王冠華 鄒慧儒 連小麗 代曉華 顏 艷 張林樸

天津市口腔功能重建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市口腔醫(yī)院 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院 300041

牙髓根尖周病作為常見病、多發(fā)病,危害人類健康。傳統(tǒng)治療方法存在著許多的問題,因此需要尋找一種新的治療方法。牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體的作用在于能夠有效保持牙齒的健康,維持機(jī)體的正常功能。因此在臨床中探尋組織工程牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體是非常重要的,它能夠有效恢復(fù)牙齒的正常功能,因此組織工程化牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體是當(dāng)下國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱衷于研究的課題。 目前PLGA應(yīng)用于骨組織工程的研究很多。有人將PLGA納米復(fù)合材料用于成骨細(xì)胞也觀察到明顯的增殖和分化[1]。但很多研究所選取的種子細(xì)胞來源于動(dòng)物,而本研究選取的種子細(xì)胞是人牙髓細(xì)胞,這樣對(duì)于后期組織工程材料用于臨床更加具有評(píng)估價(jià)值。本文最后一個(gè)最重要的研究工作目的是探討如何實(shí)現(xiàn)將人牙髓細(xì)胞與可被植入的注射型牙支架材料聚乳酸二酐酯/聚二苯羥基二丙乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolic acid),構(gòu)建復(fù)合體后,通過掃描電鏡及免疫組織化學(xué)等方法進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)鑒定,同時(shí)監(jiān)測(cè)PLGA微球與牙髓細(xì)胞培養(yǎng)的狀況,從而通過研究獲得結(jié)論,明確微球的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本次研究通過了醫(yī)院的審批認(rèn)可,患者是自主參與到本次研究之中的,收集正畸或阻生拔除的新鮮健康前磨牙或第三磨牙,αMEM培養(yǎng)基(美國(guó),Gibico);胎牛血清(中國(guó),灝洋生物);胰蛋白酶(美國(guó),Sigma);牙本質(zhì)涎磷蛋白(英國(guó),Abcam);牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(英國(guó),Abcam);Ⅰ型膠原(英國(guó),Abcam);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó),Thermo);超凈工作臺(tái)(中國(guó),海爾);倒置顯微鏡(日本,Nikon);細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó),Corning);細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó),Corning);可調(diào)微量加樣槍(美國(guó),Gilson);正置顯微鏡(日本,Nikon);掃描電鏡(日本,捷歐路)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚乳酸/羥基乙酸共聚物微球的制備。在臨床展開探究分析時(shí)首先將濃度不同的NH4HCO3溶液(W1相)(1.25ml)分別加入濃度不同的PLGA有機(jī)溶液中(O相)(4ml),在4℃環(huán)境之下通過應(yīng)用勻漿機(jī)乳化得到初乳液(W1/O)。之后將勻漿所得初乳液倒入150ml 0.1%的PVA水溶液中(W2相),隨后通過攪拌機(jī)再次攪拌并獲得二次乳液(W1/O/W2),在此過程當(dāng)有機(jī)物揮發(fā)之后便得到了PLGA多孔微球,將PLGA微球應(yīng)用蒸餾水反復(fù)洗滌。應(yīng)用過量的2mol/L的乙二胺水溶液將PLGA微球重懸,在室溫環(huán)境之下攪拌半個(gè)小時(shí),將獲得的產(chǎn)物用蒸餾水進(jìn)行多次清洗,以便能夠徹底清除乙二胺溶液。隨后將獲得的微球浸泡在濃度為0.5%的膠原溶液中,放置在4℃環(huán)境下12h之后再用蒸餾水反復(fù)沖洗。最后將微球浸泡于含20%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液中,將其放置在4℃環(huán)境下12h并進(jìn)行分裝。

1.2.2 人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)及與三維材料的復(fù)合培養(yǎng)。本次研究通過了醫(yī)院的審批,且患者均為自主參與。收集正畸或阻生拔除的新鮮健康前磨牙或第三磨牙,隨后分離培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞,并將其放置在含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基內(nèi)7～10d,隨后通過顯微鏡觀察細(xì)胞狀況,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況定期換液觀察,原代細(xì)胞達(dá)到80%以上時(shí),通過使用0.25%胰蛋白酶特異性的作用于細(xì)胞并使細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。取第3～4代牙髓細(xì)胞展開特異性的實(shí)驗(yàn)并將其和PLGA微球共培養(yǎng),目的為能夠獲得組織工程化牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體。按照不同的濃度將牙髓細(xì)胞接種于PLGA微球表面,三組細(xì)胞的接種濃度依次分別為2×105細(xì)胞/ml、1×105細(xì)胞/ml、5×104細(xì)胞/ml。將微球材料與牙髓細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)8周,每隔2d更換培養(yǎng)液,同時(shí)要定期檢測(cè)其形態(tài)變化狀況。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色。牙髓細(xì)胞與PLGA支架材料復(fù)合培養(yǎng)8周后進(jìn)行免疫組化染色,石蠟切片脫蠟至水,首先應(yīng)用2%的雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,再應(yīng)用1g/L胰酶37℃消化30min,最后分別滴加1∶200稀釋的牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP),1∶200稀釋的牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(DMP-1)和1∶100稀釋的Ⅰ型膠原(COLⅠ)三種抗體對(duì)樣本進(jìn)行一抗的孵育,4℃孵育過夜。第2天滴加二抗繼續(xù)進(jìn)行孵育,37℃孵育30min。蘇木素染色后進(jìn)行脫水封片處理。并將正常牙齒切片作為陽性對(duì)照,PBS替代一抗孵育作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。所有經(jīng)過HE染色的切片都應(yīng)用正置顯微鏡進(jìn)行觀察并保留圖片。同時(shí)每個(gè)抗體選取一張圖片,每個(gè)圖片任意選取四個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)陽性率。

