王寧，霍飛超，張逸彬，石建斌，許慶華，嚴(yán)根土，劉曉紅

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物育種及產(chǎn)業(yè)技術(shù)國(guó)家工程研究中心，河南 安陽(yáng)455000；2.新疆前海種業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 圖木舒克 843900）

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球約有9.55 億hm2的土地在遭受鹽漬化的侵蝕，鹽堿脅迫是限制農(nóng)作物生產(chǎn)的重要因素之一[1]。我國(guó)是世界上鹽堿地面積最大的國(guó)家之一，鹽漬化土壤總面積約為1 億hm2，約占全國(guó)可耕地面積的25%，并且由于不合理的灌溉，農(nóng)業(yè)區(qū)的土壤次生鹽漬化問(wèn)題日益嚴(yán)峻，嚴(yán)重威脅著我國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。因此，合理地開(kāi)發(fā)和利用鹽堿地資源，已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向。

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力，被認(rèn)為是改良鹽堿地的先鋒植物之一[3]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約有2.7×106hm2的鹽堿地先后被開(kāi)發(fā)用于植棉，已成為世界上鹽堿地植棉規(guī)模最大的國(guó)家[4]。雖然棉花是一種較耐鹽的農(nóng)作物，但土壤中鹽分含量過(guò)高也會(huì)對(duì)棉花的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，尤其是在萌發(fā)期和苗期[3]。棉花在鹽堿地種植時(shí)，易出現(xiàn)種子萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制、出苗困難甚至死苗等現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了鹽堿地區(qū)的棉花生產(chǎn)[3，5-6]。

種子萌發(fā)過(guò)程中其新陳代謝極為旺盛，種子吸水膨脹會(huì)激活糖酵解、三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸等多條代謝途徑，促進(jìn)高分子內(nèi)含物降解進(jìn)而為萌發(fā)生長(zhǎng)提供能量。已有研究表明，鹽脅迫能顯著抑制萌發(fā)期種子中的油脂降解、糖酵解和三羧酸循環(huán)等能量代謝過(guò)程，進(jìn)而降低種子活力、抑制種子萌發(fā)出苗[7-9]。γ- 氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）是廣泛存在于植物中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，其內(nèi)源合成主要依賴(lài)于谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD）催化谷氨酸發(fā)生脫羧反應(yīng)[10]。植物中的GABA 代謝途徑是從三羧酸循環(huán)延伸出來(lái)的一個(gè)分支，又稱(chēng)GABA 支路，與能量代謝密切相關(guān)，對(duì)鹽脅迫下種子發(fā)芽及幼苗形態(tài)建成至關(guān)重要[7]。為研究棉花種子萌發(fā)期的耐鹽機(jī)理，本研究以5 個(gè)不同基因型的棉花種子為供試材料，研究鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)、GAD 活性、GABA含量和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）含量等的影響，初步探索棉花種子萌發(fā)期耐鹽的內(nèi)在機(jī)理，為培育耐鹽棉花品種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用不同類(lèi)型及生態(tài)區(qū)域的5 個(gè)棉花品種（系）為研究材料，其中優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的中棉9001[11]、豐產(chǎn)多抗的中棉所49[12]以及鹽敏感型棉花品系中J0102[13]均來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)宜機(jī)采的塔河2 號(hào)[14]和新陸中82 號(hào)[15]由新疆塔里木河種業(yè)股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

種子發(fā)芽試驗(yàn)采用紙上發(fā)芽法。以200 mmol·L－1的NaCl 溶液進(jìn)行鹽脅迫處理（S），以加相同體積的蒸餾水處理為對(duì)照（CK）。選取大小均勻且飽滿(mǎn)的棉花種子用10%（體積分?jǐn)?shù)）的H2O2浸泡消毒15 min，再用蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次，均勻放置于鋪有2 層濾紙的直徑為20 cm 的培養(yǎng)皿中，每皿加15 mL 的NaCl 溶液或蒸餾水后播入50 粒種子，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)。將培養(yǎng)皿放置于光照/黑暗時(shí)間為14 h/10 h、晝夜溫度為28 ℃/20 ℃、相對(duì)濕度為80%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定

在棉花種子萌發(fā)期，每隔24 h 調(diào)查1 次萌發(fā)種子數(shù)和根長(zhǎng)，在萌發(fā)第4 天結(jié)束實(shí)驗(yàn)。參照蘭艷等[16]的方法統(tǒng)計(jì)分析相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)根長(zhǎng)、平均發(fā)芽時(shí)間、種子活力指數(shù)等萌發(fā)指標(biāo)。

