龔舒蓓，范文來(lái)，徐巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)

白酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝是決定白酒獨(dú)特風(fēng)味的重要因素[1]。傳統(tǒng)白酒以手工生產(chǎn)為主，近年來(lái)生產(chǎn)方式逐步往機(jī)械化方向轉(zhuǎn)變，基本實(shí)現(xiàn)了原輔料加工、入窖和出糟等環(huán)節(jié)機(jī)械化或自動(dòng)化。目前，芝麻香型白酒生產(chǎn)機(jī)械化程度較高[2]。眾所周知，機(jī)械化裝置難以模擬人工操作，因此造成機(jī)械化白酒與手工工藝酒存在風(fēng)味與質(zhì)量差異[3-4]。

然而對(duì)傳統(tǒng)法白酒和機(jī)械化白酒差異研究的報(bào)道甚少，主要是從酒體感官特征、出入池糟醅理化指標(biāo)、出酒率和優(yōu)級(jí)率等方面對(duì)比兩種工藝生產(chǎn)的白酒[5-6]，鮮見對(duì)白酒中整體的揮發(fā)性及難揮發(fā)性物質(zhì)的比較研究。鑒于此，本研究對(duì)芝麻香型手工原酒與機(jī)械化原酒的揮發(fā)性和難揮發(fā)性成分分別進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)對(duì)兩工藝原酒微量成分的定量比較，找到其中差別較大的化合物，為在傳承傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上提高白酒機(jī)械化水平提供指導(dǎo)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：20個(gè)當(dāng)天生產(chǎn)的芝麻香型原酒(優(yōu)級(jí)手工原酒，4個(gè)樣品，編號(hào)T1～T4；一級(jí)手工原酒，4個(gè)樣品，編號(hào)T5～T8；優(yōu)級(jí)機(jī)械原酒，6個(gè)樣品，編號(hào)M1～M6；一級(jí)機(jī)械原酒，6個(gè)樣品，編號(hào)M7～M12，酒精度64%～69%vol)，均由山東景芝酒廠提供。

試劑：NaCl和磷酸(分析純)，上海國(guó)藥集團(tuán)；乙醇、NaH2PO4、苯基-β-D-葡萄糖苷、六甲基二硅胺(hexamethyldisitazane, HMDS)、己酸甲酯、乙酸正戊酯、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、吡啶、鹽酸羥胺和表 1中鑒定出的94種化合物標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；超純水(Milli-Q)，均為煮沸并冷卻至室溫的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC 6890N-MSD 5975)，Agilent 公司； 氣相色譜儀(GC 6890N)，Agilent 公司； 三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC Trace1310-MS TSQ8000)，Thermo Scientific；氮吹儀，Organomation公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Buchi 公司；超高效液相色譜儀，Waters UPLC H-Class。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 難揮發(fā)化合物HMDS衍生化定量

取10 mL稀釋至酒精度60%vol酒樣于100 mL旋蒸瓶中，加入6 μL質(zhì)量濃度為256 mg/L的內(nèi)標(biāo)苯基-β-D-葡萄糖苷，40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至500 μL，然后將其轉(zhuǎn)移到2 mL樣品瓶中，緩慢氮吹至干，再參照文獻(xiàn)[7]改進(jìn)后方法處理，先往吹干樣品中加入70 μL吡啶(含質(zhì)量濃度為25 g/L的鹽酸羥胺)，搖勻，75 ℃反應(yīng)30 min，再依次加入70 μL HMDS和7 μL TFA，搖勻，45 ℃反應(yīng)30 min，最后12 000 r/min離心3 min，取1 μL進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：載氣為高純氦氣，流速1 mL/min，5∶1分流進(jìn)樣模式；色譜柱：TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250 ℃。升溫程序：65 ℃保持2 min，再以6 ℃ /min升至280 ℃保持8 min。MS條件：電子電離源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度300 ℃，SCAN模式掃描范圍：50～650 amu。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：以60%vol酒精水溶液配制一定濃度梯度待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)液，按照酒樣處理方法進(jìn)行GC-MS分析。采用選擇離子法(SIM)計(jì)算各化合物的峰面積，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 超高效液相色譜(ultra high performance liquid chromatography，UPLC)定量乳酸方法