1.2.4 掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。牙髓細(xì)胞與微球材料共培養(yǎng)8周后終止培養(yǎng)。將細(xì)胞與生物材料構(gòu)建的復(fù)合物用4%戊二醛4℃固定后,經(jīng)過乙醇梯度脫水,冰凍干燥,真空噴金后,用JEOL-6700F掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 位相差倒置顯微鏡觀察結(jié)果 牙髓細(xì)胞與PLGA微球共培養(yǎng)2周后在顯微鏡下觀察牙髓細(xì)胞將微球材料捕獲形成三維立體結(jié)構(gòu),單純材料組有個(gè)別微球發(fā)生降解。共培養(yǎng)3周后,部分區(qū)域細(xì)胞向一側(cè)發(fā)生移動(dòng),牙髓細(xì)胞向材料方向生長(zhǎng)。共培養(yǎng)8周后細(xì)胞發(fā)生卷疊包繞材料生長(zhǎng),形成材料和細(xì)胞的復(fù)合結(jié)構(gòu),部分微球材料不再是球狀,材料周圍出現(xiàn)凹陷,有的材料形態(tài)發(fā)生改變,外形不規(guī)則,說明材料發(fā)生了進(jìn)一步降解。見圖1。

a b

2.2 電子顯微鏡下觀察結(jié)果 掃描電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞與微球材料共培養(yǎng)8周后,單純材料組微球材料形態(tài)發(fā)生改變,材料表面部分區(qū)域出現(xiàn)凹陷,球狀材料外形不再是圓形,發(fā)生了不規(guī)則的改變,以上的結(jié)果都顯示出材料可能已經(jīng)發(fā)生降解(見圖2a)。牙髓細(xì)胞與PLGA微球共培養(yǎng)組可見三維立體結(jié)構(gòu)的牙髓細(xì)胞-PLGA微球復(fù)合體形成,牙髓細(xì)胞形態(tài)良好,細(xì)胞與材料融合生長(zhǎng)(見圖2b)。

a b

2.3 免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色(HE)結(jié)果顯示牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(DMP-1)和Ⅰ型膠原(COLⅠ)三種抗體皆為陽性表達(dá),即細(xì)胞漿內(nèi)有很多棕黃色顆粒,說明細(xì)胞中有大量的上述三種蛋白能夠大量表達(dá)。同時(shí)正常牙本質(zhì)染色結(jié)果也為陽性表達(dá)。而空白對(duì)照組結(jié)果顯示上述三種抗體表達(dá)均為陰性。同時(shí)由于實(shí)驗(yàn)組根據(jù)細(xì)胞濃度分為三組,免疫組化結(jié)果顯示細(xì)胞播種濃度最高組較其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組染色陽性表達(dá)更加明顯。但統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示這兩個(gè)濃度組的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三個(gè)抗體相比較COLⅠ顯示的陽性結(jié)果稍弱,而DMP-1顯示的陽性結(jié)果最為明顯。而抗體相同、不同組別之間的臨床差異并不顯著,不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值。

3 討論

當(dāng)下許多國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者合成以PLA為主的共聚物,其中聚乳酸—羥基乙酸共聚物的作用較為突出,它有良好的生物降解性[2]。這種物質(zhì)在水解之后的產(chǎn)物為乳酸和羥基乙酸,最后能夠被人體代謝,因此它不僅對(duì)人體沒有毒性,而且長(zhǎng)期或者多次給藥都不會(huì)造成體內(nèi)沉積[3],有學(xué)者在研究后指出介孔分子篩SBA15/PLGA復(fù)合后的支架材料可以用于骨重建的應(yīng)用[4]。另外有人應(yīng)用MC-3T3細(xì)胞與材料共培養(yǎng)用來比較單純PLGA支架及PLGA與膠原混合的支架材料的特性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLGA與膠原混合的支架材料與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后具有更加明顯的生物學(xué)活性[5]。同時(shí)也有學(xué)者對(duì)復(fù)合加入膠原的PLGA材料進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)與單純細(xì)胞相比前者與細(xì)胞的黏附能力更強(qiáng)[6]。

