劉祥苗　劉婷　楊敏麗

摘要：碳量子點(diǎn)（CQDs）以其優(yōu)良的光電性能，以及環(huán)保、價(jià)廉、易得的優(yōu)點(diǎn)而受到極大關(guān)注.以檸檬酸（CA ）和三聚氰胺（Melamine）為原料，采用一步水熱法成功制備了氮摻雜的碳量子點(diǎn)（ N-CQDs）.對(duì)其形貌、組成及光譜性能進(jìn)行了表征，詳細(xì)研究了其電化學(xué)發(fā)光（ECL ）性能，結(jié)果表明：所合成的 N-CQDs 在共反應(yīng)劑過硫酸鉀（K2S2 O8）存在下能發(fā)射強(qiáng)且穩(wěn)定的 ECL 信號(hào).進(jìn)一步研究顯示：金納米粒子（Au NPs ）的存在會(huì)導(dǎo)致 N-CQDs 的 ECL 信號(hào)猝滅，而谷胱甘肽（GSH ）的加入又能使其 ECL 信號(hào)得以恢復(fù).根據(jù)這一特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了對(duì) GSH 的靈敏檢測(cè)，線性響應(yīng)范圍為1.0×10-9～1.0×10-4 mol ·L-1，檢出限是8.0×10-10 mol ·L-1.該策略也可用于其他含巰基（-SH ）的生物硫醇類物質(zhì)的檢測(cè).

關(guān)鍵詞：電化學(xué)發(fā)光（ECL ）；氮摻雜碳量子點(diǎn)（N-CQDs）；谷胱甘肽（GSH ）；金納米粒子（Au NPs）

中圖分類號(hào)：O 657.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1000-5137（2023）01-0038-08

Determination of glutathione based on electrochemiluminescence of N-CQDs

LIU? Xiangmiao，LIU Ting，YANG? Minli*

（College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：Carbon quantum dots（CQDs）have attracted great attention because of their excellent photoelectric properties，environmental friendliness，low cost，and easy availability. Nitrogen doped carbon quantum dots（N-CQDs）were prepared by one-step hydrothermal method using melamine and citric acid（CA） as raw materials. Their morphology，composition，and spectral properties were characterized with various technologies. The electrochemical luminescence（ECL） property of N-CQDs was investigated in detail. The result showed that the synthesized N-CQDs could emit strong and stable ECL signals in the presence of co-reactive potassium persulfate（K2S2O8）. Further studies showed that the presence of gold nanoparticles（Au NPs）could cause the ECL signal of N-CQDs to be quenched，and the addition of glutathione（GSH） could restore the ECL signal. Based on this principle，the sensitive detection of GSH was achieved with a linear response range of 1.0×10-9 to 1.0×10-4 mol ·L-1 and a detection limit of 8.0×10-10 mol ·L-1. This strategy can also be usedfor the detection of other mercapto（-SH ） containing biothiols.

Key words：electrochemiluminescence（ECL）；nitrogen-doped carbon quantum dots（N-CQDs）；glutathione（GSH）；gold nanoparticles （ Au NPs ）

谷胱甘肽（GSH ）作為一種內(nèi)源性抗氧化劑在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，例如抗衰老、抗自由基、減少過氧化物和重金屬造成的損傷[1-4].研究表明，GSH 平衡的破壞與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默病（AD ）、多發(fā)性硬化癥（MS ）和帕金森?。≒D ）[5-7].因此，GSH 的檢測(cè)具有重要的臨床意義.迄今為止，已經(jīng)提出了多種檢測(cè) GSH 的方法，包括比色法（CA ）[8]、分光光度法（SP ）[9]、熒光光譜法（FL ）[10]和表面增強(qiáng)拉曼散射法（SERS ）[11]等.然而，前兩種檢測(cè)方法的靈敏度低，不能滿足低濃度 GSH 測(cè)定的需求，而后兩種方法需要昂貴的儀器，且背景信號(hào)強(qiáng).電化學(xué)發(fā)光（ECL ）法是一種通過電極激發(fā)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的分析方法，具有儀器簡(jiǎn)單、靈敏度高和背景信號(hào)低的優(yōu)點(diǎn)，目前已成為食品、環(huán)境監(jiān)測(cè)和生物分析等領(lǐng)域中必不可少的分析手段[12-13].

