吳亮，朱姝，張皓，譚菊，王凡，牛鴻宇，譚璐，楊海君*

（1.核工業(yè)二三〇研究所，長沙 410007；2.湖南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，長沙 410128；3.湖南省伴生放射性礦產(chǎn)資源評價與綜合利用工程技術研究中心，長沙 410007；4.湖南省長沙生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，長沙 410001；5.長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院，長沙 410004）

《2020 中國生態(tài)環(huán)境狀況公報》顯示，影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質量的主要污染物是重金屬，其中Cd 為首要污染物。據(jù)統(tǒng)計，全國農(nóng)田土壤Cd 污染面積已超過2.8×105hm2，受到Cd 污染的谷類作物高達1.46×108kg[1]。耕地Cd污染已嚴重威脅到農(nóng)產(chǎn)品質量安全和人民群眾身體健康，對耕地Cd 污染的治理迫在眉睫。重金屬在土壤中具有隱蔽性、滯后性、形態(tài)多樣性、累積性、消除難度大等特點，如何采取有效的技術方法修復土壤Cd 污染已成為當前研究的重點和熱點。常見的土壤重金屬污染治理方法有土壤置換、電動修復等物理法和化學固定、化學淋洗等化學法，但采用這些方法治理Cd 污染存在可實施范圍窄、成本高、會破壞土壤原有結構，且易造成土壤和地下水的二次污染等問題，因此至今未能大規(guī)模推廣應用，也不適宜于大面積Cd污染農(nóng)田土壤的修復治理。而植物修復技術具有安全、廉價等特點，不僅可用于重金屬重度污染區(qū)（如礦山）的復墾，而且還可用于重金屬中輕度污染土壤的改良，同時對修復后的植物進行資源化利用，可能產(chǎn)生一定的經(jīng)濟效益。相比于其他方法，植物修復技術引起次生環(huán)境問題的可能性小，且可通過回收與集中處置修復后的高富集性植物，徹底將重金屬從土壤中移除[2]。植物修復被認為是重金屬污染土壤修復治理最有效的方法[3-4]，其關鍵是篩選獲取超富集植物以及對收獲植物的資源化利用。隨著對重金屬耐受性植物與超富集植物研究的日漸增多，植物修復作為一種凈化土壤的生態(tài)技術被推廣，相關的工程性試驗研究以及實際應用效果也顯示了植物修復技術商業(yè)化的可行性[5-6]。目前，國內(nèi)研究者已篩選出Cd 超富集植物80 種，隸屬于29 科69屬[7]。這些超富集植物在修復土壤Cd 污染的過程中發(fā)揮了較大作用[8-10]，但受自身生物量小、或本身具有入侵性、或栽培成本高、或經(jīng)濟價值低而影響到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者收入等諸多問題制約，其中某些超富集植物的推廣應用受到限制。因此，探尋高富集、生物量大、易管理、適生性強、資源化利用程度高、經(jīng)濟價值高及有助于改良土壤的先鋒植物是目前植物修復研究的重點。

地膚[Kochia scoparia（L.）Schrad.]別名掃帚菜，為藜科地膚屬一年生草本植物，成熟期株高50~100 cm，冠幅50~60 cm，花期7—9 月，果期8—10 月。地膚極耐旱、耐鹽堿和貧瘠、適生性強、根系發(fā)達、生長快、生物量大。地膚被人們廣泛栽種，其幼嫩部分可入藥或食用，成熟后可用于制作掃帚。目前對地膚的研究主要集中于其營養(yǎng)成分[11-12]、耐鹽生理特性[13-17]、栽培與園林應用等方面，也有研究報道了地膚對礦區(qū)土壤重金屬的累積特性[18-20]、耐受和富集能力[21-22]，但尚未見到有關酸性土壤和Cd脅迫對地膚生長及耐性機制的研究報道，該方面研究是對地膚開展實際應用的前提。因此，本研究采用盆栽控制試驗，測定Cd脅迫下地膚生物量及不同器官中的Cd 含量，分析地膚對Cd 的生長響應、各器官中Cd 的遷移轉化規(guī)律以及亞細胞分布和化學形態(tài)，揭示地膚對Cd 的積累和耐性機制，以期為其在耕地Cd 污染修復實踐中應用提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗地位于湖南農(nóng)業(yè)大學耘園基地（30°07'N，111°18'E）。試驗時間為2021 年5 月3 日至10 月14日。供試盆栽土壤由自然土和營養(yǎng)土按體積比4∶1混合而成，混合后盆栽土壤pH 6.10，含水量25.88%，總Cd 1.253 mg·kg-1，有效態(tài)Cd 0.942 mg·kg-1。自然土采自試驗地附近農(nóng)田表層土（0~20 cm），去除土壤中植物殘體和石子后，將土樣用竹筒充分碾細，碾細后自然土pH 6.23，總Cd 1.005 mg·kg-1，有效態(tài)Cd 0.895 mg·kg-1。營養(yǎng)土購于廈門市花仙谷農(nóng)業(yè)有限公司，pH 5.78，含水量31.15%，有機質43.5%，總Cd 0.246 mg·kg-1，堿解氮337.6 mg·kg-1，有效磷660.6 mg·kg-1，速效鉀8 771 mg·kg-1，陽離子交換量54.6 cmol·kg-1，交換性鈣31.2 cmol·kg-1，交換性鎂10.9 cmol·kg-1，電導率0.262 mS·cm-1（水土比10∶1），銨態(tài)氮85.5 mg·kg-1，硝態(tài)氮306.8 mg·kg-1，通氣孔隙度25.89%，持水孔隙度49.97%。

