胡 玲,倪世磊,詹駱寧,劉曉莉,謝曉昱,李 毅*

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院,吉林 長春130021;2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室,吉林 長春130021)

牙髓再生是利用組織工程學(xué)原理使種子細(xì)胞在支架材料上擴增生長成為類似牙髓的新生組織,恢復(fù)正常的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能。殼聚糖(chitosan,CS)作為組織工程研究中常用的支架材料之一,是一類由幾丁質(zhì)脫乙酰化處理獲得的線性陽離子多糖,由于具有合適的機械性能、良好的生物相容性、降解性、廣譜抗菌性等眾多生物學(xué)特性,近年來在組織工程再生領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本文針對殼聚糖的生物學(xué)特性,結(jié)合其目前在牙髓再生領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 殼聚糖的一般特性

1.1 殼聚糖的結(jié)構(gòu)

殼聚糖是天然大分子中含量最豐富的多糖之一,存在于節(jié)肢動物的外骨骼或真菌和酵母的細(xì)胞壁中,是由D-氨基葡萄糖和N-乙?；?D-氨基葡萄糖通過β-(1,4)-糖苷鍵組成的共聚物。分子量和脫乙酰度(degree of deacetylation,DD)對殼聚糖的理化性質(zhì)及生物學(xué)特性起到?jīng)Q定性作用。一般來說,殼聚糖的DD越高,分子鏈中氨基的質(zhì)子化程度越高,水溶性及生物學(xué)效應(yīng)越高。殼聚糖的分子量與聚合物鏈的構(gòu)型相關(guān),低分子量殼聚糖的聚合物鏈通常呈松弛、近似線性的鏈,暴露出較多的氨基;分子量增加主鏈原子超過600個時,聚合物鏈開始盤繞,氨基基團被包裹在聚合物內(nèi),氨基質(zhì)子化程度降低,因此低分子量的殼聚糖表現(xiàn)出更強的水溶性和生物活性[1]。

1.2 殼聚糖的生物相容性

殼聚糖具有良好的生物相容性,可促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖,這是殼聚糖在組織再生領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用的主要原因之一。殼聚糖對人牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)無明顯細(xì)胞毒性,將多孔殼聚糖支架與DPSCs 共同培養(yǎng)時DPSCs表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖活性[2]。但這種促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用機制在不同細(xì)胞中可能存在不同。研究表明,殼聚糖處理的間充質(zhì)干細(xì)胞中,細(xì)胞數(shù)量及TLR2和TLR4的表達(dá)較空白組明顯增強,這說明殼聚糖可通過Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖[3]。而將殼聚糖與角膜上皮細(xì)胞(RCECs)共培養(yǎng)的實驗則發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理的RCECs數(shù)量和p-ERK1/2表達(dá)水平顯著提高,使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理RCECs則這種改變消失,證明殼聚糖可激活ERK信號通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖[4]。

1.3 殼聚糖的降解性

牙髓重建是一個需要時間的復(fù)雜過程,支架的降解對牙髓組織生長和基質(zhì)沉積產(chǎn)生重要影響。殼聚糖在體內(nèi)降解所需的主要酶之一是溶菌酶,該酶通過水解乙?；鶊F來降解殼聚糖[5]。高DD和低分子量的殼聚糖乙?；鶊F較少,降解速率快。研究表明,對殼聚糖進(jìn)行改性及修飾或可調(diào)節(jié)殼聚糖的降解速率,Navidi等[5]在殼聚糖支架中添加SAPO-34、CaO和Fe2O3納米粒子,使溶菌酶作用于乙?；鶊F的難度增加,72小時內(nèi)支架的降解率從23%降低至16%;畢博等[6]用不同濃度的還原氧化石墨烯(rGO)修飾殼聚糖支架,在相同降解時間時,復(fù)合支架的降解率隨著rGO含量的增加而逐漸下降。牙髓再生需要支架材料在合適的時間內(nèi)降解,通過對殼聚糖的改性修飾可使支架降解速率與牙髓組織重建時間相適配。