1.4 GAD 活性、GABA 含量和ATP 含量的測(cè)定

種子萌發(fā)48 h 后，分別測(cè)定種子中的GAD 活性以及GABA 和ATP 的含量。

將冰浴中研磨后的新鮮樣品（0.1 g）與1 mL 提取緩沖液[含0.05 mmol·L－1的Tris-HCl、1 mmol·L－1的乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）、1%（體積分?jǐn)?shù)）的蛋白酶抑制劑和10%（體積分?jǐn)?shù)）的甘油]混合，將所得勻漿在4 ℃、8 000g轉(zhuǎn)速下離心10 min，然后使用GAD 活性試劑盒（Solarbio，北京）測(cè)定640 nm 處的吸光度值，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算GAD 活性。

取0.1 g 新鮮樣品與7%（體積分?jǐn)?shù)）的乙酸混合，置于95 ℃水浴中提取2 h，然后在25 ℃、8 000g轉(zhuǎn)速下離心10 min。收集上清液，用GABA 試劑盒（Omin，上海）測(cè)定GABA 含量。

取冰浴中研磨好的0.1 g 新鮮樣品，加入含0.6%三乙胺- 磷酸和0.1 mmol·L－1EDTA 的飽和酚溶液[7]，然后用ATP 含量試劑盒（Solarbio，北京）測(cè)定不同樣品中的ATP 含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 16.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，確認(rèn)其符合正態(tài)分布后進(jìn)行雙因素方差分析，并用鄧肯多重范圍檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。利用DPS V7.05 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用主成分分析和通徑分析等方法進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)及種子活力指標(biāo)的影響

鹽脅迫明顯抑制了不同棉花材料的種子萌發(fā)。萌發(fā)第4 天，供試棉花材料的相對(duì)發(fā)芽率為43.5%～86.3%，相對(duì)根長(zhǎng)為40.0%～76.5%（圖1），表明上述棉花材料在萌發(fā)期的耐鹽性存在差異。其中，中J0102 受鹽脅迫的抑制程度最重，萌發(fā)第4 天的相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)根長(zhǎng)分別為43.5%和40.0%；新陸中82 號(hào)受鹽脅迫的抑制程度最輕，萌發(fā)第4 天的相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)根長(zhǎng)分別為86.3%和75.5%；鹽脅迫下，塔河2 號(hào)、中棉9001 和中棉所49 的相對(duì)發(fā)芽率分別為65.3%、78.0%和68.8%，而相對(duì)根長(zhǎng)分別為65.6%、69.2%和65.2%。

圖1 鹽脅迫下不同棉花材料種子的相對(duì)發(fā)芽率（A）和相對(duì)根長(zhǎng)（B）

CK 處理下，中棉9001 種子的平均發(fā)芽時(shí)間顯著長(zhǎng)于新陸中82 號(hào)、中棉所49 和中J0102 （圖2A）。鹽脅迫顯著延長(zhǎng)了不同棉花材料種子的平均發(fā)芽時(shí)間，其中中J0102 的平均發(fā)芽時(shí)間最長(zhǎng)，新陸中82 號(hào)的平均發(fā)芽時(shí)間最短。

圖2 2 種處理下不同棉花材料種子平均發(fā)芽時(shí)間（A）和種子活力指數(shù)（B）的比較

CK 處理下，塔河2 號(hào)和中棉9001 的種子活力指數(shù)較高（圖2B）；鹽脅迫顯著降低了不同棉花材料的種子活力指數(shù)，其中中J0102 的種子活力指數(shù)最低，僅為正常條件下的11.0%；新陸中82 號(hào)受鹽脅迫的抑制程度最小，其種子活力指數(shù)為CK 的56.5%；鹽脅迫下，塔河2 號(hào)、中棉9001 和中棉所49 的種子活力指數(shù)分別為CK 的31.6%、36.6%和37.9%。

2.2 鹽脅迫對(duì)萌發(fā)期棉花種子中GABA 含量、GAD 活性和ATP 含量的影響

由圖3A 所示，與CK 相比，鹽脅迫顯著增加了不同棉花材料萌發(fā)期種子中的GABA 含量。其中：鹽脅迫下新陸中82 號(hào)的GABA 含量最高，較CK增加2.74 倍；與CK 相比，鹽脅迫下塔河2 號(hào)、中棉9001、中棉所49 和中J0102 的GABA 含量分別增加2.29 倍、2.84 倍、2.29 倍和2.08 倍。

種子萌發(fā)期，與CK 相比，鹽脅迫顯著提高了棉花種子中GAD 的活性（圖3B）。在鹽脅迫下，塔河2 號(hào)、中棉9001、新陸中82 號(hào)、中棉所49 和中J0102 的GAD 活性分別是CK 的2.12 倍、2.13 倍、2.19 倍、1.87 倍和1.62 倍。

種子萌發(fā)期，與CK 相比，鹽脅迫顯著降低了不同棉花材料種子中的ATP 含量（圖3C）。其中：中J0102 種子受鹽脅迫的抑制程度最重，ATP 含量較CK 降低了65.4%；新陸中82 號(hào)受鹽脅迫的抑制程度最輕，ATP 含量較CK 降低了16.4%；與CK相比，鹽脅迫下塔河2 號(hào)、中棉9001 和中棉所49的ATP 含量分別降低了28.3%、24.2%和26.5%。