碳量子點(diǎn)（CQDs）是直徑小于10 nm 的經(jīng)典零維材料，它們具備合成簡(jiǎn)單、成本低、生物相容性好以及環(huán)境友好等特點(diǎn)[14].近年來，有關(guān) CQDs 的 ECL 研究引起了人們的廣泛關(guān)注[15].但是，單純的 CQDs 存在發(fā)光效率較低、分析選擇性不佳等問題，需要通過摻雜或表面修飾來改善其發(fā)光性能和分析選擇性.氮（ N ）與碳（C ）的物理和化學(xué)性能接近，易摻雜進(jìn) CQDs 中.N 元素的摻雜能提高 CQDs 的 ECL 強(qiáng)度和穩(wěn)定性[16]，同時(shí)，N 摻雜在 CQDs 表面引入了-NH2，可通過表面-NH2的功能化反應(yīng)選擇性檢測(cè)更多物質(zhì)[17].

本研究以檸檬酸（CA ）和三聚氰胺（Melamine）為原料，利用一步水熱法成功合成了具有良好 ECL 性能的氮摻雜碳量子點(diǎn)（N-CQDs）.將其固定在玻碳電極（GCE ）上，在0～-2.0 V 電位掃描下產(chǎn)生強(qiáng)的ECL 信號(hào)，金納米粒子（Au NPs ）的加入會(huì)和 N-CQDs 發(fā)生能量轉(zhuǎn)移（ET ），從而熄滅其 ECL 信號(hào)，而 GSH 又能使其 ECL 信號(hào)得以恢復(fù)，利用這個(gè)特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了 GSH 的快速靈敏檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

三聚氰胺、過硫酸鉀（K2S2O8）均購于阿拉丁（上海）有限公司；CA、殼聚糖（CHIT，脫乙酰度98%）均購于美國 Sigma-Aldrich 化學(xué)公司；四水氯金酸（HAuCl4·4H2O ）、尿素（Urea ）、抗壞血酸（AA ）、乙酸、無水乙醇均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸三鈉購于江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；還原型 GSH 購于Sangon Biotech；L-半胱氨酸（L-Cys）、L-酪氨酸（L-Tyr）、L-賴氨酸（L-Lys）、葡萄糖（Glu）、L-色氨酸（ L-Trp）、氯化鉀、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均購于上海 Adamas 試劑公司；氫氧化鈉購于天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；所有藥品均為分析純，溶液以超純水配置.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電化學(xué)工作站（CHI 660E），上海辰華儀器有限公司；ECL 分析系統(tǒng)（MPI-A/B ），西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司；透射電子顯微鏡（TEM，JEM-2010），日本電子公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1800）和熒光分光光度計(jì)（RF-5301PC），日本島津公司；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，Nicolet iS5），Thermo Scientific 公司；X 射線光電子能譜儀（XPS，ULVCA-PHI ），美國 PE 公司.

1.3? N-CQDs 的制備

以 CA 作為 C 源，三聚氰胺作為 N 源，參考文獻(xiàn)[18]的方法，合成 N-CQDs.具體步驟為：1）稱取0.200 g CA 和0.083 g 三聚氰胺溶于6 mL 去離子水中，超聲30 min，將混合液轉(zhuǎn)移至50 mL 反應(yīng)釜內(nèi)，密封加熱到160℃，持續(xù)12 h；2）反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，然后以8000 r ·min-1速度離心10 min，取上清液于截留分子質(zhì)量（MWCO ）為1000 u 的透析袋內(nèi)透析14 h，去除未反應(yīng)的 CA 與三聚氰胺，得到 N-CQDs，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.4? Au NPs 的制備

采用檸檬酸三鈉還原 HAuCl4·4H2O 的方法制備 Au NPs[19]：1）量取250μL 物質(zhì)的量濃度為0.1 mol ·L-1的HAuCl4·4H2O 加入到裝有100 mL 去離子水的錐形瓶中，然后將其置于磁力攪拌器上，加熱至微沸狀態(tài)；2）在錐形瓶中滴加800μL （質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）的檸檬酸三鈉.數(shù)分鐘后觀察到溶液顏色變?yōu)樽霞t色（淡黃色→無色→紫紅色），在535 nm 處觀察可到 Au NPs 的最大紫外可見吸收（UV-vis）峰.