1.4 殼聚糖的機械性能

機械性能是支架材料的重要性能之一,支架應(yīng)提供組織起源的剛度,機械強度允許通過外科手術(shù)植入。殼聚糖支架機械強度較低,據(jù)報道,DD高于60%的殼聚糖的拉伸強度為250～400 g/mm2,未交聯(lián)殼聚糖支架的彈性模量為3.8 kPa,交聯(lián)后彈性模量提高到7.4～19.9 kPa[7]。在牙髓再生中,材料彈性模量低易引起支架收縮可能會導(dǎo)致細(xì)胞與牙本質(zhì)壁間的空隙對新組織的形成產(chǎn)生不利影響[8],機械強度高的材料具有優(yōu)異的機械穩(wěn)定性,更利于牙髓干細(xì)胞分化和牙本質(zhì)樣組織的形成[9]。因此,提高殼聚糖支架的機械性能有利于牙髓組織再生的過程。目前提高殼聚糖支架機械性能的主要方法是將殼聚糖與其他材料復(fù)合使用,將10%的生物活性玻璃加入殼聚糖支架,殼聚糖的抗壓強度從34 kPa提高到363 kPa,壓縮模量從0.41 MPa提高到10.04 MPa[10];而向殼聚糖支架中加入0.5%還原氧化石墨烯后,支架的彈性模量由(1.10±0.14)MPa上升到(1.87±0.25) MPa,同時支架的吸水率提高[6]。

2 殼聚糖的抗菌作用

控制根管內(nèi)感染是牙髓再生的關(guān)鍵之一,確保根管內(nèi)的無菌環(huán)境對牙髓組織再生極其重要[11]。殼聚糖具有廣譜抗菌性能,對細(xì)菌和真菌均有抑制作用。研究表明,殼聚糖對持續(xù)性牙髓感染中常見的糞腸球菌(細(xì)菌)和白色念珠菌(真菌)的浮游形態(tài)和生物膜均產(chǎn)生抑制效果,可降低培養(yǎng)液中游離微生物數(shù)量,抑制生物膜中微生物的代謝活性、延緩生物膜的形成[12-13]。改性的殼聚糖在抗菌方面可能起到更好的作用,Thienngern等[14]將殼聚糖與聚乙二醇或丙二醇共混進(jìn)行物理改性,增加了殼聚糖的流動性,對牙本質(zhì)小管的滲透增強從而使殼聚糖更好的與定植到牙本質(zhì)小管內(nèi)的微生物作用;將殼聚糖與Ag、Au、Zn、Cu等具有抗菌活性的金屬粒子復(fù)合改性,對多種革蘭陰性菌和革蘭陽性菌發(fā)揮協(xié)同增效抗菌作用[15];Han等[16]對殼聚糖甲基化和磺化修飾得到電離殼聚糖(ICS),增加了殼聚糖氨基上的正電荷密度,能更好地吸附在微生物表面發(fā)揮抗菌作用。殼聚糖的陽離子特性增強導(dǎo)致抗菌性增加,說明殼聚糖的抗菌機制可能是通過氨基上的正電荷與細(xì)菌表面的負(fù)電荷相互作用,導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的變化誘導(dǎo)細(xì)菌破裂死亡。另一報道指出,綠原酸接枝殼聚糖能降低金黃色葡萄球菌中ATP酶和過氧化氫酶的活性,影響細(xì)菌的抗氧化系統(tǒng)和能量代謝;同時破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并與遺傳物質(zhì)DNA結(jié)合,影響金黃色葡萄球菌的活性,說明殼聚糖的抗菌機制還可能與影響細(xì)菌代謝和破壞細(xì)菌遺傳物質(zhì)相關(guān)[17]。

3 殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞分化作用

牙髓再生主要包括牙本質(zhì)形成、牙髓血運重建和神經(jīng)再支配,通過干細(xì)胞牙源性分化、血管內(nèi)皮分化及神經(jīng)分化可實現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)的組織再生。殼聚糖支架具有誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的能力,細(xì)胞在三維支架上沿著多孔結(jié)構(gòu)立體生長,胞體拉伸、細(xì)胞骨架發(fā)生形變,這種形變產(chǎn)生力學(xué)刺激作用于細(xì)胞膜上的相關(guān)蛋白并傳遞到細(xì)胞內(nèi)部,激活下游一系列信號通路,如MAPK通路、β-catenin通路等,從而影響細(xì)胞分化[18]。

