黃紫艷 劉 揚 溫歡歡 吳輝淵

1 江西中醫(yī)藥大學研究生院,江西省南昌市 330000; 2 贛州市腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科; 3 江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腫瘤科

世衛(wèi)組織[1]預測2030年會有100多萬患者病死于肝癌。肝癌在中醫(yī)病屬“積聚”“黃疸”“鼓脹”[2]。肝藏血主疏泄,疏泄失司則氣行不暢,氣機不利則血水瘀滯,氣血失調(diào)則陰陽失和,正氣虧虛,邪毒熾盛,久而成積,發(fā)為肝癌。肝癌治療中放化療雖療效快但復發(fā)率高,對人體有損害。然而祖國醫(yī)學在扶正祛邪上有獨特優(yōu)勢,驅(qū)邪不傷正,正盛則邪退?！度数S直指方》記載用斑蝥治肝癌,功效為攻毒蝕瘡、驅(qū)散瘀結(jié),其活性成分斑蝥素毒性低,對骨髓抑制低[3],能升高白細胞。目前大多數(shù)化療藥僅有2%～5%的療效被腫瘤吸收[3],利用率不高,警示我們肝癌靶向給藥的重要性。

1 材料與方法

1.1 篩選靶點 ZINC數(shù)據(jù)庫檢索“Norcantharidin”,獲取Mol2格式化學結(jié)構(gòu)式,導入PharmMapper數(shù)據(jù)庫下載csv格式文件得到Uniprot ID。Pubchem 網(wǎng)站下載3D 化合物結(jié)構(gòu),獲得Canonical SMILES:C1CC2C3C(C1O2)C(=O)OC3=O將其輸入到SwissTargetPrediction。在Drugbank、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取肝癌靶點,在GeneCards獲得的靶點中選取相關(guān)度Score≥23.639的靶點作為潛在靶點,最終合并去重。

1.2 構(gòu)建NCTD-HCC靶點網(wǎng)絡圖 在STRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡圖探究彼此之間的作用關(guān)系。將交集靶點傳輸?shù)絊TRING中,種屬為“智人”,置信度為0.40,下載TSV格式的靶點文件上傳到CytoScape 3.7.1 軟件制作PPI網(wǎng)絡圖。利用插件MCODE獲取潛在蛋白質(zhì)功能模塊,進行功能分析。

1.3 通路富集分析 將交集基因?qū)隓avid進行GO和KEGG分析,GO分析包括分子功能、生物過程和細胞組成,闡釋核心靶點的抗肝癌生物進程;KEGG分析探究核心靶點的抗肝癌信號通路。將得到的核心靶點在CytoScape3.7.1中創(chuàng)建“成分—靶點—通路”網(wǎng)絡圖。

1.4 基因生存曲線分析 通過Kaplan Meier Plotter數(shù)據(jù)庫經(jīng)Logrank檢驗分析基因在肝癌的生存信息。

2 結(jié)果

2.1 NCTD治療HCC的靶點結(jié)果 PharmMapper得到299個NCTD靶點,Uniprot轉(zhuǎn)化并去重后為288個。經(jīng)SwissTargetPrediction分析可知靶點中最多的是磷酸酶(40%),其次是激酶(13.3%)、 G蛋白偶聯(lián)受體家族(13.3%)。在Drugbank得到43個肝癌靶點,OMIM數(shù)據(jù)庫經(jīng)去重合并獲得509個,GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到16 983個靶點,選取相關(guān)度Score≥23.639的靶點作為潛在靶點,合并去重篩出1 433個。將靶點上傳到韋恩圖在線繪制網(wǎng)站繪制韋恩圖得到101個交集靶點。