2.3 萌發(fā)期棉花種子各測(cè)定指標(biāo)的主成分分析和通徑分析

根據(jù)各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)的相似性，主成分分析將不同處理下不同基因型的棉花材料分為4 類(lèi)（圖4）。CK 條件下，不同的棉花材料點(diǎn)聚在一起，表明此條件下不同棉花材料萌發(fā)期各指標(biāo)之間的相似性較高。鹽脅迫下，主成分分析將不同基因型的棉花材料分為3 類(lèi)：中棉9001 和新陸中82 號(hào)點(diǎn)聚到一起，塔河2 號(hào)和中棉所49 點(diǎn)聚到一起，中J0102 單獨(dú)歸為一類(lèi)。

圖4 不同處理下棉花材料各測(cè)定指標(biāo)的主成分分析結(jié)果

為探究影響種子萌發(fā)期棉花生長(zhǎng)的主要因素，以根長(zhǎng)（y）為因變量，以種子發(fā)芽率（x1）、平均發(fā)芽時(shí)間（x2）、種子活力指數(shù)（x3）、GAD 活性（x4）、GABA 含量（x5）和ATP 含量（x6）為自變量進(jìn)行多元線(xiàn)性逐步回歸，剔除無(wú)顯著性的變量，以篩選出影響萌發(fā)期根生長(zhǎng)的重要性狀。在本研究條件下，種子活力指數(shù)（x3）和ATP 含量（x6）對(duì)根長(zhǎng)（y）有顯著影響，其回歸方程為y＝1.25＋0.91x3＋1.05x6（決定系數(shù)R2＝0.942）。種子活力指數(shù)和ATP 含量均對(duì)根長(zhǎng)有顯著的正向直接效應(yīng)，其直接通徑系數(shù)分別為0.536 和0.455。同時(shí)，種子活力指數(shù)和ATP 含量還可以通過(guò)彼此對(duì)根長(zhǎng)產(chǎn)生較強(qiáng)的正向間接效應(yīng)。種子活力指數(shù)和ATP 含量與根長(zhǎng)的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)分別為0.950 和0.963（表1）。

表1 萌發(fā)期種子活力指數(shù)和ATP 含量與根長(zhǎng)的通徑分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)期是種子植物實(shí)現(xiàn)種群更新和延續(xù)的關(guān)鍵時(shí)期，萌發(fā)過(guò)程中的物質(zhì)代謝對(duì)種子成功發(fā)芽及植株形態(tài)建成至關(guān)重要[3，8，17-18]。在高鹽脅迫下，植物不能有效調(diào)節(jié)體內(nèi)的離子平衡，從而導(dǎo)致能量代謝發(fā)生紊亂，造成種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)降低，生長(zhǎng)受到抑制[7-8，17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫顯著降低了萌發(fā)期種子中的ATP 含量，從而降低了不同棉花材料的種子活力、種子發(fā)芽率以及根的生長(zhǎng)，與先前的研究結(jié)果[3，7，9]一致。通過(guò)種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的比較和主成分分析表明，不同基因型棉花材料的耐鹽性表現(xiàn)為中棉9001、新陸中82 號(hào)＞塔河2 號(hào)、中棉所49＞中J0102。根據(jù)筆者等先前的研究結(jié)果，中棉所49 屬于中等耐鹽型品種，而中J0102 屬于鹽敏感型材料[3，7]。據(jù)此推測(cè)，新陸中82號(hào)和中棉9001 屬于強(qiáng)耐鹽型品種，塔河2 號(hào)屬于中等耐鹽型品種。

在植物體內(nèi)，GABA 支路作為三羧酸循環(huán)的回補(bǔ)反應(yīng)，可為植株抵抗逆境脅迫提供能量[7，9]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫顯著增加了萌發(fā)期種子中GABA 合成關(guān)鍵酶GAD 的活性，從而提高了GABA含量；不同基因型相比，鹽脅迫下耐鹽型品種（新陸中82 號(hào)和中棉9001）萌發(fā)期種子中的GAD 活性和GABA 含量較高，而鹽敏感型材料中J0102 種子中的GAD 活性和GABA 含量最低。結(jié)合鹽脅迫下耐鹽性較強(qiáng)的棉花品種具有較高ATP 含量的結(jié)果推測(cè)，鹽脅迫下耐鹽性較強(qiáng)的棉花品種可能通過(guò)上調(diào)GABA 支路參與三羧酸循環(huán)，為種子萌發(fā)過(guò)程提供較多的能量。同時(shí)，通徑分析表明ATP 含量對(duì)根長(zhǎng)具有較強(qiáng)的顯著正效應(yīng)。綜上，鹽脅迫條件下，萌發(fā)期棉花種子可通過(guò)調(diào)節(jié)GABA 支路代謝途徑促進(jìn)ATP 的生成，進(jìn)而更好地適應(yīng)外界鹽脅迫環(huán)境。