蔡遠(yuǎn)東 薛朝金 李天佑 何羽

【摘 要】 目的：高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定狗頭赤芍中沒(méi)食子酸和芍藥苷的含量，為狗頭赤芍質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。方法：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：線性和范圍分別為，沒(méi)食子酸：Y=22472X+2118.9，r=0.9999（n=5），在4.237～33.884 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；芍藥苷：Y=13583X-12485，r=0.9999（n=5）在5.197～41.578 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。沒(méi)食子酸的平均回收率為99.58%，RSD為1.17%；芍藥苷的平均回收率為99.84%，RSD為0.45%。結(jié)論：建立的方法簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性良好、準(zhǔn)確度較高、分離度較好，可用于狗頭赤芍中沒(méi)食子酸和芍藥苷的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 狗頭赤芍；HPLC法；沒(méi)食子酸；芍藥苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R927.2?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）02-0016-03

Research on the Improvement of Quality Standard of? Radix Paeoniae Mairei

CAI Yuandong XUE Chaojin* LI Tianyou HE Yu

Bi jie Inspection and Testing Center of Administration for Maeket Superrvision，Bijie 551700， China

Abstract：Objective Simultaneous determination of gallic acid and paeoniflorin in Radix Paeoniae Aairei by high performance liquid chromatography （HPLC），Provide a basis for the improvement of the quality standard of Radix Paeoniae Aairei.Methods? Columns using octadecylsilane-bonded silica as filler，The mobile phase is acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution，gradient elution，The flow rate is 1mL/min，Detection wavelength is 230nm，The column temperature is 30 ℃，The injection volume is 10 μL. Results? Linear and range are，Gallic acid： Y=22472X+2118.9， r=0.9999 （n=5），The linear relationship is good in the range of 4.237～33.884 μg；Paeoniflorin： Y=13583X-12485， r=0.9999 （n=5），The linear relationship is good in the range of 5.197～41.578 μg.The average recovery rate of gallic acid was 99.58%， and the RSD was 1.17%；The average recovery of paeoniflorin was 99.84%， and the RSD was 0.45%.Conclusion? The established method is fast， simple， with good repeatability， high accuracy and good separation.It can be used for the quality control of gallic acid and paeoniflorin in PRadix Paeoniae Aairei.

Keywords：Radix Paeoniae Aairei；HPLC method ；Gallic Acid；Paeoniflorin；Quality Standard

狗頭赤芍為毛茛科植物美麗芍藥Paeonia mairei Lévl.、草芍藥Paeonia obovata Maxim.的干燥根。春、秋二季采挖，除去根莖、須根及雜質(zhì)，干燥。其功能為活血化瘀，涼血調(diào)經(jīng)。用于瘀滯胸脅疼痛、腹痛、目赤、痛經(jīng)、經(jīng)閉、衄血、跌撲損傷［1］。美麗芍藥主要分布于貴州畢節(jié)、威寧等地，草芍藥主要分布在貴州麻江、錦屏、威寧、赫章、水城、遵義等地［2-3］。根據(jù)相關(guān)報(bào)道［4］，狗頭赤芍主要化學(xué)成分為芍藥苷、 羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷（白芍苷）、 芍藥新苷、 芍藥苷元酮等。芍藥苷具有保肝、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、保護(hù)缺血性的腦損傷及神經(jīng)損傷的作用，還具有抗抑郁作用、抑制炎癥作用［5］。沒(méi)食子酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等活性［6］。狗頭赤芍收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版），標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)其粉末進(jìn)行了顯微鑒別，不能全面反映藥材整體質(zhì)量。本文采用HPLC法同時(shí)測(cè)定狗頭赤芍中沒(méi)食子酸和芍藥苷的含量，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀，2998二極管陣列檢測(cè)器。電子天平：MSE3.6P-OCE-DM，由賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)；電子天平：AY120、BX420H由梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)。潔康超聲波清洗機(jī)（超聲功率：360 W，超聲頻率：40 KHz）由東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 試藥 沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201602，含量以90.8%計(jì)）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-202044，含量以96.8%計(jì)）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純（美國(guó)TEDIA天地試劑公司），實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，稀乙醇：取乙醇（95%，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）529 mL，加娃哈哈純凈水稀釋至 1000 mL，即得稀乙醇。