本試驗所用地膚苗來自湖南省長沙縣黃花鎮(zhèn)長湖村科研合作基地。地膚在移栽培植期間僅發(fā)生少量蚜蟲危害（為保障試驗結果不受干擾未噴施任何殺蟲劑產(chǎn)品）。在地膚移栽培植期，每間隔7~10 d 澆水1次，待植株生長至25~30 cm，追施有機肥水溶液（N+P2O5+K2O≥5%，總Cd 0.07 mg·kg-1），第一次追肥后，每間隔35 d追肥一次。

1.2 試驗設計

本試驗盆栽土為混合土，土壤總Cd 含量1.253 mg·kg-1，設定每盆土壤質量為10 kg（約占盆體積的4/5），Cd2+添加量（CdSO4溶液制備）依次為0、0.3、0.9、1.5、3.0、9.0 mg·kg-1，盆栽土壤中最終實測Cd 含量分別 為1.253、1.553、2.153、2.753、4.253、10.253 mg·kg-1。結合長株潭地區(qū)耕地土壤pH 特征（pH 在4.5~6.5 之間的土壤占比89.34%），本試驗盆栽土壤初始pH分別設定為6.1（T處理）和5.0（TS處理），試驗各處理設計見表1。每盆土壤平衡14 d 后，于2021 年5 月17 日統(tǒng)一移栽株高、長勢、生物量等均較一致的地膚幼苗。每盆移栽3 株地膚，株距均勻分布，盆下墊一淺托盤，植苗后統(tǒng)一移入活動式塑料大棚內(nèi)，移栽當日澆足水。移栽后1 周左右根據(jù)盆中土壤干濕情況進行適量補水，借助便攜式土壤水分含量測定儀，使土壤含水量保持在70%左右。當氣溫升至35 ℃及以上時，定期補水使土壤濕潤，并保證光照充分，在強光照射和高溫天氣對地膚采取遮陽網(wǎng)防護。成熟期地膚樣品采集時間為2021年10月14日。

表1 試驗設計Table 1 Experiment design

1.3 測定項目與方法

在T1~T6 和TS1~TS6 處理中，每處理選取3 盆株高、長勢、冠幅等均較一致的地膚進行采樣，并在選取的3盆中各拔出1株完整地膚植株，用陶瓷剪刀剪下其根系和莖（上、中、下部混合剪取約5 g）鮮樣用于Cd的亞細胞及化學形態(tài)分析。將每盆中剩余的2株地膚用陶瓷剪刀分離植株根系和地上部，分裝于密封袋中并編號，進行地膚的根系和莖Cd含量測定（因在采集成熟期地膚時，大部分葉已凋落，加之地膚葉生物量小，故未對地膚葉單獨進行Cd含量檢測與分析）。

1.3.1 樣品Cd的測定

采用濕式消解法[23]，分別稱取一定量干燥后的根系、莖樣品粉末置于硬質消解管中，加入10 mL 濃硝酸（14.5 mol·L-1），蓋上彎頸漏斗浸泡過夜，用管式消解爐消解，升溫程序為70 ℃保持30 min，90 ℃保持30 min，120 ℃保持120 min，140 ℃保持120 min，然后趕酸至1 mL左右定容過濾，保存待測。

1.3.2 亞細胞組分的測定

亞細胞組分的分離采用差速離心法[24]。剪碎稱取地膚鮮樣（根系、莖）0.2 g，加入10 mL 預冷的提取液進行研磨，提取液組成如下：0.25 mol·L-1蔗糖溶液，50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液，1 mmol·L-1二硫蘇糖醇溶液。提取液少量多次加入，在4 ℃低溫下用研缽將樣品研磨成勻漿，然后轉移到50 mL 離心管中，使用高速冷凍離心機（4 ℃）以4 000 r·min-1離心10 min，下部沉淀為細胞壁組分（Fcw），將上清液繼續(xù)在10 000 r·min-1下離心分離45 min，得到的下部沉淀為細胞器組分（For），上清液則為可溶性組分（Fs）。