1.5? N-CQDs 與CHIT 混合液（N-CQDs/CHIT）的制備

首先配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的 CHIT 乙酸溶液：稱取0.1 g 的 CHIT 溶解在10 mL 的乙酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%）中，得到1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的 CHIT 乙酸溶液.然后，取3 mL N-CQDs 與1 mL CHIT 乙酸溶液混合，超聲1 min，即得 N-CQDs/CHIT 混合液.

1.6? N-CQDs 與CHIT 混合液傳感器（N-CQDs/CHIT/GCE）的制備

將 GCE（直徑Φ=3 mm）用0.5μm 的氧化鋁（Al2O3）打磨至光滑，然后用蒸餾水沖洗，再用乙醇與蒸餾水（體積比為1∶1）混合液超聲處理1 min，用蒸餾水沖洗，自然晾干.取6.0μL N-CQDs/CHIT 混合液滴涂在經(jīng)過上述處理后的 GCE 表面，自然晾干，得到 N-CQDs/CHIT/GCE 傳感器，如圖1所示.

1.7? ECL 檢測(cè)方法

利用三電極系統(tǒng)，工作電極為 GCE 電極，對(duì)電極為鉑（Pt ）絲電極，參比電極為氯化銀電極（Ag/AgCl）電極.檢測(cè)底液：含0.14 mol ·L-1 K2S2O8的0.1 mol ·L-1磷酸鹽緩沖溶液（PBS ）（pH=7.4）.在0～-2.0 V 的范圍內(nèi)以100 mV·s-1掃描速率掃描（光電倍增管電壓為800 V，掃描方向?yàn)樨?fù)掃，起始電位為0 V），記錄 ECL 信號(hào).實(shí)際檢測(cè)時(shí)，將檢測(cè)物質(zhì)加入到底液中，檢測(cè) ECL 信號(hào).

2 結(jié)果與討論

2.1? N-CQDs 的合成條件優(yōu)化

分別以 CA、CA+三聚氰胺、CA+尿素為原料，采用一步水熱法合成不摻雜的 CQDs 和2種 N-CQDs，比較三者的 ECL 信號(hào).結(jié)果顯示：N-CQDs 的 ECL 明顯高于不摻雜的 CQDs 的，證明 N 摻雜可以改善 CQDs 的 ECL 發(fā)光效率.而相對(duì)尿素，以三聚氰胺作為 N 源獲得的 CQDs 發(fā)光效率更高，因此選擇 CA 和三聚氰胺作為原料合成的 N-CQDs.為了獲得 ECL 性能更好的 N-CQDs，對(duì) CA 和三聚氰胺的比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，以及透析時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇 CA 和三聚氰胺的物質(zhì)的量之比為2.5∶1.0，在160℃下反應(yīng)12 h，透析時(shí)間為14 h.

2.2? N-CQDs 的形貌表征

圖2（a）為 N-CQDs 的 TEM 圖，N-CQDs 呈現(xiàn)出類球狀結(jié)構(gòu).圖2（b）為 N-CQDs 的粒徑分布圖，通過計(jì)算軟件統(tǒng)計(jì)，得到 N-CQDs 的平均粒徑為（1.5±0.8） nm.

