劉志鵬，楊康卓，何張?zhí)m，趙 東，鄭 佳

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

五糧液是我國多糧濃香型白酒的典型代表，是中國地理標(biāo)志白酒之一。五糧液具有香氣悠久、味醇厚、入口甘綿、入喉凈爽、各味協(xié)調(diào)、恰至好處的獨(dú)特酒體風(fēng)格[1-3]。5 種糧食配方、包包曲、跑窖循環(huán)、雙輪底發(fā)酵、分層起糟、分層蒸酒、量質(zhì)摘酒、沸點(diǎn)量水等獨(dú)創(chuàng)優(yōu)秀的釀造工藝賦予了五糧液原酒優(yōu)良的品質(zhì)[4]。五糧液的酒體風(fēng)格與原酒的品質(zhì)息息相關(guān)，解析五糧液原酒中的揮發(fā)性組分對五糧液酒體品質(zhì)穩(wěn)定具有重要意義。

五糧液中的揮發(fā)性成分十分復(fù)雜，研究報(bào)告稱在五糧液中已發(fā)現(xiàn)超過3000 種化合物[5]。但是關(guān)于五糧液原酒揮發(fā)性組分的研究較少。氣相色譜質(zhì)譜儀（gas chromatography mass spectrometry,GCMS）作為風(fēng)味研究中常用的分析手段，由于其峰容量有限，分離度不足，單次分析往往只能檢測出近一百種組分。面對五糧液如此復(fù)雜的基質(zhì)，傳統(tǒng)一維GC-MS 無法滿足分析要求。全二維氣相色譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography,GC×GC）將兩根不同極性的色譜柱連接起來，分析物從一維色譜柱流出后進(jìn)入二維色譜柱進(jìn)行二次分離，大大提高了分離度和峰容量。目前該技術(shù)在白酒風(fēng)味研究中得到更多應(yīng)用[5-7]，能分析檢測出數(shù)百種甚至上千種組分。飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(timeof-flight mass spectrometry,TOF-MS)具有掃描速度快和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。全二維氣相色譜結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）將是實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品揮發(fā)性組分分離鑒定的有力工具。

王露露等[7]在基于GC×GC-TOFMS 分析白酒微量組分的研究中，比較了不同前處理方法對白酒中揮發(fā)性組分的富集濃縮效果，發(fā)現(xiàn)通過頂空固相微萃?。╤ead space solid phase micro extraction,HSSPME）技術(shù)檢測到的揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)量最多。本研究采用HS-SPME技術(shù)富集濃縮五糧液原酒中的揮發(fā)性組分，隨后經(jīng)過GC×GC-TOFMS 分離鑒定，準(zhǔn)確鑒定酒樣中的揮發(fā)性組分，進(jìn)一步加強(qiáng)了對五糧液原酒揮發(fā)性組分的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣采集：實(shí)驗(yàn)原酒采集自五糧液股份有限公司釀酒車間，所選窖池窖齡在40 年以上，選取中層糟醅上甑蒸餾，酒頭收集1 個(gè)樣品，原酒收集3個(gè)樣品，酒尾收集1個(gè)樣品，每個(gè)酒樣取20 mL。

試劑及耗材：用于定性的標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)，TCIAmerica(Port-land，OR，USA)；C7-C30直鏈正構(gòu)烷烴和乙醇(色譜級)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)；NaCl(化學(xué)純)，中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：超純水儀，Millipore 公司；50/30 μm的DVB/CAR/PDMS 三相萃取頭（2 cm），美國Supelco 公司；全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(GC×GC-TOFMS,Pegasus 4D)，美國LECO 公司；7890A 氣相色譜儀和一維色譜柱DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫公司；二維色譜柱Rxi-17SilMS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Restek公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)試驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法按照本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的方法進(jìn)行。取適量酒樣用飽和氯化鈉水溶液稀釋到4%酒精度，取1 mL 稀釋后的酒樣在50 ℃下平衡15 min，萃取45 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為400 r/min。萃取富集后于GC進(jìn)樣口在250 ℃下解吸附5 min，分流比為5∶1，隨后進(jìn)行GC×GC-TOFMS 分析。每個(gè)樣品在相同條件下進(jìn)樣3次。

