趙 妍，陳 娟，袁 倩，王子卉，朱小輝，郝征紅，畢文慧*，任長博，孟維國

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250100；2.山東省十里香芝麻制品股份有限公司，山東 濱州 251900）

酯酶是一類能催化酯鍵斷裂和形成的酶，在脂肪分解和酯類物質(zhì)合成方面具有重要作用，廣泛應(yīng)用于果酒釀造、果蔬制品風(fēng)味改良等精深加工領(lǐng)域[1]。現(xiàn)有酯酶主要來源于微生物，自然界中能產(chǎn)生酯酶的微生物資源十分豐富，如青霉、鐮孢霉、曲霉、酵母菌、梨頭霉等真菌，及假單胞菌、粘質(zhì)賽氏桿菌、無色桿菌和葡萄球菌等細(xì)菌。另外，少數(shù)放線菌也能分泌酯酶[2-3]。其中，細(xì)菌因能產(chǎn)生種類多、產(chǎn)量大、純度高的酯酶，已成為工業(yè)酯酶的主要來源。酯酶根據(jù)其最適反應(yīng)溫度可分為常溫酯酶和嗜熱酯酶。在果蔬精深加工過程中，嗜熱酯酶比常溫酯酶更具優(yōu)勢，其可以在高溫下完成催化，且在高鹽、有機(jī)溶劑存在的反應(yīng)環(huán)境中具有更高的穩(wěn)定性，因此在加工過程中應(yīng)用嗜熱酯酶可有效防止生產(chǎn)污染，保證產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定[4]。嗜熱酯酶具有極高的行業(yè)應(yīng)用需求，但許多已知嗜熱酯酶存在產(chǎn)量低、熱穩(wěn)定性差等問題，不能滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。目前能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)并且能夠量產(chǎn)的酯酶種類較少，因此還需要從環(huán)境中不斷篩選高活性、高穩(wěn)定性、產(chǎn)酶量大的候選工業(yè)酯酶，以滿足果蔬精深加工等食品行業(yè)的需求[5]。

芝麻廢棄物、畜禽糞便等資源不及時(shí)處理會(huì)造成環(huán)境污染，如果以其為肥源進(jìn)行堆肥，能夠起到資源節(jié)約和環(huán)境保護(hù)的重要作用。以芝麻廢棄物、畜禽糞便為原料進(jìn)行堆肥，其高溫期溫度可達(dá)50～70 ℃，為嗜熱微生物營造了一個(gè)優(yōu)良生境，且這些原料中油脂含量偏高，更易于誘導(dǎo)產(chǎn)酯酶微生物的生長[6]，并有望篩選到高活性產(chǎn)嗜熱酯酶的菌株。本試驗(yàn)采用鑒別平板篩選法從堆肥樣品中篩選產(chǎn)嗜熱酯酶微生物，并對篩選菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行了研究，以期為工業(yè)酯酶生產(chǎn)菌種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCR 引物、DNA marker、PCR 預(yù)混液、DNA loading buffer、瓊脂糖、SDS、CTAB，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR Clean-Up kit，Promega 生物技術(shù)有限公司；GenGreen 核酸染料，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏染色液，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、LB 肉湯、可溶性淀粉培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯、明膠培養(yǎng)基、西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、Kovacs 氏靛基質(zhì)試劑、胰蛋白胨水培養(yǎng)基、V-P 試驗(yàn)試劑盒、甲基紅試驗(yàn)試劑盒、硝酸鹽還原試劑盒、硝酸鹽肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司；石蕊，天津光復(fù)試劑有限公司；三丁酸甘油酯、乙二胺四乙酸二鈉鹽、NaCl 等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、10 mL 三丁酸甘油酯、瓊脂15.0 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)液：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、5 mL 三丁酸甘油酯、蒸餾水100 0mL、pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器與設(shè)備

TC-S Gene Max 基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；Nanodrop One 超微量核酸蛋白質(zhì)測定儀，賽默飛世爾科技公司；ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；DMi8 倒置生物顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；TGL-16 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)嗜熱酯酶微生物的初篩與純化

將芝麻廢棄物堆肥高溫期樣品接種于LB 肉湯中，于55 ℃振蕩培養(yǎng)3 d。將活化后的菌懸液梯度稀釋后，涂布于含1%三丁酸甘油酯的LB 平板上，于55 ℃下培養(yǎng)24 h。從初篩平板上挑取不同形態(tài)、具有明顯水解圈的單菌落進(jìn)行分離純化，直至獲得純培養(yǎng)物[7]。

1.4.2 高活性產(chǎn)嗜熱酯酶微生物的篩選

分別測量純化后各單菌落的水解圈直徑和菌落直徑，計(jì)算水解圈直徑與菌落直徑的比值（hydrolysis circle，HC），選取HC 值最大的菌株再次純化并進(jìn)行菌種鑒定[8]。