本研究前期將PLGA微球和牙髓細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)并進(jìn)行了堿性磷酸酶及雙鏈DNA等量化檢測(cè),結(jié)果顯示1×105細(xì)胞/ml牙髓細(xì)胞接種于PLGA微球,細(xì)胞dsDNA含量及ALP活性水平較高。說明這個(gè)細(xì)胞的播種濃度更加適合細(xì)胞和微球材料增值結(jié)合,通過量化檢測(cè)初步證明了PLGA微球作為一種可注射支架材料,有利于牙髓細(xì)胞黏附生長(zhǎng)[7]。而本次研究將PLGA微球與牙髓細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程化牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體,并對(duì)組織工程化的復(fù)合體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察不同播種濃度組的細(xì)胞與微球材料復(fù)合培養(yǎng),初始階段均發(fā)生細(xì)胞沉降,細(xì)胞黏附于微球表面以及培養(yǎng)孔底壁。而隨著培養(yǎng)時(shí)間的逐步推移細(xì)胞和材料之間的連接度越來越高,說明了PLGA微球材料與細(xì)胞的相容性良好。

在牙本質(zhì)基質(zhì)的非膠原蛋白成分中,牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)是一種非膠原蛋白,牙本質(zhì)發(fā)育不全可能與DSPP基因突變有關(guān)。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(DMP-1)主要在成牙本質(zhì)細(xì)胞中特異性的表達(dá),其作用在于能夠特異性的促進(jìn)骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞成熟。COLⅠ在臨床中通常會(huì)被應(yīng)用于骨組織工程修復(fù),不僅如此其還是成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的一種標(biāo)志。因此這三種抗體都是牙本質(zhì)再生的標(biāo)志性抗體。有學(xué)者進(jìn)行牙髓組織工程研究中應(yīng)用PCR等方法對(duì)DSPP、DMP1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)[8]。也有國(guó)外學(xué)者在進(jìn)行牙髓細(xì)胞分化研究中對(duì)DSPP、DMP1等進(jìn)行定量檢測(cè),從而觀察牙髓細(xì)胞具體分化的情況[9]。另外有國(guó)外的研究人員將加入地塞米松的羥基磷灰石位于與牙髓細(xì)胞復(fù)合后通過檢測(cè)DSPP、DMP1等水平來觀察復(fù)合體的成牙本質(zhì)分化情況[10]。而本實(shí)驗(yàn)是通過免疫組化染色的方法對(duì)三種蛋白的表達(dá)進(jìn)行觀察的,結(jié)果比較直觀。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(DMP-1)和膠原Ⅰ(COLⅠ)三種抗體表達(dá)都為陽性,說明細(xì)胞和材料復(fù)合體中含有大量的上述三種蛋白,與陽性對(duì)照組的牙本質(zhì)區(qū)域上述三種抗體表達(dá)結(jié)果一致(正常對(duì)照為正常牙齒切片),充分說明了牙髓與PLGA微球構(gòu)建的復(fù)合物具有成牙本質(zhì)特性。另外,免疫組化結(jié)果顯示不同播種濃度的牙髓細(xì)胞與PLGA微球構(gòu)建的牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體免疫組化陽性結(jié)果程度不同,細(xì)胞播種濃度高的實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色結(jié)果陽性更加明顯。但計(jì)算陽性率結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能是由于這幾種蛋白都是分泌型蛋白,除了成功構(gòu)建的復(fù)合體含有上述這些蛋白以外,細(xì)胞外和材料中都有蛋白的分泌,因此免疫組化染色后觀察都有陽性反應(yīng),這在統(tǒng)計(jì)陽性率時(shí)有一定的影響,因此可能造成了對(duì)不同濃度的復(fù)合物陽性率統(tǒng)計(jì)時(shí)的誤差。雖然免疫組化結(jié)果不能確定隨著細(xì)胞濃度的增加這三種蛋白的表達(dá)會(huì)更加明顯,但目前的結(jié)果顯示三種蛋白的表達(dá)都有明顯的陽性結(jié)果,這樣依然可以說明PLGA微球材料適合人牙髓細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。而三個(gè)播種濃度組的免疫組化結(jié)果都顯示支架材料發(fā)生了降解。通過上述研究并結(jié)合前期研究中堿性磷酸酶和雙鏈DNA的檢測(cè)結(jié)果,充分說明了與PLGA微球復(fù)合后的牙髓細(xì)胞具有成牙本質(zhì)的特性,牙髓細(xì)胞與PLGA支架材料復(fù)合培養(yǎng)效果良好,在下一步工作中希望能對(duì)支架材料PLGA微球進(jìn)一步進(jìn)行改性,以便使其更加適合于組織工程化牙髓的構(gòu)建,因此PLGA微球材料作為牙髓組織工程的材料具有很大的應(yīng)用潛能。