張蕾　阮羽萱　潘嬌　陳敏　劉博宇　阮穎　黃勇

摘要：甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）是我國(guó)主要油料作物之一，為國(guó)家糧油安全提供了重要保障。干旱嚴(yán)重限制了油菜種植規(guī)模擴(kuò)大、產(chǎn)量與品質(zhì)提升。為挖掘甘藍(lán)型油菜抗旱的關(guān)鍵基因，闡明油菜耐旱機(jī)制，本研究以甘藍(lán)型油菜湘油15為對(duì)象，通過實(shí)驗(yàn)室模擬干旱處理后的葉片為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）、生物信息分析并 qRT-PCR 驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組樣本平均Clean baseas約為9.6 G，且各樣品堿基百分比（Q30）大于93.21%，比對(duì)到參考基因組上的Reads在89％以上。干旱處理4 h后，湘油15出現(xiàn)了440個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中148個(gè)基因上調(diào)，292個(gè)基因下調(diào)。隨機(jī)選取10個(gè)基因（上調(diào)與下調(diào)各5個(gè)）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其中9個(gè)基因的qRT-PCR結(jié)果與 RNA-Seq結(jié)果相符，僅1個(gè)基因表達(dá)趨勢(shì)相反，相似度可達(dá)90％，證實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明甘藍(lán)型油菜湘油15主要通過光合作用、碳代謝和滲透調(diào)節(jié)等途徑調(diào)節(jié)抗旱能力，為進(jìn)一步闡明油菜耐旱機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜；干旱脅迫；轉(zhuǎn)錄組分析；差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)：S634.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）05-0051-05

干旱是全球發(fā)生頻率最高、影響范圍最廣、對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失的自然災(zāi)害［1-2］。油菜是我國(guó)種植面積最廣、產(chǎn)量最高的油料作物之一［3］，其中甘藍(lán)型油菜是廣泛種植于長(zhǎng)江中下游區(qū)域的油菜品種，但其整個(gè)生長(zhǎng)期對(duì)水的依賴性較強(qiáng)，耐旱性較差。干旱極大地影響了油菜的發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重威脅人類的糧油安全［4］。

當(dāng)遭受干旱脅迫時(shí)，植物在一定程度上能夠通過自身調(diào)節(jié)適應(yīng)環(huán)境的變化。氣孔是植物散失水分的主要途徑，當(dāng)植物處于干旱脅迫下，將調(diào)控葉片氣孔閉合以降低蒸騰作用，從而減少植物體內(nèi)水分流失，進(jìn)而影響光合作用與碳代謝［5］。此外，植物細(xì)胞中的一些離子和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)將累積以維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)和滲透調(diào)節(jié)平衡，從而使自身保存水分的能力保持在較高的水平［6］。當(dāng)植物處于逆境脅迫下，細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂，大量積累的活性氧破壞了生物膜的結(jié)構(gòu)，影響其功能的正常發(fā)揮，嚴(yán)重時(shí)危害細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致植株死亡［7］。為減輕活性氧積累帶來的影響，作物進(jìn)化出復(fù)雜的酶和抗氧化劑系統(tǒng)，如低分子抗氧化劑和活性氧清除酶［8］。

轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是生物基因表達(dá)的主要調(diào)控方式之一，是對(duì)生物進(jìn)行研究的關(guān)鍵組成部分［9］。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使研究者能夠更有效地研究不同處理?xiàng)l件或不同發(fā)育過程中基因的差異表達(dá)譜，篩選新的功能基因［10-12］。在本研究中，用20％聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱脅迫處理甘藍(lán)型油菜湘油15，借助高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析，篩選干旱處理誘導(dǎo)表達(dá)基因信息，初步挖掘耐旱基因和代謝通路，構(gòu)建抗旱性相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為甘藍(lán)型油菜耐旱機(jī)制提供理論依據(jù)，為培育耐旱品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和干旱處理

植物材料為甘藍(lán)型油菜湘油15，先將其種子進(jìn)行表面消毒，后播種于含有霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液的蛭石中，溫室條件下正常生長(zhǎng)45 d（25 ℃，16 h/8 h 光照/黑暗，光照強(qiáng)度為10 000 lx，濕度為40％～60％），長(zhǎng)出3～4片真葉后小心洗去蛭石，置于霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中并充氣，光照培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)3 d，根據(jù)營(yíng)養(yǎng)液體積，加入20％聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱脅迫，處理時(shí)間為4 h。選取生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致的5株植株進(jìn)行混合取樣，處理前的樣品編號(hào)為C1、C2、C3，處理后的樣品編號(hào)為T1、T2、T3。樣本于液氮中速凍，保存于-80 ℃中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