1.3.3 Cd化學結合形態(tài)測定

參照Lu 等[25]的方法，利用化學試劑對地膚根系、莖細胞中不同化學形態(tài)的Cd進行逐步提取。稱取地膚冰凍樣品0.5 g，少量多次加入20 mL 提取劑，用研缽將樣品研磨成勻漿后轉移至50 mL 離心管中，放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱振蕩24 h 后，以4 000 r·min-1的轉速離心15 min，將上清液分離，向離心管內(nèi)的沉淀物中再加入10 mL同種提取劑，25 ℃恒溫振蕩1 h后，于4 000 r·min-1離心15 min，將兩次離心后的上清液合并，形成以下由5 種提取劑依次逐步提取得到的Cd形態(tài)：FE，由80%乙醇提取后的硝酸鹽、氯化物為主的無機鹽及氨基酸等；Fw，由去離子水提取后的水溶性有機酸鹽、重金屬的一代磷酸鹽[M（H2PO4）2]等；FNaCl，由1 mol·L-1NaCl 溶液提取后的果膠酸鹽、與蛋白質呈結合態(tài)或吸著態(tài)的重金屬Cd 等；FHAc，由2%HAc 提取后的難溶的金屬Cd 磷酸鹽等；FHCl，由0.6 mol·L-1HCl 提取后的草酸鹽等；FR，殘渣態(tài)。將上述分離的上清液和沉淀組分裝入三角瓶中，并置于電熱板（70 ℃）上蒸發(fā)至近干后，用HNO3-HClO4消解定容，采用ICP-MS測定Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用3 個重復樣的算術平均值±標準偏差（SD）表示。采用SPSS 25.0 軟件中的單因素方差（ANOVA），及最小顯著差數(shù)法（LSD）進行顯著性檢驗（P<0.05）。采用LSD 對數(shù)據(jù)進行多重比較，用重復度量法分析不同pH 值、不同添加量Cd處理及二者交互效應對地膚根系、莖中亞細胞Cd含量的影響，采用GraphPad Prime 8.3制圖。

富集系數(shù)（BCF）為地膚植株體內(nèi)（根系、莖）Cd含量（mg·kg-1）與土壤Cd含量（mg·kg-1）的比值。

轉運系數(shù)（TF）為地膚植株地上部分（莖）Cd 含量（mg·kg-1）與地膚植株地下部分（根系）Cd 含量（mg·kg-1）的比值。

Cd 積累量（mg）為地膚植株各部位Cd 含量（mg·kg-1）與植株各部位干質量（kg）的乘積。

2 結果與分析

2.1 不同處理對成熟期地膚生物量的影響

表2 為土壤Cd 脅迫對地膚生物量的影響。在T3~T6 處理下，地膚總生物量和莖生物量均逐漸升高，而根系生物量在T1~T5 處理下逐漸升高。T5 和T6 處理下的地膚總生物量相比T1 處理顯著增加（P<0.05），且T6 處理地膚莖生物量達到最高，比T1 處理增加了51.79%。地膚根系生物量在T5處理下達到最高，為T1 處理的2.22 倍。在TS 處理組中，隨著Cd 添加量的升高，地膚總生物量、根系生物量均呈先降低后升高的趨勢。在TS3 和TS4 處理下，地膚莖生物量相比TS1處理顯著降低（P<0.05），分別下降了42.73%和38.84%。在TS4、TS5及TS6處理下，地膚根系生物量相比TS1 處理顯著降低，分別下降了47.19%、61.82%和51.22%。對比發(fā)現(xiàn)，T4和T5處理下的地膚總生物量分別高于對應的TS4 和TS5 處理，且TS1 處理的地膚莖和根系生物量在所有Cd 處理中均最高，顯著高于對應的T1 處理（P<0.05），說明地膚在設定的酸性土壤環(huán)境中均能正常生長，進一步證實了地膚對酸性土壤的適應性強。

表2 不同處理地膚的生物量（g，以干質量計）Table 2 Biomass of Kochia scoparia（L.）Schrad.in different treatments（g，calculated by dry weight）