1.2.2 GC×GC-TOFMS分析方法

進(jìn)樣口溫度250 ℃，一維柱箱起始溫度45 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升溫至230 ℃并保持10 min；第2 個(gè)柱箱全程保持比一維柱箱高5 ℃；調(diào)制補(bǔ)償溫度20 ℃；調(diào)制周期為4 s（熱脈沖時(shí)間0.8 s)。色譜柱采用恒流模式，載氣為高純氦氣(純度＞99.999%)，流速為1 mL/min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源電壓為-70 eV，溫度為230 ℃，傳輸線溫度為240 ℃，檢測器電壓為1500 V，采集質(zhì)量數(shù)范圍為35～400 amu，采集頻率為100 spectra/s。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采集的TOFMS 數(shù)據(jù)由LECO 公司軟件ChromaTOF 進(jìn)行解圖處理。自動(dòng)識別信噪比大于100的色譜峰，進(jìn)行自動(dòng)解卷積和質(zhì)譜庫比對，質(zhì)譜庫為NIST 2014 和Wiley 9。篩選相似度大于800的化合物，并剔除沒有風(fēng)味貢獻(xiàn)的胺類、腈類和烷烴類等化合物，作為初步鑒定結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，相同色譜條件下分析一系列正構(gòu)烷烴(C7-C30)，確定每個(gè)化合物的一維色譜柱保留指數(shù)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)進(jìn)行比對確認(rèn)，偏差在30 以內(nèi)的化合物作為可信度較高的結(jié)果[7-9]。通過在模擬酒溶液中添加真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)品，對比樣品與模擬酒溶液中色譜峰的一維時(shí)間和二維時(shí)間，篩選一維時(shí)間偏差在4 s 內(nèi)(1 個(gè)調(diào)制周期)，二維時(shí)間偏差在0.1 s 內(nèi)的組分作為最終的鑒定結(jié)果。將5 個(gè)酒樣中鑒定出的揮發(fā)性組分合并為最終鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 原酒中的風(fēng)味物質(zhì)分析

2.1.1 全二維氣相色譜在白酒風(fēng)味分析中的優(yōu)勢

白酒復(fù)雜的香氣是由上千種香氣組分共同決定的[10]。白酒中香氣組分主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、縮醛類、呋喃類、酚類、萜烯類、內(nèi)酯類、芳香類化合物以及含氮、含硫化合物等，這些組分的揮發(fā)性和極性等性質(zhì)存在著顯著差異，因此可以通過氣相色譜進(jìn)行分離鑒定[6，11-12]。傳統(tǒng)一維氣相色譜作為目前白酒風(fēng)味分析的常用技術(shù)，存在著峰容量和分離能力較低的缺點(diǎn)，分析研究中往往只能檢測出幾十種揮發(fā)性化合物[13-14]，無法滿足復(fù)雜基質(zhì)的風(fēng)味分析。GC×GC-TOFMS 采用兩根不同極性的色譜柱對復(fù)雜組分進(jìn)行正交分離，該技術(shù)具有峰容量高，分離能力強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，單次分析可以檢測到上千種組分[5，7，15]，因此，GC×GCTOFMS 是復(fù)雜基質(zhì)中揮發(fā)性物質(zhì)分離鑒定的有效手段。

如圖1（A）所示，五糧液原酒酒樣中的揮發(fā)性組分經(jīng)過頂空固相微萃取（HS-SPME）結(jié)合GC×GC-TOFMS 技術(shù)，解析出1512 個(gè)色譜峰。圖1（B）中可以清晰的看出多個(gè)組分在一維色譜柱上共流出（黑色虛線框），在第二根色譜柱上成功分離。此外，異戊醇是濃香型白酒中重要的香氣組分，在五糧液中的含量為362.4 mg/L[2]，如圖1（B）所示，異戊醇的色譜峰強(qiáng)度較高。硫代丁酸甲酯在一維和二維色譜柱的析出時(shí)間均與異戊醇接近，其含量極低，很可能被異戊醇色譜峰掩蓋。如圖1（C）和（D）所示，二者的質(zhì)譜具有顯著差異，因此基于質(zhì)譜差異的解卷積功能可以在這種情況下區(qū)分兩個(gè)化合物。因此，相比傳統(tǒng)一維GC-MS，該技術(shù)通過二維分離和解卷積技術(shù)，可以在復(fù)雜的基質(zhì)中解析出更多香氣組分，有助于進(jìn)一步全面解析復(fù)雜的白酒香氣組分。

圖1 五糧液蒸餾56 min時(shí)流出酒樣的GC×GC-TOFMS總離子流色譜圖

2.1.2 原酒中香氣組分的鑒定

原酒中的揮發(fā)性化合物由HS-SPME技術(shù)富集濃縮后，進(jìn)入GC×GC-TOFMS 分離解析，基于軟件積分解卷積功能識別出上千個(gè)色譜峰。本研究采用多重策略對揮發(fā)性化合物進(jìn)行了定性分析。首先，色譜峰質(zhì)譜與多個(gè)質(zhì)譜庫比對的相似度可作為物質(zhì)定性的重要參數(shù)，一般認(rèn)為相似度大于800 的組分具有較高的準(zhǔn)確度。保留指數(shù)作為揮發(fā)性化合物鑒定的進(jìn)一步依據(jù)，本研究將計(jì)算的每個(gè)色譜峰的保留指數(shù)與多個(gè)數(shù)據(jù)庫中的保留指數(shù)進(jìn)行比對，差值在30 以內(nèi)的可以視為初步鑒定組分。經(jīng)過二重鑒定，其中186 種組分的一維保留時(shí)間和二維保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了對比，最終在原酒中共準(zhǔn)確鑒定出513 種揮發(fā)性化合物。其中酯類最多（145 種），其次是羰基化合物（123 種），醇類（71種），芳香類（39 種），呋喃類（33 種），酸類（25 種），含硫化合物（19 種），含氮化合物（18 種），萜烯類（15 種），揮發(fā)性酚類（15 種）和內(nèi)酯類（10 種），如圖2所示。