2021年7月21日于湖南省作物表觀遺傳與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

樣品由百邁克生物科技（長(zhǎng)沙）有限公司進(jìn)行RNA提取、質(zhì)量分析、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析［13］。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選和分析

首先對(duì)樣品中Mapped Reads數(shù)目與轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度歸一化，以FPKM方法作為檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)［14］。時(shí)間和空間特異性是基因表達(dá)的2個(gè)特性，當(dāng)處于不同的條件下，表達(dá)水平具有顯著差異的基因或轉(zhuǎn)錄本稱為差異表達(dá)基因（DEGs）。根據(jù)不同樣品間的相對(duì)表達(dá)水平，可將DEGs劃分為下調(diào)基因和上調(diào)基因。利用R語言 DESeq2 程序包對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選來獲得DEGs，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：差異倍數(shù)（fold change，簡(jiǎn)稱FC）大于2，即|log2FC|≥1；錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，簡(jiǎn)稱FDR）小于0.01［15］，F(xiàn)DR是通過對(duì)差異顯著性P值（p-value）進(jìn)行校正得到的，即p-value＜0.01。使用 Blast2GO軟件對(duì)差異基因進(jìn)行基因功能注釋。

1.5 通過qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)

隨機(jī)選取10個(gè)DEGs（上、下調(diào)基因各5個(gè)）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析（qRT-PCR）驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中差異基因表達(dá)的準(zhǔn)確性。通過Trizol法提取轉(zhuǎn)錄組測(cè)序備份樣品的總RNA，每樣品取1 ng RNA通過擎科生物cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄，最終cDNA體積為20 μL。qPCR引物設(shè)計(jì)見表1。qRT-PCR使用Applied Biosystems 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，使用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)定量數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析對(duì)照組和干旱處理試驗(yàn)組各3個(gè)樣本。高通量測(cè)序后，為保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到clean reads。整體上分析，干旱處理組和對(duì)照組的3個(gè)重復(fù)平均reads數(shù)分別約為34 094 369、30 190 757，樣本平均堿基數(shù)約為9.6 G，且各樣品Q30堿基百分比在93.21%及以上，GC含量為47.57%～48.8%。使用 HISAT2比對(duì)系統(tǒng)分析得到，各樣品reads與參考基因組的比對(duì)效率在89.18%～91.65%（表2）。整體測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

2.2 差異表達(dá)基因分析

利用DESeq2對(duì)甘藍(lán)型油菜各樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P值<0.01且差異倍數(shù)|log2FC|≥1作為顯著差異表達(dá)基因的篩選條件。從圖1可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組（C vs T）中鑒定到DEGs共有440個(gè)，其中148個(gè)DEGs表達(dá)上調(diào)，292個(gè)DEGs表達(dá)下調(diào)。

2.3 差異表達(dá)基因GO分析

以P≤0.01為標(biāo)準(zhǔn)將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋。根據(jù)差異基因?qū)?yīng)的生物過程、分子功能和細(xì)胞組分的不同，分別進(jìn)行 GO 富集分析。數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，生物過程主要集中在韌皮部蔗糖的裝載、

應(yīng)對(duì)鎘離子、磷酸戊糖分流、糖酵解、葉綠體移動(dòng)等（圖2-A）；分子功能主要集中在果糖二磷酸醛縮酶活性、磷酸核酮糖激酶活性、吡哆醛磷酸的結(jié)合等（圖2-B）；細(xì)胞組分主要集中在胞質(zhì)核糖體、質(zhì)膜、質(zhì)外體、葉綠體被膜等（圖2-C）。結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜在干旱脅迫下的差異表達(dá)基因主要與植物生長(zhǎng)發(fā)育如光合作用和糖代謝過程有關(guān)。甘藍(lán)型油菜可以通過體內(nèi)細(xì)胞全方位的協(xié)調(diào)作用來減少外部惡劣環(huán)境對(duì)植物體所造成的傷害，同時(shí)調(diào)節(jié)內(nèi)部代謝活動(dòng)以保證植物的基本生長(zhǎng)。