3.1 殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞牙源性分化

研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖可促進(jìn)DPSCs成牙分化,Porrelli等[19]將乳糖改性的殼聚糖(CTL)均勻涂覆在支架多孔結(jié)構(gòu)表面研究其對DPSCs成牙分化的作用,發(fā)現(xiàn)CTL能促進(jìn)DPSCs堿性磷酸酶的表達(dá),并使礦物質(zhì)沉積增加,證明CTL在促進(jìn)DPSCs牙源性分化中具有一定作用。殼聚糖還可促進(jìn)脫落乳牙干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHEDs)成牙分化,在Subhi等[20]的實驗中發(fā)現(xiàn)殼聚糖加入到水門汀內(nèi)后SHEDs的牙源性分化標(biāo)志物表達(dá)水平較加入前升高并具有統(tǒng)計學(xué)意義,證明殼聚糖的加入促進(jìn)了SHED的成牙本質(zhì)向分化。體內(nèi)研究同樣證明殼聚糖促進(jìn)干細(xì)胞成牙分化的效果,Ashry等[21]在狗蓋髓模型中將殼聚糖與MTA作為蓋髓劑,檢測到添加殼聚糖的MTA組樣品中DSPP的mRNA表達(dá)水平較僅使用MTA組顯著提高,進(jìn)而說明殼聚糖促進(jìn)DPSCs牙源性分化的能力。然而目前殼聚糖促進(jìn)干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化的機制尚不清楚。

3.2 殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞血管內(nèi)皮分化

牙髓活力依賴于血運重建,殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、促進(jìn)新血管形成的能力為牙髓血運重建提供理論基礎(chǔ)。殼聚糖可促進(jìn)不同來源的MSCs血管內(nèi)皮分化。羅鳴驁等[22]為研究殼聚糖對脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)存活與分化的影響,將ADSCs加載到殼聚糖支架注射到小鼠背部皮下,殼聚糖促進(jìn)了ADSCs血管內(nèi)皮分化和血管的形成,可能原因是支架提供的良好細(xì)胞生長微環(huán)境促進(jìn)了這種分化。另一項實驗證明殼聚糖還可以增加人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞血管內(nèi)皮分化標(biāo)志物VEGF的表達(dá),實現(xiàn)血管內(nèi)皮分化[23]。目前,殼聚糖促進(jìn)干細(xì)胞血管內(nèi)皮分化的機制有待進(jìn)一步研究。

3.3 殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化

牙髓內(nèi)神經(jīng)可感受外界刺激,調(diào)節(jié)髓內(nèi)血管的收縮和舒張,維護牙髓的穩(wěn)態(tài)。殼聚糖促進(jìn)DPSCs神經(jīng)分化是實現(xiàn)新生牙髓神經(jīng)再支配的重要途徑。據(jù)報道,殼聚糖可能通過不同機制促進(jìn)DPSCs神經(jīng)分化。Zhang等[24]在探究殼聚糖對DPSCs神經(jīng)分化的影響時,將殼聚糖支架與DPSCs在體外共同培養(yǎng),蛋白質(zhì)印跡分析和PCR檢測結(jié)果顯示殼聚糖組DPSCs的神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物CNPase、MAP-2和GFAP的表達(dá)較對照組顯著增高,證明殼聚糖具有誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)分化的能力,這種作用可能與殼聚糖激活Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)。Zheng等[25]在摸索體外DPSCs神經(jīng)分化的條件時,合成多孔殼聚糖支架接種DPSCs后細(xì)胞中神經(jīng)分化標(biāo)志物表達(dá)比空白組增加,說明殼聚糖可促進(jìn)DPSCs的神經(jīng)分化,進(jìn)一步研究表明殼聚糖誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)源性可能與ERK信號通路的激活相關(guān)。

