張素冰 趙濱濱 張丹琦

心肌缺血再灌注損傷是一種常見的心血管疾病病理過程,研究表明麻醉藥物可減緩心肌缺血再灌注導致的心肌細胞損傷[1,2]。麻醉藥物可通過抑制炎性反應及細胞凋亡等過程而減輕缺氧/復氧(H/R)誘導的心肌細胞損傷[3,4]。丙泊酚是常用的一種靜脈麻醉藥物,并可廣泛用于心血管手術(shù)麻醉,研究表明丙泊酚可減輕H/R誘導的海馬神經(jīng)元細胞損傷[5]。但丙泊酚對H/R誘導的心肌細胞損傷的分子機制尚未明確。微小RNA(miRNA)在細胞損傷中可發(fā)揮重要調(diào)控作用,研究表明,miR-21-3p在大鼠缺血性腦損傷中表達水平升高,抑制其表達可減輕大鼠缺血性腦損傷[6]。然而,miR-21-3p 在 H/R 引起的心肌細胞損傷中的作用機制尚未明確。關(guān)于丙泊酚與miR-21-3p調(diào)控作用對心肌缺血再灌注損傷尚不清楚,基于此,本研究通過構(gòu)建體外心肌缺血再灌注損傷模型,探究丙泊酚能否通過調(diào)節(jié)miR-21-3p表達抑制H/R誘導的心肌細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒、miRNA提取試劑盒(齊一生物科技有限公司);LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(美國Invitrogen);miR-NC、miR-21-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-21-3p(廣州銳博生物);大鼠心肌細胞H9C2(上海滬震實業(yè)有限公司);IL-6、TNF-α、IL-1β檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物);細胞凋亡檢測試劑盒、CCK-8試劑(上海撫生實業(yè)有限公司);內(nèi)參GAPDH與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、兔抗鼠Bax、Bcl-2抗體(美國Abcam)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:H9C2細胞在37℃、體積分數(shù)5% CO2、95% N2培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧處理6 h,更換為含10%胎牛血清的DMEM正常培養(yǎng)基,接著于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)復氧處理6 h[7],記為H/R組。con組:在37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)H9C2細胞相同時間,不進行任何處理。分別用含有不同濃度(12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)的丙泊酚的DMEM培養(yǎng)基處理24 h[8],然后進行H/R處理,分別記為H/R+低丙泊酚組、H/R+中丙泊酚組、H/R+高丙泊酚組。anti-miR-NC、anti-miR-21-3p用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent分別轉(zhuǎn)染至H9C2細胞,轉(zhuǎn)染成功后進行H/R處理,分別記為H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-21-3p組。miR-NC、miR-21-3p mimics用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent分別轉(zhuǎn)染至H9C2細胞,轉(zhuǎn)染成功后用含有50 μmol/L丙泊酚的DMEM培養(yǎng)基處理24 h,然后進行H/R處理,分別記為H/R+高丙泊酚+miR-NC組、H/R+高丙泊酚+miR-21-3p組。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖:將各組H9C2細胞接種于96孔板(1×103細胞/孔),每孔加入10 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)2 h后測定吸光度值(OD 450 nm),用酶標儀檢測每個孔的濃度。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率:各組H9C2細胞添加預冷PBS洗滌,后棄上清,加500 μl Binding Buffer重懸細胞,按凋亡檢測試劑盒指南測細胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR檢測miR-21-3p的表達水平:提取H9C2細胞總RNA,借助紫外分光光度計測RNA濃度。RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板擴增qRT-PCR,反應條件:95℃預變性2 min,95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循環(huán)40次。以ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀測miR-21-3p相對表達量。

1.2.5 ELISA法檢測IL-6、TNF-α、IL-1β的水平:收集各組H9C2細胞培養(yǎng)上清液,按照試劑盒指南以ELISA法測定TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

1.2.6 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達量:提取細胞總蛋白,以BCA法分析蛋白濃度,于蛋白樣品中添加SDS上樣緩沖液,經(jīng)沸水煮10 min后取40 μg蛋白,行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜、封閉2 h,補充Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)一抗、內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)稀釋液,4℃孵育過夜,再用稀釋的二抗室溫孵育1 h,加ECL顯影,用ImageJ軟件對各條帶進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2損傷的影響 同con組比較,H/R組細胞增殖抑制率、Bax蛋白水平、細胞凋亡率較高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平較低(P<0.05);與H/R組比較,H/R+低丙泊酚組、H/R+中丙泊酚組、H/R+高丙泊酚組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見圖1,表1。