圖2 五糧液原酒中分析鑒定的香氣組分

酯類、醇類和羰基化合物是濃香型白酒中主要的香氣組分，這和以往的研究結(jié)果一致[16]。酯類化合物在中國白酒的香氣貢獻(xiàn)中占主導(dǎo)地位，也是五糧液原酒中數(shù)量最多的香氣組分。直鏈脂肪酸乙酯類化合物是一類重要的酯類化合物，本研究檢測到的乙酸乙酯，丙酸乙酯，丁酸乙酯，戊酸乙酯，己酸乙酯，庚酸乙酯，辛酸乙酯，壬酸乙酯和癸酸乙酯，在濃香型白酒中主要呈現(xiàn)水果的香氣[5，16]。其中，己酸乙酯是濃香型白酒的關(guān)鍵香氣成分，也是濃香型白酒中含量最高的化合物，呈現(xiàn)典型的水果香氣。在46%vol 酒精溶液中，己酸乙酯的香氣閾值僅有55 μg/L，濃香型白酒中己酸乙酯含量達(dá)到2000 mg/L 左右[2]。除此之外，一些含量較低、數(shù)量較少的組分也可能對香氣有重要貢獻(xiàn)，比如含硫化合物，含氮化合物，萜烯，酚類，呋喃類和內(nèi)酯類化合物等。

揮發(fā)性含硫化合物主要呈現(xiàn)煮洋蔥、爛白菜、煮土豆、煮白菜和煮肉的香氣特征[17-18]，由于其極低的香氣閾值對白酒香氣有重要貢獻(xiàn)。含硫化合物在白酒中的含量較低，白酒中含硫化合物的檢測一直是具有挑戰(zhàn)性的工作。本研究在五糧液原酒中分析檢測出19 種含硫化合物（表1），表明該技術(shù)適合用于分析檢測白酒中的痕量組分。

表1 五糧液原酒中經(jīng)過HS-SPME-GC×GC-TOFMS 鑒定的揮發(fā)性含硫化合物

沙莎等[17]通過感官導(dǎo)向的GC-O 技術(shù)結(jié)合香氣定量方法揭示了芝麻香白酒的特征香氣組分，表明糠硫醇、二甲基三硫和3-甲硫基丙醛等含硫化合物對其獨(dú)特的芝麻香氣具有重要貢獻(xiàn)。本研究在五糧液原酒中鑒定出的19 種揮發(fā)性含硫化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖3 所示。二甲基三硫和3-甲硫基丙醛在五糧液原酒中均檢測到，二甲基三硫在很多白酒中都是重要的香氣物質(zhì)[16，19]。有9 種含硫化合物在五糧液中首次鑒定出，包括噻吩、3-甲基噻吩、硫代丙酸甲酯、2-丙基噻吩、硫代己酸甲酯、3-甲硫基丙醛、2-戊基噻吩、糠基甲基硫醚和2-噻吩甲醛。噻吩呈大蒜氣味；2-戊基噻吩呈甜香和水果香；2-噻吩甲醛呈硫化物的香氣。上述9 個(gè)含硫化合物尚未在五糧液成品酒中發(fā)現(xiàn)，可能是因?yàn)樵诎拙频馁A存過程中，一些揮發(fā)性含硫化合物由于揮發(fā)性較強(qiáng)和化學(xué)反應(yīng)，濃度逐漸降低，經(jīng)過貯存后白酒的香氣會更加和諧醇厚。含硫化合物在濃香型白酒中的分析目前還比較少，本研究檢測出的含硫化合物對濃香型白酒的香氣貢獻(xiàn)還有待進(jìn)一步解析。

圖3 五糧液原酒中鑒定出的揮發(fā)性含硫化合物結(jié)構(gòu)圖

3 結(jié)論

本研究首次采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析五糧液原酒蒸餾過程中5 個(gè)酒樣的揮發(fā)性組分特征。研究發(fā)現(xiàn)采用極性不同的二維色譜柱系統(tǒng)結(jié)合高通量飛行時(shí)間質(zhì)譜能夠有效的實(shí)現(xiàn)五糧液原酒復(fù)雜揮發(fā)性組分的分離鑒定。本研究將色譜峰的質(zhì)譜、保留時(shí)間和保留指數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)品和多個(gè)數(shù)據(jù)庫對比，準(zhǔn)確鑒定出了513 種揮發(fā)性組分,其中酯類最多（145 種），其次是羰基化合物（123 種），醇類（71 種）；在五糧液原酒中鑒定出19 種揮發(fā)性含

硫化合物，其中9 種首次在五糧液中發(fā)現(xiàn)，其香氣貢獻(xiàn)有待進(jìn)一步分析。