2.3? N-CQDs 的光譜表征和XPS 表征

圖3是 N-CQDs 的相關(guān)光譜圖和 XPS 譜圖.從圖3（a）的紫外吸收譜圖可以看出，232 nm 處有一個(gè)明顯的特征吸收峰，這歸因于 C ＝C 的π-π*躍遷，在252～300 nm 之間有一個(gè)弱吸收帶，這與 C ＝O，C ＝N 鍵的 n-π*躍遷有關(guān)，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果吻合[20].圖3（b）為 N-CQDs 處于不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射譜圖，可以看出 N-CQDs 的發(fā)射波長(zhǎng)隨著激發(fā)波長(zhǎng)從300 nm 增加至360nm 而呈現(xiàn)逐漸紅移的現(xiàn)象，其最大熒光發(fā)射強(qiáng)度呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，這是一種典型的激發(fā)依賴性熒光現(xiàn)象，證明 N-CQDs 的合成成功[21]，并且由圖3（b）可以看出 N-CQDs 的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm.圖3（c）是 N-CQDs 的紅外譜圖，可以看出，出現(xiàn)在3238 cm-1和3410 cm-1的吸收峰是由于 O-H 和 N-H 的伸縮振動(dòng)，在1725 cm-1處的吸收峰是由于 C ＝O 的伸縮振動(dòng)，1576 cm-1處的吸收峰歸因于 N-H 的變形振動(dòng)，1420 cm-1和1576 cm-1處的吸收帶歸屬于1，3，5-s-三嗪環(huán)（三聚氰胺殘留物）[22].在1206 cm-1處的吸收峰是由于 C ＝N 的伸縮振動(dòng)[22].與 CQDs 的紅外譜圖相比，N-CQDs 的紅外譜圖中出現(xiàn)了 C ＝N、1，3，5-s-三嗪環(huán)以及 N-H 的特征吸收峰，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果吻合[22].這些含 N 官能團(tuán)吸收峰的出現(xiàn)，以及 UV-vis、熒光的表征，共同證明了 N 的成功摻雜以及 N-CQDs 成功合成.

用 XPS 對(duì) N-CQDs 的表面組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3（d）～3（f）所示.從圖3（d）的全譜圖可以看出，表面組成含有碳（C 1s，286 eV）、氧（O 1s，531 eV ）和氮（N 1s，398 eV）3種元素，證明 N 的成功摻雜.N-CQDs 的高分辨率 N 1s 譜圖在398.0，398.6和399.4 eV 處有3個(gè)峰，分別屬于 C—N— C、N—（ C ）3和 N—H 鍵，如圖3（e）所示.圖3（f）為 N-CQDs 的高分辨率 C 1s 譜圖，經(jīng)分析，幾個(gè)特征峰歸屬如下：284.3 eV（sp2 C ），285.1 eV （sp3 C ），286.8 eV （ C—N ），287.5 eV （ C— O ）和288.7 eV （ C ＝N/C ＝O ），XPS 的結(jié)果與紅外的結(jié)果一致.

2.4 傳感器的表征

利用循環(huán)伏安法（CV ）、電化學(xué)阻抗譜（EIS ）、ECL 這3個(gè)方法對(duì)傳感器進(jìn)行了表征，如圖4所示.圖4（a）為傳感器在5 mmol·L-1鐵氰化鉀溶液（[Fe （ CN ）6]3-/4-）（含0.1 mol ·L-1氯化鉀（KCl））中的 CV 圖，N- CQDs/CHIT/GCE 的氧化還原峰電流明顯大于裸 GCE 的電流強(qiáng)度，這是因?yàn)?N-CQDs 本身具有良好的導(dǎo)電性，另外，CHIT 表面帶正電荷，能吸引更多帶負(fù)電荷的 Fe（ CN ）6]3-/4-到電極表面參與反應(yīng)，這一結(jié)果證明 N-CQDs/CHIT 被成功修飾到電極上.2種電極對(duì)應(yīng)的 EIS 圖如圖4（b）所示，與 CV 結(jié)果吻合.圖4（c）是2種電極對(duì)應(yīng)的 ECL 信號(hào)，與裸 GCE 相比，N-CQDs/CHIT/GCE 表現(xiàn)出很強(qiáng)的 ECL 響應(yīng)，表明 N-CQDs 具有良好的 ECL 活性，而且被成功修飾到電極上.

2.5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了獲得最佳響應(yīng)信號(hào)，對(duì) K2S2 O8的物質(zhì)的量濃度、N-CQDs/CHIT 的用量、PBS 的 pH 值、電位掃描速率，以及 Au NPs 的用量進(jìn)行了優(yōu)化.最終選擇 K2S2 O8的物質(zhì)的量濃度為0.14 mol ·L-1，N-CQDs/CHIT 的滴涂用量為6μL，底液 PBS 的最佳 pH 值為7.4，掃速為100 mV·s-1，以及 Au NPs 的最佳用量為30μL.

