秦續(xù)元,周平平,宋 旸,杜珍武*,張桂珍,*

(1.長春腫瘤醫(yī)院基因檢測中心,吉林 長春130013;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科醫(yī)院,吉林 長春130041)

腫瘤新抗原(Tumor Neoantigen)又稱為腫瘤特異性抗原,該抗原只在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而在正常細(xì)胞內(nèi)不表達(dá),并能被人白細(xì)胞分化抗原(HLA)I類分子識別、結(jié)合并遞呈到腫瘤細(xì)胞表面,激活特異性T淋巴細(xì)胞,引發(fā)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)[1]。由于腫瘤患病個體異質(zhì)性導(dǎo)致腫瘤新抗原具有個體化特點,由此以腫瘤新抗原為靶點為腫瘤個體化免疫治療提供了科學(xué)性和可行性?；谛驴乖_發(fā)的抗腫瘤的RNA、肽疫苗以及樹突細(xì)胞疫苗已在黑色素瘤[2-3]、膠質(zhì)瘤[4]、乳腺癌[5]、肝癌[6]及前列腺癌[7]等的臨床應(yīng)用研究中顯示出良好的治療效果,提示腫瘤新抗原在腫瘤治療中具有的潛在應(yīng)用價值。

肺癌是我國發(fā)病率及死亡率居首位的惡性腫瘤。肺腺癌是肺癌中最為常見的病理分型[8],其分子突變譜不僅含有當(dāng)前靶向治療藥物治療的主要靶點[9],也具有較高的腫瘤特異性突變負(fù)荷[10-11],近期兩項基于腫瘤新抗原技術(shù)對于進(jìn)展期肺腺癌治療的臨床研究結(jié)果顯示了具有良好的治療效果,提示該技術(shù)在肺腺癌治療的應(yīng)用價值[12-13],這些研究結(jié)果將加速腫瘤新抗原在肺腺癌臨床治療的研究進(jìn)程。

目前,腫瘤新抗原的發(fā)現(xiàn)主要是采用全外顯子高通量測序篩選出腫瘤細(xì)胞特異性基因突變并結(jié)合其轉(zhuǎn)錄組測序中的基因表達(dá)水平,再通過免疫抗原數(shù)據(jù)庫預(yù)測與人類白細(xì)胞抗原(HLA) I類分子的親和力,具有高親和力的肽段體外負(fù)載樹突細(xì)胞,測定激活淋巴細(xì)胞的能力,評估新抗原肽段的免疫原性與抗腫瘤效果[14]。該過程雖然實現(xiàn)基于個體化的腫瘤免疫治療,但相比現(xiàn)有的免疫治療(特別是免疫檢測點及CAR-T細(xì)胞治療),在臨床應(yīng)用較為繁瑣、復(fù)雜以及昂貴的治療費用,將限制其在臨床應(yīng)用[15]。分析腫瘤新抗原在人群中的分布情況,發(fā)現(xiàn)腫瘤患者可能共有的新抗原,建立適用于不同人群腫瘤治療的新抗原庫,將有助于提升新抗原在抗腫瘤中的應(yīng)用。

本研究應(yīng)用在長春腫瘤醫(yī)院就診的肺腺癌患者的599個基因全外顯子測序結(jié)果,選擇腫瘤特異性基因突變產(chǎn)生的變異肽段序列,通過pVACtools軟件[16]預(yù)測變異肽段與HLA分型親和力。篩選出親和力分值大于1的肽段作為新抗原進(jìn)行分析,觀察這些新抗原在肺腺癌人群中的分布,并進(jìn)一步分析其與臨床病理特征和基因突變特征之間的關(guān)系,為肺腺癌患者的新抗原免疫治療研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

以2020年4月至2022年12月長春腫瘤醫(yī)院進(jìn)行治療的41例肺腺癌患者為研究對象。41例肺腺癌患者均進(jìn)行高通量基因測序用于指導(dǎo)肺癌的分子靶向治療。41例患者中位年齡為56歲(33-80歲);男性患者22例(53.7%),女性患者19例(46.3%);腫瘤分期：Ⅰ-Ⅱ期15例(36.5%),Ⅲ-Ⅳ期26例(64.5%);有轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)28例(68.3%),無轉(zhuǎn)移13例(31.7%)。