參考文獻(xiàn)[8]方法，用超純水將白酒樣品稀釋至10%vol左右，取1 mL過(guò)0.22 μm有機(jī)針頭式濾器。

UPLC色譜條件：T3柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)，流動(dòng)相：100% NaH2PO4(質(zhì)量濃度3.12 g/L，pH 2.7)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫40 ℃，流動(dòng)相流速0.25 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：以10%vol酒精水溶液配制一定濃度梯度乳酸標(biāo)準(zhǔn)液，各梯度液處理方法與樣品一致。以乳酸峰面積為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)結(jié)合GC-MS定量易揮發(fā)化合物

參照文獻(xiàn)[9] 修改方法，準(zhǔn)確吸取18 mL稀釋至10%vol酒樣于樣品瓶中，加6 g NaCl飽和，添加內(nèi)標(biāo)己酸甲酯(終濃度1.02 mg/L)，搖勻后加入1 mL重蒸乙醚，振蕩萃取3 min，待靜置分層后，吸取上層有機(jī)相500 μL轉(zhuǎn)移至2 mL樣品瓶中，氮吹濃縮至250 μL，取1 μL進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：載氣為高純氦氣，流速2 mL/min，不分流進(jìn)樣模式；色譜柱：DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250 ℃。升溫程序：50 ℃保持2 min，再以6 ℃ /min升至230 ℃保持15 min。MS條件：電子電離源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，SCAN模式掃描范圍：35～350 amu。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：以10%vol酒精水溶液配制一定濃度梯度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)液，按照酒樣處理方法進(jìn)行GC-MS分析。采用選擇離子法(SIM)計(jì)算各化合物峰面積，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 氣相色譜-火焰離子檢測(cè)器(gas chromatography flame ionization detector，GC-FID)法定量高含量揮發(fā)性化合物

參考國(guó)標(biāo)GB/T 10345—2007法[10]，用超純水將酒樣稀釋至60%vol，加入內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯(終質(zhì)量濃度176 mg/L)，取1 μL通過(guò)DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱進(jìn)行分離、測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 手工原酒與機(jī)械原酒中的化合物

通過(guò)GC-FID、LLME-GC-MS、UPLC和HMDS衍生化方法在芝麻香型手工原酒和機(jī)械化原酒中一共定量94種化合物，包括酸類27種、醇類8種、酯類24種、芳香族15種、酚類3種、呋喃類6種、糖醇類5種、糖類4種、縮醛類1種以及內(nèi)酯類1種。手工原酒的化合物總量比機(jī)械化原酒高，分別為9.64～10.2 g/L和8.62～9.05 g/L。其中，一級(jí)手工原酒化合物總量比一級(jí)機(jī)械原酒高18.0%，而優(yōu)級(jí)手工原酒化合物總量比優(yōu)級(jí)機(jī)械原酒高6.5%。

2.2 手工原酒與機(jī)械原酒中的酯類化合物及其差異比較

酯類是芝麻香型原酒中含量最豐富的，其質(zhì)量濃度合計(jì)為6.29～7.68 g/L，分別占手工原酒和機(jī)械原酒物質(zhì)總量的75.5%～75.7%和73.0%～74.5%(表1)。檢測(cè)到的24種酯類物質(zhì)以乙酯類化合物居多，它們主要是由脂肪酸和乙醇酯化形成[11]。其中，乳酸乙酯和乙酸乙酯含量較高，分別達(dá)到2.96～4.14 g/L和2.84～3.48 g/L，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似[9]，兩者含量占到酯類總含量的71.2%～72.0%；其次是丁酸乙酯和己酸乙酯含量，范圍分別為79.2～113 mg/L和29.9～86.6 mg/L。首次在芝麻香型白酒中定量到4-酮基戊酸乙酯，含量為395～586 μg/L，它曾在白蘭地香氣研究[12]中檢測(cè)到。另外，由于酒樣批次差異、生產(chǎn)不穩(wěn)定的原因，導(dǎo)致個(gè)別酯類化合物如庚酸乙酯的含量偏差過(guò)大，下述的原酒中某些醇類、酸類、芳香族化合物等也有類似情況。

