH 發(fā)生共軛反應(yīng)，酚氧化酶原無(wú)法被激活；另一方面可能是在氧自由基的催化下，PPO 被活化，迅速黏附異物進(jìn)行識(shí)別，誘導(dǎo)有關(guān)底物由酚轉(zhuǎn)化到醌，最終產(chǎn)生黑色素，抑制病原體胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活力。48 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組肝胰腺的PPO 活力顯著高于對(duì)照組，表明對(duì)蝦防御體外物質(zhì)入侵的過(guò)程大量PPO 被活化，以抑制氧自由基的脅迫。由此可見(jiàn)，在太平洋亞歷山大藻的脅迫下，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的SOD、GSH、GST、AKP 和PPO 均會(huì)被誘導(dǎo)發(fā)揮作用，清除過(guò)量的活性氧，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抵御外來(lái)毒性。

太平洋亞歷山大藻所產(chǎn)的PSP 毒素，是特異性鈉離子通道阻斷劑，可導(dǎo)致膜內(nèi)外的滲透壓不平衡，從而使膜部分溶解。PSP毒素進(jìn)入生物體后，機(jī)體產(chǎn)生的大量活性氧自由基會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化[49,54]，生成的脂質(zhì)過(guò)氧化物（如MDA）等與膜上蛋白質(zhì)反應(yīng)會(huì)增加膜的通透性,引起膜結(jié)構(gòu)溶解。此外，GSH 還會(huì)誘導(dǎo)PSP 毒素發(fā)生毒素成分的轉(zhuǎn)化[55-56]，這種轉(zhuǎn)化會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基[49]，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化[54]，造成細(xì)胞膜溶解。此外，膜結(jié)構(gòu)的破損會(huì)加速PSP 的侵入，使更多的藻毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。本研究中，將凡納濱對(duì)蝦暴露于太平洋亞歷山大藻后，其腸道、鰓和肝胰腺的上皮細(xì)胞均出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞出現(xiàn)了黏連，膜出現(xiàn)了溶解，這正是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的結(jié)果。梁忠秀等[57]將中國(guó)對(duì)蝦暴露于亞歷山大藻中，發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦肝胰腺中的吸收細(xì)胞和分泌細(xì)胞均出現(xiàn)了空泡化，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。其中，對(duì)蝦鰓組織腫脹、鰓絲部分黏連，這和鰓直接與藻接觸或是直接接觸了太平洋亞歷山大藻分泌的其他藻毒素有關(guān)[58]。亞歷山大藻對(duì)鰓的機(jī)械損傷已在魚(yú)類的研究中得到證實(shí)[10,19]。鰓是蝦類的呼吸器官，是太平洋亞歷山大藻最初作用的器官，鰓的病變會(huì)直接導(dǎo)致對(duì)蝦窒息死亡。神經(jīng)作為靶器官之一，PSP會(huì)損傷蝦的神經(jīng)節(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)髓質(zhì)分裂以及細(xì)胞溶解，從而導(dǎo)致麻痹、痙攣等異常行為或死亡[10]。神經(jīng)系統(tǒng)麻痹后，對(duì)蝦肌束萎縮，肌纖維排列雜亂。這也是造成對(duì)蝦神經(jīng)束間隙變大，神經(jīng)節(jié)分布散亂，神經(jīng)細(xì)胞溶解的原因。因此，高濃度的PSP毒素暴露會(huì)造成對(duì)蝦重要組織及器官的損傷。其中，鰓的病變以及神經(jīng)系統(tǒng)的受損均會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦死亡。此外，由于對(duì)蝦的抗氧化和解毒代謝能力有限，機(jī)體抗氧化酶系在高濃度的PSP 毒素暴露下會(huì)嚴(yán)重受損，導(dǎo)致對(duì)蝦死亡。這些都是太平洋亞歷山大藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性影響，將有助于解釋其對(duì)對(duì)蝦的致毒機(jī)制。

4 結(jié)論

太平洋亞歷山大藻毒素會(huì)降低凡納濱對(duì)蝦的存活率；對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺具有脂質(zhì)過(guò)氧化作用，會(huì)誘導(dǎo)MDA 含量增加，導(dǎo)致對(duì)蝦氧化應(yīng)激和組織損傷。凡納濱對(duì)蝦在太平洋亞歷山大藻暴露下，SOD、GSH、GST、AKP 和PPO 均被激活以清除過(guò)量的活性氧，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抵御外來(lái)毒性。在嚴(yán)重的氧化脅迫下，凡納濱對(duì)蝦的腸道、肝胰腺、鰓、肌肉和神經(jīng)組織嚴(yán)重受損，對(duì)蝦氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡遭到破壞，對(duì)蝦的免疫功能遭到損傷，多種免疫酶活力均被抑制。