2.2 丙泊酚對缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2中miR-21-3p表達及炎性因子的影響 同con組比較,H/R組miR-21-3p表達升高(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β的水平升高(P<0.05);與H/R組比較,H/R+低丙泊酚組、H/R+中丙泊酚組、H/R+高丙泊酚組miR-21-3p的表達水平降低(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β的水平降低(P<0.05),且呈劑量依賴性。見表2。

2.3 miR-21-3p轉(zhuǎn)染效果的檢測 與miR-NC組比較,miR-21-3p組miR-21-3p的表達量升高(P<0.05);與anti-miR-NC組比較,anti-miR-21-3p組miR-21-3p的表達量降低(P<0.05)。見表3。

圖1 丙泊酚對缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響

表1 丙泊酚對缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2損傷的檢測 n=9,

表2 丙泊酚對缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2中miR-21-3p表達及炎性因子的檢測 n=9,

表3 miR-21-3p表達的檢測 n=9,

2.4 抑制miR-21-3p對缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2損傷及炎性因子的影響 與H/R+anti-miR-NC組比較,H/R+anti-miR-21-3p組細胞增殖抑制率、Bax蛋白水平、細胞凋亡率下降(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β降低(P<0.05),Bcl-2蛋白升高(P<0.05)。見表4,圖2。

表4 抑制miR-21-3p對缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2損傷及炎性因子的檢測 n=9,

圖2 抑制miR-21-3p對缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響;A 蛋白圖;B 凋亡圖

2.5 miR-21-3p對丙泊酚處理的缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2損傷及炎性因子的影響 與H/R+高丙泊酚+miR-NC組比較,H/R+高丙泊酚+miR-21-3p組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β的水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 miR-21-3p對丙泊酚處理的缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響;A 凋亡圖;B 蛋白圖

表5 miR-21-3p對丙泊酚處理的缺氧/復氧誘導心肌細胞H9C2損傷及炎性因子的檢測 n=9,

3 討論

心肌細胞凋亡、炎性反應與心肌缺血再灌注損傷有關(guān),如何減輕心肌缺血再灌注損傷成為治療心血管疾病的關(guān)鍵,麻醉藥物可通過抑制心肌細胞凋亡等緩解心肌缺血再灌注損傷[9]。在H/R誘導的心肌細胞損傷中miRNA表達異常,并可通過調(diào)控靶基因表達而參與心肌缺血再灌注損傷[10,11]。但miRNA是否可作為麻醉藥物治療心血管疾病的潛在靶點尚未完全闡明。

丙泊酚可減輕高糖誘導的心肌細胞損傷[12]、胃黏膜上皮細胞損傷[13]。本研究結(jié)果顯示,H/R誘導的心肌細胞增殖能力降低、細胞凋亡能力增強,與既往研究報道結(jié)果相似[14],隨著丙泊酚濃度的升高,細胞增殖能力得到恢復、細胞凋亡能力得到抑制,說明丙泊酚對H/R誘導的心肌細胞增殖有促進作用,對細胞凋亡有抑制作用。本研究還顯示,H/R誘導的心肌細胞中IL-6、TNF-α、IL-1β的水平升高,與既往研究報道[15]結(jié)果相似,丙泊酚能夠以濃度依賴性方式降低IL-6、TNF-α、IL-1β水平,提示丙泊酚可抑制H/R誘導的心肌細胞炎性反應。

miR-21-3p在H/R誘導的神經(jīng)細胞中表達水平升高,抑制其表達可抑制H/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡[16]。miR-21-3p表達下調(diào)可減輕急性出血性壞死性胰腺炎大鼠損傷[17]。miR-21-3p表達上調(diào)可通過靶向調(diào)控MAT2B而促進腦微血管內(nèi)皮細胞凋亡及炎性反應從而加重血腦屏障損傷[18]。本研究結(jié)果表明,H/R誘導的心肌細胞中miR-21-3p的表達水平異常升高,丙泊酚可干擾miR-21-3p表達,抑制miR-21-3p表達可促進H/R誘導的心肌細胞增殖及抑制細胞凋亡、炎性反應,而miR-21-3p過表達可抑制丙泊酚對H/R誘導的心肌細胞增殖、凋亡及炎性反應的影響。

綜上所述,丙泊酚可通過下調(diào)miR-21-3p表達而促進H/R誘導的心肌細胞增殖及抑制細胞凋亡、炎性反應,miR-21-3p可能作為丙泊酚減輕心肌缺血再灌注損傷的潛在靶點,但關(guān)于其具體作用機制仍需進一步探究。