2.6 傳感器對(duì) GSH 的 ECL 響應(yīng)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)試了傳感器對(duì) GSH 的響應(yīng)，如圖5所示，ECL 信號(hào)隨 GSH 濃度的增大而增強(qiáng)，在1.0×10-9～1.0×10-4 mol ·L-1濃度范圍內(nèi)，ECL 信號(hào)增加值與 GSH 濃度對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)線性關(guān)系，線性方程為：ΔI=948.9 lg C+13539.8（ΔI=I-I0，其中 I0表示加入 GSH 前傳感器的 ECL 強(qiáng)度，I 表示加入 GSH 之后傳感器的 ECL 強(qiáng)度，C 表示 GSH 的物質(zhì)的量濃度），檢出限為8.0×10-10 mol ·L-1（檢出限的計(jì)算公式為3σ/S，其中σ是10次平行空白測(cè)量得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S 是校準(zhǔn)曲線的斜率），線性相關(guān)數(shù) R2為0.999.將本工作提出的策略與以往報(bào)道的策略進(jìn)行比較（表1），可以發(fā)現(xiàn)本方法擁有較低的檢出限和更寬的線性范圍.

2.7 機(jī)理探究

圖6是 N-CQDs 的 ECL 光譜（曲線1）、Au NPs （曲線2）和 Au NPs+GSH（曲線3）的 UV-vis 譜圖，可以看出，N-CQDs 的 ECL 光譜和 Au NPs 的 UV-vis 譜圖有很大重疊，說明兩者之間可以發(fā)生能量轉(zhuǎn)移.Au NPs 可以通過 Au-N 鍵結(jié)合在 N-CQDs 表面，大大縮短了兩者之間的距離，兩者之間可以產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致 N-CQDs 的 ECL 信號(hào)猝滅.當(dāng)加入 GSH 后，GSH 中的巰基（-SH ）與 Au NPs 結(jié)合能力更強(qiáng)，將 Au NPs 帶離 N-CQDs 表面，兩者之間的距離增大，能量轉(zhuǎn)移難以實(shí)現(xiàn).同時(shí)，Au NPs 與 GSH 結(jié)合后，其吸收峰紅移，與 N-CQDs 的 ECL 光譜的重疊部分相應(yīng)減少，能量轉(zhuǎn)移進(jìn)一步降低，N-CQDs 的 ECL 信號(hào)基本得以完全恢復(fù).

2.8 傳感器選擇性、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性考察

選擇性：在相同的條件下測(cè)試傳感器對(duì) GSH（1.0×10-7 mol ·L-1）及其他物質(zhì)，包括 L-Cys，L-Lys， L-Tyr，L-Trp，AA 和 Glu 的 ECL 響應(yīng)（1.0×10-5 mol ·L-1），該傳感器對(duì) GSH 的響應(yīng)最強(qiáng)，對(duì)含-SH 的 L-Cys也有響應(yīng)，而對(duì)其他不含-SH 的物質(zhì)幾乎沒有響應(yīng).進(jìn)一步證明了其響應(yīng)機(jī)理是基于-SH 與 Au NPs 的結(jié)合.

穩(wěn)定性：在0～-2.0 V 的范圍內(nèi)連續(xù)循環(huán)掃描15圈，其 ECL 信號(hào)無明顯變化.此外，傳感器在室溫下保存，每5 d 作為一周期，連續(xù)測(cè)試6個(gè)周期，其 ECL 信號(hào)保持在其原始值的90%以上.

重現(xiàn)性：選7根電極，同樣條件下進(jìn)行修飾，測(cè)其 ECL 信號(hào).7個(gè)獨(dú)立電極 ECL 信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD ）為1.90%.

上述結(jié)果表明，本工作制備的傳感器具有良好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性.

3 結(jié)論

以 CA 和三聚氰胺為原料，利用一步水熱法合成了 N-CQDs，N 元素的摻雜提高了 CQDs 的 ECL 強(qiáng)度和穩(wěn)定性，利用 Au NPs 能猝滅 N-CQDs 的 ECL 信號(hào)，而 GSH加入后信號(hào)又得以恢復(fù)的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì) GSH 的靈敏檢測(cè)，該方法顯示出高的靈敏度和良好的選擇性.同時(shí)，該策略也可用于其他含-SH 的生物硫醇類物質(zhì)的檢測(cè).

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