2.2 地膚植株對Cd的積累及其富集與轉移特性

圖1（a）為Cd 脅迫下地膚根系、莖中Cd 含量及根系與莖混合樣品Cd含量。T處理組地膚根系Cd含量變化范圍為3.27~13.36 mg·kg-1，莖部Cd 含量變化范圍為3.66~21.4 mg·kg-1，約為根系的1.12~1.60倍。隨著Cd添加量增加，地膚根系中Cd含量呈降低-升高-降低-升高的變化趨勢，莖中Cd含量呈升高-降低-升高-降低-升高的變化趨勢，且相同Cd 添加量處理下莖中Cd 含量均高于根系。TS 處理組地膚根系中Cd含量呈升高-降低-升高-降低-升高的變化趨勢，莖中Cd 含量呈先降低后升高的趨勢，除TS2 處理外，其余相同Cd 添加量處理下莖中Cd 含量均高于根系。從圖1 還可知，T4 和T6 處理的地膚莖中Cd 含量均顯著高于T1 處理（P<0.05），且T6 處理下地膚根系與莖中Cd 含量均達到最高值，分別為13.36 mg·kg-1和21.40 mg·kg-1，分別為T1 處理下的3.23 倍和4.91 倍；TS6處理下地膚根系與莖中Cd含量均顯著高于TS1處理（P<0.05），且TS6處理時地膚根系與莖中Cd含量均達到最高值，為15.67 mg·kg-1和16.08 mg·kg-1，分別是TS1 處理下的4.65 倍和4.12 倍。對比不同pH 值、相同Cd 添加量處理得知，除Cd 添加量為0.9 mg·kg-1時TS 處理地膚莖部Cd 含量高于T 處理外，在其余Cd添加量下，T處理地膚莖部Cd含量均高于TS處理。

圖1 Cd脅迫下地膚根系和莖中Cd含量及其積累量Figure 1 Cd content and accumulation in the root and stem of Kochia scoparia（L.）Schrad.under Cd stress

圖1（b）為Cd脅迫下地膚根系、莖中Cd積累量及根系與莖混合樣品Cd 積累量。所有處理下莖部Cd積累量均大于根系，說明Cd主要積累在地膚莖部。T處理組，隨著Cd 添加量升高，地膚根系中Cd 積累量呈現(xiàn)升高-降低-升高-降低-升高的變化趨勢，在莖中則呈現(xiàn)升高-降低-升高的變化趨勢，且莖中的增幅尤為明顯。T6 處理下根系和莖的Cd 積累量均達到最高值，為175.15 μg·pot-1和1 009.22 μg·pot-1。T 處理組中地膚莖的Cd 積累量為根系的4.01~6.50倍。TS處理組地膚根系的Cd積累量變化趨勢與T處理組大體相同，而莖的Cd 積累量則呈先降低后升高的趨勢，TS6 處理下根系和莖的Cd 積累量均達到最高值，分別為178.24 μg·pot-1和789.75 μg·pot-1。TS處理組中莖的Cd 積累量為根系的1.39~8.40 倍。此外，對比不同pH 值、相同Cd 添加量處理可知，T4~T6處理地膚莖部Cd積累量均高于TS4~TS6處理。

表3 為Cd 脅迫下地膚根系、莖及其混合樣品Cd含量和Cd 積累量的相關性分析結果?？梢钥闯觯啬w根系Cd 含量、根系與莖Cd 含量在T 處理與TS 處理組間相關系數(shù)均高于0.98，達極顯著相關水平（P<0.01），莖Cd 含量、莖Cd 累積量和根系與莖Cd 累積量組間相關系數(shù)均高于0.96，達顯著相關水平（P<0.05），但根系Cd累積量組間相關系數(shù)僅為0.76，相關性不顯著（P>0.05），表明地膚莖是積累Cd 的主要器官，地膚在不同土壤pH條件下，其莖部對Cd的富集能力不同。

表3 地膚根系、莖、根系與莖的Cd含量和Cd積累量的相關性分析Table 3 Correlation analysis of Cd content and accumulation in roots,stems,roots and stems of Kochia scoparia（L.）Schrad.

圖2 為地膚根系和莖在Cd 脅迫下的富集系數(shù)和轉運系數(shù)。T和TS處理組中地膚根系和莖Cd富集能力均為莖>根。T 處理組中地膚根系和莖的富集系數(shù)均大于1，均值分別為2.09 和2.84；TS 處理組地膚根系和莖的富集系數(shù)也大于1，均值分別為2.06和2.34。從圖2 還可知，隨著土壤Cd 添加量增加，T 處理組地膚莖部對Cd的富集能力呈現(xiàn)降低-升高-降低的變化趨勢，莖富集系數(shù)在T3 處理時最低，為1.70，而在T4處理時最高，是T3 處理的2.48 倍。TS 處理組的變化趨勢與T 處理組大致相同，莖富集系數(shù)在TS6 處理時最低，為1.57，在TS1 處理時最高，其次是TS4 處理。除TS2處理外，所有處理地膚的轉運系數(shù)均大于1，且在T4~T6 和TS3~TS5 處理時，地膚對Cd 的轉運能力較強。對比不同pH 處理和相同土壤Cd 添加量下地膚莖部富集系數(shù)發(fā)現(xiàn)，除T6處理外，其余Cd處理下T處理組地膚莖部富集系數(shù)均高于對應的TS 處理組，且T4~T6 處理組地膚的轉運系數(shù)高于TS4~TS6 處理組。結合前文分析可知，地膚對pH 6.1 和Cd 含量范圍在2.0~10.0 mg·kg-1下的土壤富集能力較好，尤其對Cd含量為2.753 mg·kg-1（T4處理）下的土壤富集能力更佳。