1.4.3 產(chǎn)嗜熱酯酶細(xì)菌的鑒定試驗(yàn)

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選到的菌株點(diǎn)接于篩選培養(yǎng)基平板，55 ℃下培養(yǎng)24 h 后觀察菌落形態(tài)。同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體顏色、形態(tài)[9]。

（2）生理生化鑒定

通過淀粉水解試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)、石蕊試驗(yàn)檢測篩選菌株的生理生化特性[10-11]。

（3）分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB 法提取菌株基因組DNA，挑取一環(huán)純培養(yǎng)物于1 mL 無菌水中，混勻后在4℃、14 000 r/min 條件下離心1 min。將沉淀轉(zhuǎn)移到含有1.35 mL 裂解液（100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA-Na+、100 mmol/L磷酸鈉、1.5 mol/L NaCl、1% CTAB，pH 8.0）和150 μL 20% SDS的離心管中，輕輕混勻，放置在65 ℃恒溫水浴鍋中水浴2 h，每20 min 反轉(zhuǎn)混勻，水浴結(jié)束后在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min，取上清液。在上清液中加入900 μL 異丙醇沉淀1 h，在4 ℃、14 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清液。在含有沉淀的離心管中加入700 μL 75%乙醇，在4 ℃、14 000 r/min、離心2 min，棄上清液。取100 μL無菌水溶解DNA。測定DNA 濃度并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[12]。使用通用引物27F-5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′和1492R-5′-ACGGY TACCTTG TTACG ACTT-3′，采用馮廣達(dá)等[13]PCR 反應(yīng)體系和運(yùn)行程序進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增。按照PCR Clean-Up kit 的操作程序回收擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR 產(chǎn)物送至上海鉑尚生物技術(shù)公司測序。測序結(jié)果運(yùn)用DNAman 進(jìn)行序列拼接，BLAST 進(jìn)行序列比對，并將序列提交至Genbank 數(shù)據(jù)庫（Genbank No.MZ203594），利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.4.4 菌株最適培養(yǎng)條件

（1）最適培養(yǎng)溫度的測定

將菌株GRJ 2 接種至LB 培養(yǎng)液中，分別放置于50、55、60、65、70、75 ℃下培養(yǎng)16 h，測定OD600nm以確定最適生長溫度。

（2）最適培養(yǎng)pH 值的測定

將菌株GRJ 2 接種至LB 培養(yǎng)液中，調(diào)整培養(yǎng)液初始pH 為4、5、6、7、8、9，在最適培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)16 h，測定OD600nm以確定最適生長pH。

1.4.5 菌株生長曲線的測定

將菌株GRJ 2 以1%接種量接種至LB 培養(yǎng)液中，在最適溫度、pH 條件下培養(yǎng)，每隔2 h 取樣并測定OD600nm，繪制生長曲線。

1.4.6 產(chǎn)酶曲線檢測

（1）分批培養(yǎng)

將菌株GRJ2 以1%接種量接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，55℃下連續(xù)培養(yǎng)，分別在0、4、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28 h 時(shí)取發(fā)酵液，離心制備粗酶液。

（2）連續(xù)培養(yǎng)

方法同分批培養(yǎng)，在培養(yǎng)至14 h 時(shí)，補(bǔ)加10%新鮮產(chǎn)酶培養(yǎng)液（5 倍濃縮）[15]。

（3）酯酶活性測定

采用對硝基苯酚法，以對硝基苯酚丁酸酯為底物測定酶活[16]。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=4.16x-0.0038（R2=0.9992）。1 個(gè)酶活力單位定義為1 min 釋放1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，P＜0.05 說明數(shù)據(jù)間差異顯著；使用Origin 2021 軟件繪制柱狀圖和點(diǎn)線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高活性產(chǎn)嗜熱酯酶微生物的篩選

產(chǎn)嗜熱酯酶微生物具有分解三丁酸甘油酯的能力，在含有三丁酸甘油酯的培養(yǎng)基中生長會(huì)在菌落周圍形成明顯的透明水解圈，水解圈直徑與菌落直徑之間的比值越大，代表微生物的活力越大[17]。通過篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5 株菌可見明顯透明水解圈，其中GRJ 2 菌株HC 值為3.0，其HC 值最大，說明酯解能力最強(qiáng)（表1）。

表1 產(chǎn)嗜熱酯酶細(xì)菌菌落HC 值Table 1 HC value of colony of thermophilic esterase producing bacteria

2.2 產(chǎn)嗜熱酯酶微生物鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果

菌株GRJ 2 在平板上形成的單菌落呈乳白色，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，在菌落周圍可見明顯的透明水解圈，符合產(chǎn)嗜熱酯酶微生物在三丁酸甘油酯選擇培養(yǎng)基上生長的典型菌落形態(tài)特征[17]（圖1A）；革蘭氏染色呈陽性，菌體為桿狀（圖1B）。