1.2 肺腺癌標(biāo)本的高通量測序數(shù)據(jù)獲取

41例肺腺癌患者的高通量基因測序結(jié)果作為本實驗分析的數(shù)據(jù)來源。檢測樣本包括腫瘤石蠟包埋組織(29例)與外周血液樣本(12例)。檢測的靶基因為599個基因的外顯子,檢測基因突變類型包括點突變、缺失、擴增與基因融合。檢測的儀器平臺為Illumina Novaseq 6000高通量測序平臺,平均測序深度為組織平均5000x(最低≥3000x),血液平均10000x(最低≥5000x對照平均 500(最低≥400x)?；驒z測委托金域檢驗公司完成。高通量測序結(jié)果包括基因突變情況以及靶向用藥指導(dǎo),預(yù)測腫瘤新抗原序列與腫瘤抗原突變總負(fù)荷(TMB)情況等。

1.3 新抗原預(yù)測

應(yīng)用pVACtools軟件對新抗原進(jìn)行預(yù)測,具體過程如下：經(jīng)過質(zhì)控合格的高通量測序的原始數(shù)據(jù),與人參考基因組進(jìn)行比對,獲取突變比例大于1%的體細(xì)胞突變;通過與HLA庫進(jìn)行比較,獲得HLA-A/B/C的基因型;利用VEP注釋,過濾掉無義突變和跟野生型蛋白相同的變異位點;利用pvacseq軟件將包含體細(xì)胞突變的多肽片段,分別切成8-11 bp的肽段,通過NetMHC、SMM、PickPocket等算法,分別預(yù)測與不同HLA分型的親和力,多肽的免疫原性等,輸出親和力超過野生型的多肽片段。對新抗原肽段進(jìn)行親和力進(jìn)行打分(新抗原親和力分值=原肽段親和力分值/新肽段親和力分值);選擇新抗原親和力分值大于1的新抗原進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.00(IBM Corp,USA)統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。預(yù)測腫瘤新抗原在人群中分布以及與臨床病理特征之間的關(guān)系根據(jù)數(shù)據(jù)變量不同分別采取卡方檢驗及t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 新抗原預(yù)測情況

通過對41例肺腺癌患者樣本的599個基因的全外顯子高通量測序結(jié)果進(jìn)行新抗原預(yù)測分析,結(jié)果顯示共有29例樣本(占總樣本數(shù)70.7%)預(yù)測具有新抗原,12例樣本(占總樣本數(shù)29.3%)未發(fā)現(xiàn)新抗原;在29例預(yù)測具有新抗原的樣本中,共預(yù)測出57個新抗原,其中1個新抗原13例(44.8%),2個新抗原10例(34.5%),3個新抗原2例(6.9%),4個新抗原2例(6.9%),5個新抗原2例(6.9%)。

2.2 不同樣本類型高通量測序結(jié)果預(yù)測新抗原情況

29例石蠟組織樣本高通量測序結(jié)果預(yù)測具有新抗原21例(占72.4%),12例外周血樣本高通量測序結(jié)果預(yù)測具有新抗原8例(66.7%),二者在新抗原預(yù)測檢出率上相比無顯著差異。29例樣本共預(yù)測出57個新抗原,其中組織樣本預(yù)測出新抗原45個(2.14個新抗原/例),外周血樣本檢測出新抗原12個(1.5個新抗原/例)。

2.3 預(yù)測新抗原的基因分布及HLA分型情況

本研究預(yù)測57個腫瘤新抗原親和力打分分值范圍1.01-1380.384,分值越高則該新抗原與對應(yīng)的HLA親和力越高,能夠被遞呈到細(xì)胞表面,與T淋巴細(xì)胞TCR結(jié)合能力越強。表1按照分值列出前10個打分最高的患者及相關(guān)肽段。這些新抗原來源于47個基因,其中含有預(yù)測新抗原數(shù)目前5的基因為表皮生長因子受體(EGFR)基因(7個新抗原),絲氨酸/蘇氨酸激酶3(AKT3)(3個新抗原),kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(KEAP1)(3個新抗原),鈣調(diào)蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶2B(KMT2B )(3個新抗原),絲氨酸/蘇氨酸激酶11(STK11)(3個新抗原)。與57個新抗原結(jié)合的HLA-I類分子共有19種分型,其中HLA-A*02：01分型最多,其次為HLA-A*02：06型。