圖2 Cd脅迫下地膚根系、莖的富集系數(shù)及轉運系數(shù)Figure 2 BCF and TF in the roots and stems of Kochia scoparia（L.）Schrad.under Cd stress

2.3 地膚根系與莖中Cd的亞細胞分布

圖3 （a）為Cd在地膚根系亞細胞組分中的分布情況。Cd 脅迫下，細胞壁組分中Cd 的占比顯著高于可溶性組分和細胞器組分。T處理組地膚細胞壁組分占比為56.65%~84.33%，TS處理組地膚細胞壁組分占比為68.76%~84.51%；其次是可溶性組分，T處理組地膚可溶性組分占比為11.54%~31.89%，TS 處理組為11.02%~23.47%；T 處理組地膚細胞器組分占比為2.40%~6.67%，TS 處理組為2.12%~4.26%。從細胞內(nèi)Cd的分布比例來看，隨著Cd添加量增加，T處理組地膚根系細胞器組分和可溶性組分中Cd占比均呈現(xiàn)增加-減少-增加-減少的變化趨勢，并在T3處理時達到最高，分別占比6.67%和31.89%，而細胞壁組分中的Cd占比隨Cd添加量的增加呈減少-增加-減少-增加的變化趨勢。TS處理組中，地膚根系細胞器組分和可溶性組分中Cd占比呈現(xiàn)先減后增的趨勢，其中TS1處理時占比最高，分別占比4.26%和23.47%，而細胞壁組分中Cd的占比隨Cd添加量增加呈先增后減的趨勢。

圖3 Cd在地膚根系和莖的亞細胞組分中的分布比例Figure 3 Distribution ratio of Cd in subcellular fractions of the roots and stems of Kochia scoparia（L.）Schrad.

圖3（b）為Cd在地膚莖部亞細胞組分中的分布情況。T和TS處理組地膚莖部亞細胞中的Cd含量分布與根部一致，為細胞壁組分>可溶性組分>細胞器組分。各組分中的分布比例隨Cd添加量的增加變化幅度較小，莖Cd主要貯存于細胞壁組分和可溶性組分，其分布比例分別為T 處理53.35%~72.12%、TS 處理46.26%~60.06% 和T 處 理19.23%~35.73%、TS 處 理29.12%~39.68%，而TS處理組細胞器組分占比比根系中略高，為4.73%~10.84%。可以看出，地膚根部細胞壁的固持作用和液泡的區(qū)隔化作用較強，使得根系中細胞器Cd含量較少，基本維持在2%~3%，而地膚莖部是主要受Cd 脅迫的器官，其細胞器組分Cd 含量在4%~11%之間。對比不同pH、相同Cd 添加量處理下莖部亞細胞Cd含量發(fā)現(xiàn)，T1~T5處理組莖部細胞壁組分和可溶性組分中Cd含量之和高于TS1~TS5處理組，可見在pH 6.1的土壤中，地膚對Cd的抵御能力更強。

2.4 地膚根系與莖中Cd的化學形態(tài)特征

圖4 （a）為地膚根中不同提取態(tài)Cd 含量分布特征，其中以移動性和毒性相對較低的醋酸提取態(tài)（FHAc）Cd 分配比例最大，T 處理為37.31%~56.24%，TS處理為40.98%~52.32%。隨著Cd 添加量增加，各處理組地膚根系中不同提取態(tài)Cd占比無明顯變化。地膚根系中Cd主要以醋酸提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)（FNaCl）和乙醇提取態(tài)（FE）為主，T 處理組三者占總提取態(tài)的82.96%~88.17%，其中醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)Cd分別占總提取態(tài)的37.31%~56.24% 和15.80%~27.68%，乙醇提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)（FHCl）、去離子水提取態(tài)（FW）所占比例分別為13.47%~24.01%、4.08%~5.53%和0.41%~1.89%，殘渣態(tài)（FR）占比最小，僅占總提取態(tài)的0.81%~1.39%，且各處理間變化不明顯；TS處理組三者占總提取態(tài)的83.70%~89.70%，其中醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)分別占總提取態(tài)的40.98%~52.32%和14.59%~21.04%，乙醇提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)、去離子水提取態(tài)所占比例分別為17.94%~25.89%、3.88%~7.97%和0.96%~1.22%，殘渣態(tài)占比最小，為0.63%~1.13%。

圖4 成熟期地膚根系與莖中各化學形態(tài)Cd分配比例Figure 4 Distribution ratios of Cd with different chemical forms in the roots and stems of Kochia scoparia（L.）Schrad.