圖1 菌株平板菌落特征（A）及革蘭氏染色結(jié)果（B）Fig.1 Properties of bacterial colony (A) and gram staining results (B)

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》，菌株GRJ 2 生理生化結(jié)果（見表2）符合芽孢桿菌屬特性[11]。

表2 篩選菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification of isolated strain

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以菌株GRJ 2 基因組DNA 為模板，擴(kuò)增16S rRNA基因，PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示菌株GRJ 2 獲得約1 500 bp 的單一條帶，可用于菌株測序鑒定（圖2A）。GRJ 2 菌株測序結(jié)果經(jīng)序列拼接獲得一段1 450 bp 的基因片段，Blast比對后發(fā)現(xiàn)該基因片段與嗜熱淀粉芽孢桿菌（C.thermoamylovorans）的16S rRNA 基因相似度為99.73%。結(jié)合其形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株GRJ 2為嗜熱淀粉芽孢桿菌（C.thermoamylovorans），其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2B。

圖2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of molecular biological

2.3 菌株發(fā)酵特性

2.3.1 菌株最適發(fā)酵條件

由圖3A（見下頁）可知，溫度對菌株GRJ 2 生長的影響較為明顯，菌株GRJ 2 在50～65 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長；但當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，生長明顯受抑制。在同樣培養(yǎng)時(shí)長內(nèi)，55 ℃條件下菌懸液吸光度最高，說明菌株濃度最高、生長最快，由此確定菌株的最適生長溫度為55 ℃。菌株可以在pH 5～9 范圍內(nèi)生長，對酸、堿性環(huán)境都有一定耐受能力，但是在同樣培養(yǎng)條件下，pH 為7 時(shí)菌株生長最快，因此菌株GRJ 2 最適生長pH 值為7。

圖3 菌株最適培養(yǎng)溫度（A）及pH（B）Fig.3 Optimum incubation temperature (A) and pH (B) of strain

2.3.2 最適發(fā)酵條件下菌株生長及產(chǎn)酯酶特性

生長曲線可以反應(yīng)細(xì)菌在發(fā)酵期間生長變化趨勢，從而確定種子液制備時(shí)間[18]，圖4（見下頁）為在最適培養(yǎng)溫度和pH 條件下（55 ℃、pH 7）菌株GRJ 2 的生長曲線與產(chǎn)酶曲線。發(fā)酵前0～4 h 為菌株生長延遲期，細(xì)菌增殖速度較為緩慢；4～14 h 菌株快速增殖，處于對數(shù)生長期；培養(yǎng)16 h 后，在不添加新鮮培養(yǎng)液的情況下進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞數(shù)量逐漸下降。該菌株培養(yǎng)10 h（OD600nm=0.52）即達(dá)到適宜細(xì)胞濃度，可作為種子液用于發(fā)酵生產(chǎn)（圖4A）。

圖4 菌株GRJ 2 生長曲線（A）與產(chǎn)酶曲線（B）Fig.4 Growth curve (A) and enzyme production curve (B) of GRJ 2

產(chǎn)酶曲線表征發(fā)酵過程中酯酶分泌情況，用于確定產(chǎn)物收獲期[19]。在分批培養(yǎng)12 h 后開始大量產(chǎn)酶，至第18 h 酶活達(dá)最高3.87 U/mL，相較來源于Acinetobacterjohnsonii菌株的酯酶活性更高[20]。嗜熱酯酶最佳收獲時(shí)間為16～22 h；在培養(yǎng)至14 h 時(shí)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液，可以將產(chǎn)酶期延長4 h，該菌株適合于連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)嗜熱酯酶（圖4B）。

3 小結(jié)

采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)酯酶微生物篩選，可以獲得更加穩(wěn)定、高產(chǎn)的菌株，利用菌株發(fā)酵生產(chǎn)酯酶，實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的可行性較強(qiáng)[21]。本研究從堆肥高溫期樣品中分離、篩選得到產(chǎn)嗜熱酯酶菌株GRJ 2，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)鑒定，該菌株為嗜熱淀粉芽孢桿菌（C.thermoamylovorans）。該菌株可以在50～65 ℃條件下生長，最適生長溫度為55 ℃；可耐受酸、堿性環(huán)境，最適生長pH 為7。該菌株作為種子液只需活化10 h 即可達(dá)到較高菌種濃度，培養(yǎng)16 h 后即可收獲酯酶，并且在連續(xù)培養(yǎng)條件下可以顯著延長酯酶收獲時(shí)間。本菌株可以經(jīng)誘變育種進(jìn)一步提升其產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶活性，也可改造為底盤微生物用于工業(yè)化嗜熱酯酶生產(chǎn)，以滿足果蔬精深加工等食品領(lǐng)域不斷增長的嗜熱酯酶需求。