相比手工原酒，機(jī)械化的優(yōu)級(jí)及一級(jí)原酒中酯類總量下降，分別下降7.6%(優(yōu)級(jí))和18.1%(一級(jí))。就芝麻香型優(yōu)級(jí)原酒而言，與手工原酒相比，4-酮基戊酸乙酯是機(jī)械原酒中上升最明顯的酯類，上升46.7%；己酸乙酯、丁酸異戊酯和乳酸丁酯在機(jī)械原酒中下降明顯，分別下降55.0%、43.6%和39.8%。就芝麻香型一級(jí)原酒而言，與手工原酒相比，庚酸乙酯是機(jī)械原酒中上升最明顯的酯類，上升123.0%；丁酸異戊酯和乳酸丁酯在機(jī)械原酒中下降明顯，分別下降38.3%和59.9%。另外，比較不同工藝原酒中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯及乳酸乙酯這4種含量較高的酯發(fā)現(xiàn)，除了優(yōu)級(jí)機(jī)械原酒中乙酸乙酯的含量相比優(yōu)級(jí)手工原酒上升15.7%外，其他3種酯的含量在機(jī)械原酒中均下降。

表1 芝麻香型手工原酒與機(jī)械原酒中酯類物質(zhì)的平均含量Table 1 Average contents of the esters in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

注：a：V代表?yè)]發(fā)性化合物并按出峰順序編號(hào)；b：N代表難揮發(fā)性化合物并按出峰順序編號(hào)；c：含量單位mg/L；d：采用GC-FID定量；e：帶TMS基團(tuán)衍生物保留時(shí)間，采用衍生化方法定量；f：平均濃度±標(biāo)準(zhǔn)偏差；g：該類物質(zhì)占酒樣總含量的百分比；h：計(jì)算公式為(機(jī)械原酒物質(zhì)A的含量-手工原酒物質(zhì)A的含量)/手工原酒物質(zhì)A的含量×100%。下同。

2.3 手工原酒與機(jī)械原酒中的醇類化合物及其差異比較

醇類是芝麻香型原酒中含量第二高的，在手工原酒和機(jī)械原酒中的含量分別為1.34～1.42 g/L和1.20～1.26 g/L，占化合物總量的13.2%～14.7%(表2)。手工原酒和機(jī)械原酒中均檢測(cè)到揮發(fā)性醇類7種和難揮發(fā)醇類1種，它們一般來(lái)源于糖和氨基酸的降解[13]。其中，異戊醇含量最高，達(dá)到731～885 mg/L，異丁醇次之，達(dá)到226～259 mg/L。A/B值是指異戊醇與異丁醇的比值，兩工藝原酒的A/B值均為3.4，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。僅在原酒中檢測(cè)到丙三醇(即甘油)，這是一種難揮發(fā)醇類物質(zhì)，它可能是酵母菌酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物[14]，含量為328～372 μg/L。

相比手工原酒，機(jī)械化的優(yōu)級(jí)及一級(jí)原酒中醇類總量下降，分別下降10.5%(優(yōu)級(jí))和10.7%(一級(jí))。另外，從單個(gè)化合物來(lái)看，機(jī)械化的優(yōu)級(jí)酒及一級(jí)酒中正丙醇都上升，此外機(jī)械一級(jí)原酒的正戊醇也有所上升，其余醇類在機(jī)械化的優(yōu)級(jí)及一級(jí)原酒中下降，其中下降最多的是正丁醇，分別下降36.4%(優(yōu)級(jí))及52.8%(一級(jí))。醇類是白酒中重要的骨架成分，機(jī)械化白酒中醇類含量普遍降低，這可能是導(dǎo)致手工酒與機(jī)械化酒存在風(fēng)味差異的一大原因。

表2 芝麻香型手工原酒與機(jī)械原酒中醇類物質(zhì)的平均含量Table 2 Average contents of the alcohols in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