4 殼聚糖的促進(jìn)礦化作用

牙髓再生的內(nèi)容之一是牙本質(zhì)的新生,主要是成牙本質(zhì)細(xì)胞礦物質(zhì)沉積的過程。殼聚糖具有抑制硬組織脫礦和促進(jìn)礦化的性能,在微環(huán)境中可與H+結(jié)合提高溶液pH值,也能通過靜電作用吸附到牙齒表面形成保護層達(dá)到抑制脫礦的作用[26];殼聚糖含氮量高的特點使其可攜帶鈣和磷酸鹽等礦化離子,同時殼聚糖能穿透牙釉質(zhì)向病變深層輸送再礦化離子,促進(jìn)再礦化過程[27]。Subhi等[20]向硅酸鈣基水門汀內(nèi)添加殼聚糖后與SHEDs共同培養(yǎng),隨著殼聚糖濃度的升高和孵育時間的延長,SHEDs細(xì)胞中鈣沉積量逐漸增加,證明了殼聚糖促進(jìn)礦化的能力。Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)CMC在人工齲齒影響牙本質(zhì)模型中可穩(wěn)定無定形磷酸鈣,促進(jìn)礦物在牙本質(zhì)I型膠原蛋白纖維內(nèi)部沿著膠原纖維長軸定向排列,無CMC組則形成纖維外礦化,說明殼聚糖可誘導(dǎo)牙本質(zhì)仿生礦化,相較于無序礦化具有更優(yōu)異的生物學(xué)和機械力學(xué)性能。另一項研究中發(fā)現(xiàn)[29],CMC不僅能夠誘導(dǎo)脫礦牙本質(zhì)仿生礦化,還能提高人工牙本質(zhì)齲損的粘接性能。

5 殼聚支架在牙髓再生領(lǐng)域應(yīng)用現(xiàn)狀

目前的研究表明,能夠攜帶干細(xì)胞并輸送生長因子的可生物降解的3D植入式或可注射支架是牙髓再生的最合適方法,殼聚糖基復(fù)合支架應(yīng)用于牙髓再生表現(xiàn)出不錯的效果。Bordini等[30]將殼聚糖與氫氧化鈣和β甘油磷酸鹽(βGP)復(fù)合制成多孔殼聚糖支架,具有良好的圓形孔隙網(wǎng)絡(luò),這種支架促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖,對遠(yuǎn)處牙髓細(xì)胞具有趨化作用,即使在沒有成骨培養(yǎng)基補充的情況下也能誘導(dǎo)牙母細(xì)胞成牙分化,同時刺激礦化基質(zhì)沉積,促進(jìn)牙本質(zhì)形成。Moreira等[31]去除大鼠第一磨牙根管內(nèi)側(cè)牙髓建立體內(nèi)原位牙髓模型,向根管內(nèi)注射血凝塊-殼聚糖水凝膠混合支架并使用5 J/cm2的能量密度進(jìn)行光生物療法(PBMT),在4周時觀察到根管內(nèi)發(fā)育良好的牙髓樣組織,新生結(jié)締組織內(nèi)含年輕的血管、沿根管壁存在新生牙本質(zhì),且根管內(nèi)未檢測到炎癥、未見根管內(nèi)部/外部吸收;其中一個樣本甚至觀察到一層與牙本質(zhì)壁緊密接觸、胞質(zhì)延伸穿透牙本質(zhì)小管的細(xì)胞,這層細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物HSP-25陽性表達(dá),表明血凝塊-殼聚糖水凝膠混合支架在PBMT存在情況下可能形成與天然結(jié)構(gòu)相似的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。Ei等[32]將攜帶自體DPSCs和生長因子的殼聚糖水凝膠支架移植到犬根尖周炎的年輕恒切牙中,根管內(nèi)出現(xiàn)類似牙髓組織的纖維組織,內(nèi)含多條大小血管,還出現(xiàn)牙本質(zhì)樣組織,沿著根管壁的牙本質(zhì)具有牙本質(zhì)小管樣結(jié)構(gòu),證明攜帶干細(xì)胞并輸送生長因子的殼聚糖水凝膠支架在牙髓再生領(lǐng)域具有巨大的潛力。

6 展望

殼聚糖作為天然高分子材料,價格低廉、性能優(yōu)異,不僅可作為支架材料發(fā)揮抗菌作用為牙髓再生提供無菌環(huán)境,誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、促進(jìn)礦化保證牙髓組織工程中不同結(jié)構(gòu)組織的形成,同時也可單獨或與其他材料復(fù)合作為物質(zhì)載體攜帶生物活性分子,協(xié)同促進(jìn)牙髓組織再生。然而,目前關(guān)于殼聚糖促進(jìn)牙髓再生的研究尚有不足：(1)殼聚糖基材料促進(jìn)形成的新生牙髓的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能未與天然牙髓進(jìn)行對比,無法得知再生的牙髓樣組織與天然牙髓的差異;(2)目前研究停留在實驗室水平,臨床療效尚未可知;(3)殼聚糖在牙髓再生中發(fā)揮作用的機制仍需進(jìn)一步研究。