2.4 差異表達(dá)基因KEGG分析

為分析在干旱脅迫下甘藍(lán)型油菜發(fā)育過程中體內(nèi)代謝途徑的變化，對(duì)差異基因進(jìn)行 KEGG 分類統(tǒng)計(jì)（P<0.01）。這些差異基因主要富集通路包括碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、氨基酸生物合成和代謝、磷酸戊糖途徑（圖3）。代謝途徑分析表明，干旱脅迫對(duì)甘藍(lán)型油菜的碳代謝、氨基酸代謝有影響。

2.5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取上調(diào)與下調(diào)各5個(gè)差異表達(dá)基因驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，通過qRT-PCR驗(yàn)證干旱處理前后的表達(dá)水平，將所選基因的相對(duì)表達(dá)與RNA-seq分析的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，qRT-PCR結(jié)果的相對(duì)趨勢(shì)與RNA-seq數(shù)據(jù)基本一致，證明本研究RNA-seq結(jié)果的可靠性（圖4）。

3 討論與結(jié)論

光合作用直接影響作物生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量，干旱環(huán)境中光合作用強(qiáng)度是衡量作物抗旱能力的重要依據(jù)［16-17］。筆者發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因GO和KEGG注釋到的結(jié)果與光合作用、碳代謝、滲透調(diào)節(jié)有關(guān)，研究結(jié)果與前人在不同物種的發(fā)現(xiàn)較為一致。研究發(fā)現(xiàn)，棉花［18-19］和蘇丹草［20］干旱轉(zhuǎn)錄組的KEGG代謝通路顯著富集于光合作用中。對(duì)梭梭［21］和甘藍(lán)型油菜［22］的干旱轉(zhuǎn)錄組分析表明，其KEGG富集于碳代謝等過程。碳水化合物可以為逆境下的植物提供基本能量以維持正常生命活動(dòng)，同時(shí)還可以作為體內(nèi)信號(hào)分子調(diào)節(jié)一系列代謝反應(yīng)以適應(yīng)不利環(huán)境［23］。植物受到水分脅迫時(shí)，滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)會(huì)改變植物的物質(zhì)代謝過程，一些大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、淀粉等會(huì)分解成小分子有機(jī)物如可溶性糖和氨基酸等［24］，它們能作為滲透調(diào)節(jié)因子保持植物體內(nèi)滲透壓的平衡，保護(hù)逆境環(huán)境中的植物細(xì)胞。對(duì)干旱脅迫棉花的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，差異表達(dá)基因顯著富集在滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)上［13］。

在干旱脅迫期間，為通過調(diào)節(jié)細(xì)胞過程在干旱條件下生存，植物中的基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化［25］。通過差異基因表達(dá)方法闡明植物的耐旱性，為確定可能的耐旱機(jī)制提供了有價(jià)值的信息。對(duì)低溫脅迫下云霧貢茶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選并鑒定了差異基因CsPPO具有提高植物耐寒性的功能［26］。對(duì)鹽堿脅迫下的紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組分析篩選到差異基因MsNAC47，對(duì)其功能研究發(fā)現(xiàn)MsNAC47通過調(diào)控鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)使植物抵御鹽堿脅迫［27］。在本研究中，PEG-6000模擬干旱處理前后湘油15共有440個(gè)DEGs，其中148個(gè)表達(dá)上調(diào)，292個(gè)表達(dá)下調(diào)， 并隨機(jī)對(duì)其中10個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。

雖然結(jié)果與RNA-seq檢測(cè)的基因表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)存在差異，但這兩者的趨勢(shì)基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序富集到DEGs數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的，推測(cè)此DEGs對(duì)于甘藍(lán)型油菜抗旱有調(diào)控作用，可以進(jìn)行基因克隆與功能驗(yàn)證等深入研究。

項(xiàng)目有效地篩選了甘藍(lán)型油菜湘油15干旱脅迫響應(yīng)基因，這些基因主要調(diào)控光合作用、碳代謝和滲透調(diào)節(jié)等過程，研究結(jié)果為闡明甘藍(lán)型油菜的耐旱機(jī)制提供了參考。

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收稿日期：2022-06-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：31971834）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（編號(hào)：19B266）。

作者簡(jiǎn)介：張 蕾（1998—），女，湖南衡陽人，碩士研究生，從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：zl8398@163.com。

通信作者：黃 勇，博士，教授，從事分子生物學(xué)研究。E-mail：yonghuang@hunau.edu.cn。