2.4 手工原酒與機(jī)械原酒中的酸類化合物及其差異比較

兩工藝原酒中酸類物質(zhì)的含量居第3且種類最多，包括了8種羥基酸、1種酮酸、1種二元酸、17種直鏈脂肪酸共27種，含量合計(jì)達(dá)到868～997 mg/L，占化合物總量的9.0%(手工原酒)～11.0%(機(jī)械原酒)，見表 3。其中，乙酸是含量最高的直鏈脂肪酸(705～849 mg/L)，乳酸是含量最豐富的羥基酸(73.6～96.6 mg/L)，兩者含量占到酸類總含量的92.3%～94.0%。直鏈脂肪酸中除棕櫚油酸、十二烷酸、十四烷酸和十八烷酸外含量均在1 mg/L以上，其中大部分短鏈脂肪酸由發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌產(chǎn)生[13]；丁二酸(又叫琥珀酸)和丙酮酸是三羧酸循環(huán)中重要的有機(jī)酸，它們?cè)诰浦械暮康?，其平均含量分別為40.7 μg/L和157 μg/L；原酒中的羥基酸除乳酸外，含量較低，一般在3～300 μg/L之間。

表3 芝麻香型手工原酒與機(jī)械原酒中酸類物質(zhì)的平均含量Table 3 Average contents of the acids in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

續(xù)表3

編號(hào)化合物RI手工原酒含量f/ (μg·L-1)機(jī)械原酒含量f/(μg·L-1)機(jī)械原酒相比手工原酒增減/%h優(yōu)級(jí)一級(jí)優(yōu)級(jí)一級(jí)優(yōu)級(jí)一級(jí)N32油酸2 224e6 130±56.36 200±87.75 970±1765 810±172-2.7-6.3酸類 小計(jì)c868(9.0%)g934(9.2%)997(11.0%)944(11.0%)14.91.1

注：i：采用UPLC定量。

相比手工原酒，機(jī)械化的優(yōu)級(jí)及一級(jí)原酒中酸類總量上升，分別上升14.9%(優(yōu)級(jí))和1.1%(一級(jí))。就芝麻香型優(yōu)級(jí)原酒而言，與手工原酒相比，機(jī)械原酒含量明顯上升的酸是2-羥基丁酸，上升128.4%， 而含量明顯下降的酸有異丁酸、3-羥基丙酸和3-羥基丁酸，分別下降36.7%、33.7%和36.3%。就芝麻香型一級(jí)原酒而言，與手工原酒相比，機(jī)械原酒中含量明顯上升的酸有2-羥基丁酸和己酸，分別上升153.9%和122.4%， 而含量明顯下降的酸有3-羥基丙酸和3-羥基丁酸，分別下降43.1%和55.4%。

2.5 手工原酒與機(jī)械原酒中的呋喃類和芳香族化合物及其差異比較

手工原酒和機(jī)械原酒里檢測(cè)到的6種呋喃類化合物總量都在70 mg/L以上(表4)。其中，糠醛是最主要的呋喃類化合物(≥28.1 mg/L)，主要產(chǎn)生于蒸餾過(guò)程[11]。

表4 芝麻香型手工原酒與機(jī)械原酒中呋喃類和芳香族化合物的平均含量Table 4 Average contents of the furans, and aromatic compounds in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

相比手工原酒，機(jī)械化的優(yōu)級(jí)及一級(jí)原酒中呋喃類總量下降，分別下降21.2%(優(yōu)級(jí))和25.2%(一級(jí))。與手工原酒相比，機(jī)械化的優(yōu)級(jí)和一級(jí)原酒中糠醛含量均下降，下降43%左右；優(yōu)級(jí)和一級(jí)機(jī)械原酒中2-糠醇、丁酸-2-糠酯、2-糠酸乙酯、乙酸-2-糠酯和2-糠酸的含量均上升，其中含量上升最多的是2-糠醇，分別上升95.3%(優(yōu)級(jí))及64.4%(一級(jí))。

9種易揮發(fā)和6種難揮發(fā)芳香族化合物在兩工藝原酒中被檢測(cè)到，含量合計(jì)為31.2～33.8 mg/L(表 4)。其中，以2-苯乙醇含量最高，達(dá)到19.4～21.9 mg/L。芝麻香型白酒中首次定量到4-羥基苯甲酸和4-羥基苯乙醇，它們可能是在制麥曲過(guò)程中由微生物生成[13]。