2.2 構(gòu)建成分—靶點—疾病網(wǎng)絡和分析PPI網(wǎng)絡結(jié)果 101個候選靶點網(wǎng)絡顯示101個節(jié)點、1 203條邊,度值越大節(jié)點越大,評分越高節(jié)點之間的緊密度越強連線越粗,ALB、AKT1、EGFR、HRAS、SRC、ESR1、CASP3、HSP90AA1、IGF1、MMP9、MAPK1度值排名靠前。ALB、AKT1、EGFR、SRC、HRAS、ESR1、IGF1、HSP90AA1交互關(guān)系最多(見圖1)。運用CytoScape 3.7.1的MCODE插件進行蛋白質(zhì)交互分析,提取出五個網(wǎng)絡,IGF1、SRC、HRAS、HSP90AA1、ESR1、EGFR、MAPK14、ALB、AKT1、PPARG、MAPK1的MCODE_Score排前列(見圖2)。

圖1 NCTD-肝癌靶點PPI圖

圖2 NCTD-肝癌靶點PPI圖中的Module

2.3 通路富集分析 David分析101個候選靶點。GO分析顯示共798個,包括細胞組成58個,分子功能103個,生物過程493個,KEGG富集共144條通路。生物過程主要有信號轉(zhuǎn)導、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄正負調(diào)控、凋亡負調(diào)控、蛋白磷酸化和自磷酸化、細胞增殖正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(見圖3)。

圖3 NCTD治療肝癌靶點富集分析

取通路前8名和通路上相關(guān)基因,利用CytoScape 3.7.1創(chuàng)建“NCTD、肝癌—靶標—通路”網(wǎng)絡(見圖4)。由69個節(jié)點207條邊構(gòu)成,連線表示互作關(guān)系。經(jīng)Network analyze功能分析后得出EGFR、AKT1、MAPK1、HRAS、MAP2K1、GRB2、PIK3R1、IGF1R、IGF1為重要靶點,與NCTD-HCC靶點PPI網(wǎng)絡圖結(jié)果大多吻合。每個靶點聯(lián)通多個通路,利用多靶點多通路防治肝癌,多集中于癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、癌中蛋白聚糖、MAPK信號通路、Ras信號通路、前列腺癌、化學致癌受體激活、肝細胞癌通路(見圖3)。

圖4 “NCTD、肝癌—靶標—通路”網(wǎng)絡圖

2.4 基因的生存分析 綜合前面結(jié)果得出IGF1、AKT1、HRAS、EGFR、MAPK1為核心基因,利用Kaplan-Meier Plotter繪制基因生存曲線,經(jīng)Logrank檢驗IGF1、HRAS、EGFR的P值<0.05,有統(tǒng)計學意義。

3 討論

《中藏經(jīng)》云 :“積聚、癥瘕、雜蟲者,皆五臟六腑……交合而成也。”為本虛標實,邪實大多與瘀毒相關(guān)。周仲瑛教授[4]秉持濕熱瘀毒是肝癌的主要病機,故應清熱利濕、祛瘀消癥解毒,緊抓瘀血。斑蝥為干燥昆蟲體,其破血消癥之力對肝癌有確切療效,藥理學亦證明其活性成分、衍生物能促進肝癌細胞凋亡、遏制擴散,增強免疫細胞活性[5]。斑蝥雖不能抑制HepG2細胞移植瘤[6]的生長,但能明顯延緩腫瘤生長且毒性小。

3.1 靶蛋白分析 NCTD靶蛋白中以磷酸酶和激酶類居多,兩者屬于反向作用,說明激活和失活對于信號傳導、蛋白調(diào)控都有重要意義。G蛋白偶聯(lián)受體也占前位在腫瘤中起關(guān)鍵作用[7]。經(jīng)一系列分析最終可得NCTD中IGF1、HRAS、EGFR、AKT1在肝癌中發(fā)揮重要作用。