圖4（b）為地膚莖中不同提取態(tài)Cd 含量分布特征，與根部情況一致，Cd 主要以醋酸提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)為主。氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)占比接近，殘渣態(tài)Cd含量最低。整體上看，莖中各化學形態(tài)Cd 含量比根部低。從所占比例來看，醋酸提取態(tài)所占比例最高（T 處理為33.20%~43.70%，TS 處理為30.39%~45.81%），氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)占比較為接近，T 處理組分別為23.25%~29.32%和21.99%~33.20%，TS 處理組分別為19.13%~32.00%和19.35%~45.02%，其次為鹽酸提取態(tài)、殘渣態(tài)和去離子水提取態(tài)，T處理組中占比分別為2.66%~5.99%、0.46%~1.16%和0.35%~0.83%，TS 處理組中分別為1.69%~5.20%、0.44%~1.16%和0.41%~0.92%?？梢?，地膚植株體內(nèi)的Cd 主要以醋酸提取態(tài)為主，說明Cd在地膚植株體內(nèi)主要以難溶于水的重金屬磷酸鹽形式存在。此外通過對比發(fā)現(xiàn)，TS1~TS4處理組的乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)所占比例高于T1~T4處理組，該兩種提取態(tài)的Cd 對植物細胞毒害最大，說明本研究地膚在pH 6.1、Cd添加量小于2.153 mg·kg-1的土壤中對Cd污染的抵御能力較好。

3 討論

3.1 Cd脅迫對地膚生長及其Cd含量的影響

重金屬脅迫直接反映在植物生長狀況和生物量的變化程度上。不同重金屬元素對植物生長影響有不同的閾值[26]，當環(huán)境中重金屬濃度超過閾值時，植物的生長發(fā)育就會受到抑制，表現(xiàn)為生長遲緩、植株矮小甚至死亡，進而影響到植物的生物量[27]。本試驗表明，在地膚成活率方面，所有處理組地膚在移植初期均能正常生長，到移植中期，48 盆供試材料中僅有T5和TS6處理各有1株死亡，成活率為98.6%；在病蟲害方面，除少部分地膚在移栽中期發(fā)生輕微蚜蟲危害外，未見其他病蟲害發(fā)生；在Cd 毒害癥狀方面，未發(fā)現(xiàn)明顯的外觀反應癥狀，如葉片斑點或枯黃、植株矮小等生長異?，F(xiàn)象。綜合表明，當重金屬Cd 進入地膚體內(nèi)之后，植株表現(xiàn)出較強的適應能力，生長過程未受到顯著抑制，未發(fā)生如其他植物受到重金屬毒害時所表現(xiàn)出的葉片褪綠、生長遲緩、植株矮小、產(chǎn)量下降甚至死亡等癥狀。由表2可知，Cd脅迫對地膚植株生物量產(chǎn)生了一定影響，說明地膚對不同程度Cd污染土壤具有不同的耐受性。在T處理組中，T6處理的地膚莖部生物量達到最高，比T1處理增加了51.79%；根系生物量在T5 處理時達到最高，為T1 處理的2.22 倍。這進一步說明在pH 6.1 和Cd 添加量為0~9.0 mg·kg-1的土壤中，地膚生長受Cd脅迫影響較小。在TS1、TS2及TS3處理下，地膚根系生物量分別與對應的T1、T2、T3處理相比均更大，但在TS4、TS5及TS6處理下，地膚根系生物量分別與對應的T4、T5 及T6 處理相比顯著降低，從而反映了在pH 5.0下低Cd含量處理（1.2~2.1 mg·kg-1）一定程度刺激了地膚根系的生長發(fā)育，但在高Cd 含量?（2.7~9.0 mg·kg-1）脅迫下，地膚根系作為主要的Cd 積累部位受到了顯著影響，說明高含量的Cd 在弱酸性土壤中對地膚根系具有抑制作用，該研究結果與張楊楊等[28]的結論一致。就此來看，同一植株不同器官對Cd脅迫響應結果不同的現(xiàn)象有待進一步研究。