手工原酒與機(jī)械化原酒中芳香族類總量相差不大，但個(gè)別化合物含量存在較大差別。就芝麻香型優(yōu)級(jí)原酒而言，與手工原酒相比，機(jī)械原酒中3-苯丙酸含量上升最多，達(dá)31.5%，而丁酸-2-苯乙酯含量下降明顯，下降42.3%。就芝麻香型一級(jí)原酒而言，與手工原酒相比，機(jī)械原酒中含量上升明顯的芳香族物質(zhì)有3-苯丙酸和4-羥基苯乙醇，它們分別上升73.0%和90.2%，而丁酸-2-苯乙酯含量下降最多，達(dá)38.0%。

2.6 手工原酒與機(jī)械原酒中的其他類化合物及其差異比較

兩工藝原酒中的其他類化合物總量為1.28～1.65 mg/L，在機(jī)械原酒中的含量按酚類、縮醛類、糖醇類、內(nèi)酯類和糖類物質(zhì)依次降低(表5)。其中，3種酚類物質(zhì)可能來(lái)自于發(fā)酵過(guò)程中木質(zhì)素的降解[15]；1,1,3-三乙氧基丙烷是唯一定量的縮醛類物質(zhì)，它是在低pH值下由丙烯醛和乙醇縮合產(chǎn)生[16]；還在酒中定量到的γ-壬內(nèi)酯、4種糖以及5種糖醇類，但含量較低，合計(jì)只有幾百μg/L。

表5 芝麻香型手工原酒與機(jī)械原酒中酚類、縮醛類、內(nèi)酯類、糖醇及糖類化合物的平均含量Table 5 Average contents of the phenols, acetal, lactone, sugar alcohols, and sugars in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

從各類物質(zhì)總量來(lái)看，兩工藝原酒中酚類總量差別最大，與手工原酒相比，機(jī)械化的優(yōu)級(jí)及一級(jí)原酒中酚類總量分別上升174.2%(優(yōu)級(jí))和373.1%(一級(jí))。從單個(gè)化合物來(lái)看，相比優(yōu)級(jí)手工原酒，優(yōu)級(jí)機(jī)械原酒中4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量上升明顯，分別上升339.0%和163.1%，而1,1,3-三乙氧基丙烷含量下降最多，下降了57.3%。同樣地，一級(jí)機(jī)械原酒中4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量相比一級(jí)手工原酒上升明顯，分別上升537.5%和408.1%，而1,1,3-三乙氧基丙烷含量下降67.1%。

雖然手工原酒與機(jī)械原酒中檢測(cè)到的化合物種類一致，但兩個(gè)工藝原酒中部分化合物含量存在明顯差別，這可能是由于白酒手工工藝與機(jī)械化釀造過(guò)程給釀酒微生物提供的環(huán)境存在差別，進(jìn)而影響它們的生長(zhǎng)代謝造成，但差異主要是在哪個(gè)工藝階段產(chǎn)生的，還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究采用GC-FID、LLME-GC-MS、UPLC和HMDS衍生化方法，在芝麻香型手工原酒與機(jī)械原酒中均檢測(cè)到94種化合物。無(wú)論酒樣等級(jí)，手工原酒的化合物總量高于機(jī)械原酒；傳統(tǒng)手工釀造原酒中酯類、醇類、呋喃類、縮醛類、糖和糖醇物質(zhì)含量相對(duì)較高，而機(jī)械化釀造原酒中酸類、酚類和內(nèi)酯類物質(zhì)含量相對(duì)較高。對(duì)比兩個(gè)工藝酒的微量成分，發(fā)現(xiàn)白酒經(jīng)過(guò)機(jī)械化釀造后，4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2-羥基丁酸和2-糠醇的含量明顯上升，1,1,3-三乙氧基丙烷、乳酸丁酯、3-羥基丁酸、正丁醇、糠醛、丁酸異戊酯、丁酸-2-苯乙酯和3-羥基丙酸的含量明顯下降。接下來(lái)研究將從白酒手工與機(jī)械化釀造工藝過(guò)程(如原料、制曲、發(fā)酵、蒸餾等)跟蹤分析這些差異物質(zhì)的含量，確定產(chǎn)生差異的原因或某個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。