表1 預(yù)測與HLA I類分子親和力分值前10新抗原

2.4 新抗原與基因突變類型分析

41例肺腺癌患者的599個基因的全外顯子高通量測序結(jié)果共檢測出306個非同義突變,其中包括260個點突變(85%),15個基因刪除突變(5%),12個基因擴增突變(4%),8個刪除插入突變(3%),7個基因重復(fù)突變(2%),2個基因插入突變(1%),1個基因跳躍突變(0.5%),1個基因融合突變(0.5%);檢出的所有突變中,共計260個單核苷酸變異;在所有的306個基因突變中,預(yù)測具有新抗原突變?yōu)?7個(占18.6%),檢出的57個新抗原中基因點突變53個(占93.0%),重復(fù)突變2個(占3.5%),刪除突變2個(占3.5%)。

基因突變數(shù)與預(yù)測新抗原數(shù)目存在相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.512,P值<0.05);點突變數(shù)與新抗原產(chǎn)生存在相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.476,P值=0.002)。

2.5 預(yù)測新抗原與臨床病理類型相關(guān)性分析

腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)率在不同性別的腫瘤患者之間沒有差異,腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)率在有轉(zhuǎn)移的腫瘤患者(78.6%)明顯高于沒有轉(zhuǎn)移的患者(46.2%),在臨床分期上,處于Ⅲ-Ⅳ期的腫瘤患者的腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)率(80.8%)明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者(42.9%),(P=0.029),有新抗原的患者腫瘤突變總負(fù)荷(TMB)明顯高于無新抗抗原的患者(P=0.022),見表2。

表2 預(yù)測新抗原與臨床病理學(xué)特征關(guān)系

3 討論

腫瘤新抗原作為疫苗刺激免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)已逐漸成為新型腫瘤免疫療法研究的熱點[17]。高通量基因測序技術(shù)和生物信息學(xué)算法的快速進(jìn)展,為腫瘤新抗原的分子鑒定提供了必要的支持。本研究應(yīng)用41例肺腺癌患者高通量測序結(jié)果進(jìn)行腫瘤新抗原的預(yù)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)29例(70.7%)肺腺癌樣本可預(yù)測具有新抗原,最多預(yù)測為5個新抗原。由于本研究基于599個基因外顯子測序結(jié)果進(jìn)行的新抗原預(yù)測,其預(yù)測出新抗原的效率與數(shù)量低于基于腫瘤組織全外顯子測序的基因結(jié)果進(jìn)行的新抗原預(yù)測的研究[18]。

基于高通量測序進(jìn)行腫瘤新抗原預(yù)測的基因突變信息主要來源于腫瘤組織樣本包括手術(shù)切腫瘤組織、穿刺腫瘤組織以及胸腹水脫落腫瘤細(xì)胞等,而來源于循環(huán)腫瘤DNA的還未見研究報道。在本研究中用于腫瘤新抗原預(yù)測分析的腫瘤細(xì)胞基因突變信息不僅來源于腫瘤組織樣本,也來自外周血循環(huán)腫瘤DNA的樣本。預(yù)測結(jié)果表明腫瘤組織樣本與外周血樣本檢出基因突變均可預(yù)測出腫瘤新抗原,預(yù)測率二者并無差異,說明通過腫瘤患者外周血DNA分析,也能發(fā)現(xiàn)腫瘤新抗原,為無法獲取腫瘤組織患者選擇外周血進(jìn)行新抗原的預(yù)測提供了理論依據(jù)。DNA突變負(fù)荷的動態(tài)變化的可檢測性[19],也為實時實施以個體腫瘤新抗原為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療提供可能。