IGF1是人體內(nèi)分泌激素,是IGF信號的一種,它通過與相應的特異受體結(jié)合,參與細胞分化、增殖和凋亡,影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[8],其水平高低與肝臟合成功能密切相關(guān)。Lacin Sahin等人[9]研究表明肝硬化和晚期肝癌患者的血清IGF-1濃度會下降。并且能通過介導PI3K/Akt信號通路加快腫瘤細胞增殖[10]。本次研究也證明了IGF1是NCTD治療肝癌的直接靶點。AKT1是蘇氨酸蛋白激酶之一,它從生長、存活、增殖、代謝到凋亡一直貫穿腫瘤細胞的全過程。錢宏梁等人[11]經(jīng)小鼠實驗得出真武湯通過降低AKT磷酸化蛋白表達和PI3K-AKT-mTOR通路遏制肝癌細胞生長。AKT作為PI3K途徑的中介,是形成腫瘤機制中常見的信號通路。本次去甲斑蝥素治療肝癌得出的關(guān)鍵通路中就有PI3K-Akt信號通路,更加凸顯了本次研究的價值性。Cancer Discovery[12]有報告得出:AKT1和AKT2的缺失會加快肝癌演變進程。HRAS屬于原癌基因RAS的一種,它可以激活PI3K-Akt通路,促進癌變。產(chǎn)生癌變[13]的關(guān)鍵原因是因為HRAS、KRAS和NRAS的突變導致RAS信號被激活。本次研究得出的關(guān)鍵基因中IGF1也可以激活PI3K-Akt通路,關(guān)鍵通路也有PI3K-Akt信號通路,更加證明他們產(chǎn)生的協(xié)同作用加速肝癌的演變進程。EGFR在肝癌中呈高表達,可與AR協(xié)同作用于肝癌,而NCTD靶點中同時也含有AR,故此也是筆者認為NCTD對肝癌具有開發(fā)和研究價值的原因之一,EGFR傳遞信號的重要蛋白,能使VEGF表達上調(diào)[14],加快細胞增殖、轉(zhuǎn)移。故在研制制劑和臨床治療中需要抑制肝癌患者的EGFR表達。MAPK是細胞傳導的重要傳遞者,能使其他大量蛋白質(zhì)磷酸化,加快蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)。其中MAPK8可將關(guān)鍵因子磷酸化細胞凋亡。DELIRE[15]發(fā)現(xiàn)MAPK在肝癌患者中異?；钴S。多項研究也表明阻斷MAPK可遏制肝癌HepG2細胞、SMMC-7721的增殖和侵襲[16]。

3.2 生物富集分析 GO生物進程集中于信號轉(zhuǎn)導、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄正負調(diào)控、凋亡負調(diào)控、蛋白磷酸化和自磷酸化、細胞增殖正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控。各種靶點、通路的連接離不開信號傳導和相關(guān)功能調(diào)控。NCTD的靶點大多為激酶和磷酸酶類,它們可將其他蛋白質(zhì)磷酸化,從而擾亂肝癌細胞的生物膜功能,遏制其生長。癌癥通路最有顯著意義,它涉及很多相關(guān)基因和調(diào)控機制,EGFR、IGF1、MAP2K1等都會作用于此通路上。NCTD可用于多種腫瘤,臨床常用于胃癌、乳腺癌等的治療,但也具有保護肝細胞的功能[17]。生存曲線分析IGF1、AKT1、HRAS、EGFR、MAPK1的P值分別為0.001 3、0.057、0.019、0.008 5、0.37,故IGF1、HRAS、EGFR是影響肝癌患者生存預后的重要因素。AKT1的P值為0.057,尚不能認為其對肝癌患者的預后具有直接相關(guān)性,但因為非常接近0.05故認為也有可能是數(shù)據(jù)庫納入的數(shù)據(jù)量大小導致。PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路都恰好有能激活本次得出的關(guān)鍵基因,并且這些通路經(jīng)上述分析證明與肝癌密切相關(guān),在癌癥通路中也會彼此相互連接影響,共同參與肝癌的演變過程。

本次利用反向分子對接、網(wǎng)絡藥理學的技術(shù)手段,認為NCTD主要通過蛋白磷酸化和IGF1、AKT1、HRAS、EGFR、MAPK1,主要作用于腫瘤通路,激發(fā)啟動因子干預肝癌。本次研究進一步驗證和豐富了NCTD治療肝癌的分子生物機制,為肝癌靶向治療提供思路,促進研制去甲斑蝥素相關(guān)靶向制劑,相對性減少使用放化療對患者造成的傷害。但因依據(jù)不同數(shù)據(jù)庫和平臺,故存在數(shù)據(jù)庫更新問題和數(shù)據(jù)差異,有一定的偏倚。