1.3 樣品信息 采集的樣品經(jīng)貴州省中藥研究所陳德媛老師鑒定，為毛茛科植物草芍藥 Paeonia obovata Maxim。樣品詳見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL- Packed- Column? 5C18-MS-II 4.6ID×250 mm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表2，色譜圖如圖1，各成分分離度皆大于1.5。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品沒(méi)食子酸、芍藥苷適量，加稀乙醇制成每1 mL含沒(méi)食子酸、芍藥苷分別為0.042 mg、0.052 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，粉碎，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率：360 W，頻率：40 KHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得［7］。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度。分別精密吸取10 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次。以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得到?jīng)]食子酸和芍藥苷線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件重復(fù)測(cè)定5次，分別計(jì)算2種成分的峰面積積分值。結(jié)果沒(méi)食子酸、芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.5%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取畢節(jié)市赫章縣鐵匠鄉(xiāng)采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細(xì)，取粉末5份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份平行測(cè)定2次，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定并計(jì)算各成分的含量。結(jié)果顯示狗頭赤芍中沒(méi)食子酸、芍藥苷的平均值分別為0.31%，2.28%；RSD值分別為1.33%、1.84%。表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取畢節(jié)市赫章縣鐵匠鄉(xiāng)采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細(xì)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定并計(jì)算各組分峰面積的RSD值，結(jié)果沒(méi)食子酸、芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.50%、1.60%。說(shuō)明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取畢節(jié)市赫章縣鐵匠鄉(xiāng)采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細(xì)，稱(chēng)取粉末6份，每份約0.25 g，加入沒(méi)食子酸、芍藥苷濃度分別為0.7258 mg/mL、5.4015 mg/mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定并計(jì)算回收率?；厥章势骄捣謩e為99.58%、99.84%，RSD分別為1.17%、0.45%。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.9 樣品含量的測(cè)定 取不同產(chǎn)地的狗頭赤芍樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份平行測(cè)定2次，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定并計(jì)算各成分的含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

結(jié)果按干燥品計(jì)算，樣品中沒(méi)食子酸的含量為0.30%～0.47%，平均值為0.4%；芍藥苷的含量為2.28%～3.24%，平均值為2.7%。從含量測(cè)定的結(jié)果看出，芍藥苷的含量均高于《中國(guó)藥典》（2020版）“赤芍”的含量限度1.8%，本品可以作為赤芍的替代品使用。沒(méi)食子酸含量較高的樣品，芍藥苷含量也相對(duì)較高，如產(chǎn)于畢節(jié)市赫章縣和威寧縣的樣品，含量的高低是否與地域和植物的生長(zhǎng)周期有關(guān)，還待進(jìn)一步的研究。

3 討論

本研究分別采用甲醇-0.05 moL／L磷酸二氫鉀溶液和乙腈-0.1％磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，結(jié)果用甲醇-0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液時(shí)，芍藥苷色譜峰拖尾較嚴(yán)重，選用乙腈-0.1％磷酸溶液時(shí)，目標(biāo)峰峰形較好，且與相鄰雜質(zhì)峰達(dá)到完全分離，取得了滿意的效果。

采用稀乙醇為溶劑，分別考察了超聲處理15 min、30 min和45 min，結(jié)果超聲處理15 min時(shí)，樣品含量較低，超聲處理30 min和45 min時(shí)樣品含量相差不大，說(shuō)明超聲處理15 min時(shí)，目標(biāo)成分未提取完全，超聲處理30 min和45 min時(shí)目標(biāo)物提取較完全，為保證充分提取完全和縮短實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)間，本次研究選擇超聲處理30 min。分別取稀乙醇、甲醇和50%甲醇作為溶劑，超聲處理30 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀乙醇提取時(shí)目標(biāo)物含量較高，故本研究采用稀乙醇為提取溶劑。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法分別同時(shí)測(cè)定了5個(gè)不同產(chǎn)地的狗頭赤芍中的沒(méi)食子酸和芍藥苷的含量，取得了較為滿意的結(jié)果。該方法較為簡(jiǎn)便，重復(fù)性較好，可用于狗頭赤芍的含量測(cè)定及質(zhì)量評(píng)價(jià)，為狗頭赤芍質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供方法依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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［4］徐國(guó)鈞，徐珞珊.《常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究》南方協(xié)作組第二冊(cè)［M］.福州：福建科技出版社，1997：110.

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［6］孫輯凱，張梅娟，張宏蓮，等. UPLC-Q-Trip-MS /MS 法測(cè)定赤芍中4 種成分的含量［J］.化學(xué)試劑，2021，43（2）：216-219.

（收稿日期：2022-05-16 編輯：劉 斌）