植物應對重金屬脅迫通常采用排斥和積累兩種策略。就積累策略而言，一些植物大量富集Cd 離子后，將少量的Cd 儲存在根部，其余轉移到地上部分[29]。本研究發(fā)現(xiàn)地膚植株中的Cd 含量及積累量均表現(xiàn)為莖>根系，T和TS處理組的地膚莖部Cd積累量分別占植株總積累量的80.03%~86.67%和58.09%~89.35%，這與洋野黍、粗毛牛膝菊、珊瑚樹等植物對重金屬的積累分布規(guī)律[30-31]一致，可見地膚適用于南方酸性土壤的Cd 污染修復。劉歡[32]的研究結果表明，低濃度的低分子量有機酸能促進植物體內(nèi)的Cd從地下部向地上部轉移，因此地膚地上部Cd 含量大于地下部的原因可能與試驗土壤均呈弱酸性有關。Baker 等[33]將地上部Cd 富集量達到100 μg·g-1以上的植物稱為Cd 超積累植物。在已報道的超積累植物中[34]，天藍遏藍菜地上部Cd 含量為213 mg·kg-1，商陸地上部Cd 的最高富集量達482.25 mg·kg-1，寶山堇菜地上部Cd 含量高達1 168 mg·kg-1。與之相比，本研究對象地膚的Cd富集量最高未達到50 mg·kg-1，原因之一是本試驗設計的Cd脅迫量顯著低于上述報道的土壤背景值。富集系數(shù)可衡量植物從土壤/基質中富集重金屬的能力，也可以間接反映植物對重金屬的耐性[35]。富集系數(shù)越大，富集能力越強，越有利于植物修復。同時，轉運系數(shù)是用來指示重金屬從植物根系轉移到其他器官的能力的值，轉移系數(shù)越大表示重金屬運送能力越強，植物對重金屬的耐性也越強[36]。本研究中，T 和TS處理組（除TS2外）地膚的根和莖在不同添加量Cd脅迫下的富集系數(shù)均大于1，且根莖轉移系數(shù)也大于1，表明地膚在酸性土壤中對Cd有較強的富集能力。由此可見，地膚是一種較具潛力的土壤Cd污染修復植物。T6處理地膚根系和莖的富集系數(shù)相較T1 處理分別下降了60.96%和39.94%，TS6 處理地膚根系和莖的富集系數(shù)相較TS1 處理分別下降了43.12%和49.37%。Sun等[37]的研究也表明，低污染土壤中植物對重金屬的富集系數(shù)要高于嚴重污染的土壤，這可能是因為高濃度重金屬污染導致植物的生命活動受到抑制，造成植物富集能力降低。

需要說明的是，本研究為盆栽控制試驗，這在一定程度上與大田生產(chǎn)實際存在差異。盆栽過程限制了地膚根部的生長和拓展，相同種植條件下對比測定結果顯示，地膚盆栽植株根部生物量相比大田降低17%~22%，根部生物量的降低直接減少了植株對土壤Cd的積累和修復效果；從生長基質來看，本研究采用混合土壤作為栽培基質，與大田的全自然土壤存在差別，Cd在其中的賦存形態(tài)、生物有效性等均有一定差異，這些都是可導致地膚對Cd富集效率、修復效果等方面的不確定性的因素；此外，盆栽環(huán)境在一定程度上縮短了地膚的生長周期，據(jù)觀測，盆栽地膚的花果期相比田間開敞環(huán)境下提前了8~12 d，這直接造成了成熟期植株整株生物量和分蘗數(shù)量的下降，從而進一步影響了其修復效果。彭云霄等[38]比較了大田與盆栽條件下重金屬Cd賦存形態(tài)的差異，通過數(shù)據(jù)對比驗證了盆栽試驗的可行性。本研究采用人工模擬和人工控制方式完成，對地膚的生長習性、Cd 富集效率及土壤修復潛力均進行了較深入完備的探索，為后續(xù)研究奠定了較好的基礎。如何更精準地闡明地膚在不同生長環(huán)境中的修復表現(xiàn)并將本成果更好地應用于生產(chǎn)實際，是開展下一步工作的方向。

3.2 Cd在地膚亞細胞中的分布

重金屬被植物吸收后，會選擇性地分布在植物細胞的不同區(qū)域，以減輕重金屬的毒害作用。例如，植物對重金屬的耐受性表現(xiàn)在細胞壁的區(qū)室化固定作用，或以低毒、無毒的形式將其儲存在液泡中[39]。Cd在細胞中的區(qū)室化效應可極大地影響細胞中游離Cd的水平，從而影響Cd在植物中的活動[40]。因此，Cd在植物中的亞細胞分布被認為是影響其遷移、積累和植物耐受程度的重要因素，不同植物在Cd的吸收、積累和分布方面存在顯著差異[41]。本研究對象地膚根和莖細胞中Cd的分布均表現(xiàn)為細胞壁>可溶性組分>細胞器，表明細胞壁和可溶性組分是貯存Cd 的主要位點，這與唐敏等[42]的研究結果相一致。但也有研究認為植物體內(nèi)大部分Cd 儲存在細胞的可溶性組分（53.7%~68.3%）[43]，這種差異可能由土壤Cd含量不同以及植物對Cd的耐受機制不同所致。細胞壁可沉淀Cd2+，并可抑制其跨膜運輸以降低細胞器中的Cd并維持正常生理功能，從而保護原生質體免受Cd 毒害[44]。從細胞壁結構組成看，其主要由多糖（包括纖維素、半纖維素和果膠）和蛋白質組成，可提供大量官能團，包括羧基、羥基、氨基和醛基等[45]，這些基團可與Cd2+以配位鍵的方式結合，從而有效阻止Cd2+進入細胞。當細胞壁中的結合位點達到飽和時，Cd 即被轉運到液泡中，液泡中的細胞液是植物細胞重要的可溶性組分[46]。已有研究表明，細胞液中存在多種氨基酸、無機鹽、有機酸和有機堿[47]，Cd2+一旦進入細胞質基質，大部分即被轉運至液泡中，植物便可通過形成金屬螯合物來減少細胞質基質中游離Cd 的濃度以避免Cd脅迫[48]，從而極大地降低Cd 對細胞器結構和功能的損傷。由此可見，細胞壁固定和液泡區(qū)室化作用均是植物提高重金屬解毒和耐受性的重要機制[49]。