當(dāng)前腫瘤新抗原預(yù)測是基于突變的肽段被HLA-I類分子識別與結(jié)合能力,結(jié)合分?jǐn)?shù)越高,該肽段被遞呈到腫瘤細(xì)胞的表面機會越大[20]。由于識別不同肽段的HLA-I類分子不同以及個體HLA-I類分型不同,使具有同一腫瘤類型腫瘤組織的患者預(yù)測新抗原具有差異性。本研究預(yù)測57個腫瘤新抗原親和力打分分值范圍從1.01到1380.384,與57個新抗原結(jié)合的HLA-I類分子共有19種分型,其中HLA-A*02：01分型最多,其次為HLA-A*02：06型。HLA分型決定新抗原與TCR受體結(jié)合的親和力情況,從而影響新抗原疫苗的療效。Tran E等報道[21]的一位患者,經(jīng)過新抗原附載的DC疫苗治療后,三處病灶均減小或消失,但一處病灶出現(xiàn)了免疫超進(jìn)展,在對次病灶進(jìn)行HLAI 類分子表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn),該患者的HLA I類分子表達(dá)缺失,導(dǎo)致新抗原無法被正常遞呈到細(xì)胞表面。因此腫瘤組織細(xì)胞HLA-I類分子表達(dá)檢測在實施腫瘤新抗原治療過程中是十分必要的。

通過腫瘤新抗原的預(yù)測分析將會明確每個新抗原的基因突變信息、突變肽段的氨基酸信息以及相結(jié)合的HLA-I分子的分型。一旦在體內(nèi)外實驗證明應(yīng)用這些新抗原進(jìn)行腫瘤治療的有效性,對于具有同樣新抗原以及HLA-I分型的其他患者將或從中受益。一項研究對國際癌癥基因組協(xié)會數(shù)據(jù)庫的9155個癌癥樣本體細(xì)胞突變進(jìn)行新抗原預(yù)測[22],發(fā)現(xiàn)65個常見腫瘤驅(qū)動基因存在新抗原,其中最多的新抗原相關(guān)基因是KRAS(G12D和G12V)。研究發(fā)現(xiàn)K-RAS基因第二外顯子G12D突變所在9-10個肽段可作新抗原,與HLA-C*08：02具有高親和性。應(yīng)用該抗原肽分別對具有同樣K-RAS基因突變以及HLA-I分型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者及胰腺癌患者進(jìn)行治療研,結(jié)果顯示據(jù)具有良好的治療效果[21,23]。本研究預(yù)測新抗原數(shù)目最多為表皮生長因子受體(EGFR)基因(7個新抗原),突變位點集中于L858R、C797S、G719S、L747_P753delinsS。該研究結(jié)果為以EGFR突變預(yù)測存在新抗原進(jìn)行肺腺癌免疫治療研究提供前期科研信息。

本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生新抗原的基因突變類型主要是點突變產(chǎn)生,這與Duksza等的研究新抗原產(chǎn)生基因突變類型相同[24],在新抗原預(yù)測結(jié)果與臨床病理分析上發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移及Ⅲ-Ⅳ期患者的腫瘤組織或外周血基因檢測獲取的新抗原預(yù)測陽性率明顯增高,說明隨著腫瘤進(jìn)展,腫瘤基因突變頻率增多,帶來腫瘤新抗原增多。

免疫檢查點抑制(ICI)已成為近10年癌癥免疫治療的主要方法[25],高TMB被作為評價ICIs療效的重要生物標(biāo)志物[26]。研究表明[27]腫瘤特異性突變會產(chǎn)生新抗原,介導(dǎo)對ICIs的應(yīng)答,故推測高TMB會導(dǎo)致更多的新抗原產(chǎn)生,增加腫瘤免疫原性,提高腫瘤對ICIs的反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)測出具有新抗原的患者TMB明顯高于沒有預(yù)測出新抗原的患者。一項臨床試驗表明[28],新抗原疫苗與PD-1抑制劑結(jié)合,用于高TMB的轉(zhuǎn)移患者具有較高的可行性和安全性。

總之,本研究應(yīng)用肺腺癌患者的高通量基因測序結(jié)果,探討了肺腺癌患者預(yù)測產(chǎn)生新抗原情況,觀察這些新抗原在肺腺癌人群分布,分析其與臨床病理特征和基因突變特征的關(guān)系,為肺腺癌患者的新抗原免疫治療研究提供實驗基礎(chǔ)。