3.3 Cd在地膚植株體內(nèi)的化學形態(tài)特征

除亞細胞分布外，Cd 在植物體內(nèi)的毒性和遷移能力也與其化學形態(tài)緊密相關[50]。在Wang 等[51]的研究中，重金屬的生物有效性隨著提取劑極性的增加而下降，對植物的毒害作用也逐漸減弱，6 種化學形態(tài)的Cd 毒性大小順序為FE>FW>FNaCl>FHAc>FHCl>FR，以無機鹽態(tài)（FE，80%乙醇提?。┖退軕B(tài)（FW，去離子水提?。┵x存的金屬離子對植物細胞毒害最大；其次是果膠酸鹽態(tài)、蛋白結合態(tài)（FNaCl，NaCl 提?。┖碗y溶性磷酸鹽態(tài)（FHAc，2%醋酸提取）；草酸鹽態(tài)（FHCl，HCl 提取）的毒性最低。本研究中，地膚植物體內(nèi)Cd的主要賦存形態(tài)為醋酸提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)，氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)Cd 含量相近，這與Wang等[52]的研究結果一致。而在有些研究中[53-54]，植物體內(nèi)Cd 的主要賦存形態(tài)為1 mol·L-1NaCl、2%HAc和0.6 mol·L-1HCl 作為提取劑的提取態(tài)，這表明不同化學形態(tài)的Cd 在不同植物中的作用差異很大。目前，人們認識到難溶于水的重金屬磷酸鹽主要存在于細胞壁和液泡中[55]，而果膠酸鹽態(tài)、蛋白質結合態(tài)或吸附態(tài)的重金屬主要存在于液泡內(nèi)[56]。由此可知，Cd化學形態(tài)的分析結果與Cd 的亞細胞分布相關性顯著，即Cd 主要存在于地膚的細胞壁組分和可溶性組分中。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，地膚根部80%乙醇和去離子水的提取態(tài)Cd 在大部分處理中高于莖部，這兩種提取態(tài)的Cd 主要與細胞中硝酸鹽、氯化物為主的無機鹽、氨基酸鹽以及水溶性有機酸鹽相結合，具有較強流動性[57]。流動性強的Cd 在植物根和莖中分布比例較高將有利于Cd 通過共質體途徑運輸至地上部，這可能是地膚將更多的Cd 富集在莖中的一個重要原因。綜上所述，地膚根和莖中大量的Cd 以毒性較弱的醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)賦存是其降低Cd生物有效性、減少Cd毒害的一種重要防御機制。

4 結論

（1）地膚具有對不同Cd脅迫水平的耐性，且對酸性土壤有較強的適生性，適合用于南方酸性農(nóng)田土壤的修復治理。

（2）地膚根系和莖在不同水平Cd 脅迫下的富集系數(shù)和轉運系數(shù)均大于1，莖部是積累Cd 的主要器官。本試驗在1.5~9.0 mg·kg-1的Cd 添加量下，pH 6.1土壤中地膚的轉運系數(shù)高于pH 5.0的土壤，說明土壤基質的酸堿度直接影響地膚的修復效果。

（3）亞細胞水平上Cd 含量分布規(guī)律表現(xiàn)為細胞壁>可溶性組分>細胞器。地膚根部細胞器Cd所占比例比莖部低。在0~3.0 mg·kg-1的Cd 脅迫下，pH 6.1的土壤中，Cd 在地膚莖部細胞壁和可溶性組分中的占比高于pH 5.0的土壤。

（4）地膚植株中Cd 的主要賦存形態(tài)為醋酸提取態(tài)（FHAc）、氯化鈉提取態(tài)（FNaCl）和乙醇提取態(tài)（FE），表明地膚體內(nèi)的Cd 主要與磷酸鹽、果膠酸鹽、蛋白質及以硝酸鹽、氯化物為主的無機鹽等物質相結合，Cd 的這種賦存形態(tài)是地膚植株耐受Cd 污染的重要機制之一。