岳萬勇 農(nóng)國旺 潘光澤 田文梅 張學(xué)亮 陳光健 張飛 喻國丹

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病,如潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)或克羅恩病。其中,與成人患者相比,UC兒科患者的疾病范圍、嚴(yán)重程度和進(jìn)展情況明顯更大、更廣[1,2]。盡管目前針對成人UC的外科治療已經(jīng)得到充分的研究,但并不完全適用于兒童[3]。因此,為了治愈兒童UC,探究其發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。miRN通過與目標(biāo)mRNA中的互補(bǔ)序列配對并干擾其穩(wěn)定性和翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá),在包括UC在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4]。據(jù)報道,miR-27a在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,是一種新型的生物標(biāo)志物和潛在的腫瘤治療靶點[5]。此外,有研究證實,miR-27a參與UC的發(fā)生發(fā)展[6]。然而,對于miR-27a在UC中的調(diào)控、作用和靶點的理解仍然有限。在本研究中,假設(shè)miR-27a在腸道炎癥中具有重要作用,使用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6- trinitro picrylsulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)實驗小鼠UC模型[7]。本研究探索miR-27a在TNBS誘導(dǎo)的UC中的作用,并研究miR-27介導(dǎo)的腸道炎癥的潛在機(jī)制,為從實驗室到臨床識別和治療UC提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)小鼠:SPF級幼年雄性C57BL/6小鼠(4周齡,16～20g)購自昆明醫(yī)科大學(xué),許可證號:SCXK(滇)K2020-0006。本研究符合《實驗動物護(hù)理和使用指南》。所有涉及動物的實驗程序均經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。(2)主要試劑:TNBS由Sigma-Aldrich提供,貨號:P2297;蘇木精-伊紅染色試劑盒由武漢賽維爾提供,貨號:G1001-500;TUNEL FITC凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)由碧云天提供,貨號:C1098;TRIzol試劑由美國Invitrogen提供,貨號:15596-026;髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性檢測試劑盒由Abcam提供,貨號:ab155458;Reverse Transcription試劑盒由vazyme提供,貨號:R323-02;SYBR Green PCR Master Mix由vazyme提供,貨號:Q511-03;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、細(xì)胞間黏附分子1(Intercellular Adhesion Moleclar-1,ICAM-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)ELISA試劑盒由Abcam提供,貨號:ab46105、ab197742、ab252355、ab208979;PPARγ、SIRT1、NF-κB p65(acetyl K310)和β-actin一抗由英國Abcam提供,貨號依次為:ab207297、ab272718、ab189494、ab19870;RIPA裂解緩沖液裂由BOSTER提供,貨號:AR0102-100;BCA蛋白濃度測定試劑盒由博士德生物提供,貨號:AR0197;ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒由新賽美生物提供,貨號:P10300;Dual-Glo Luciferase Assay System由美國Promega提供,貨號:E2920。(3)主要儀器:ELX-800酶標(biāo)儀由美國BIOTEK提供;DP73光學(xué)顯微鏡由日本LLYMPUS提供;ABI 7500 Fasts實時熒光定量PCR系統(tǒng)由杭州博日科技有限公司提供;GelDoc Go凝膠成像系統(tǒng)由上海天能提供。

1.2 方法

1.2.1 TBST誘導(dǎo)UC動物模型的建立及分組處理:小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,處理前首先禁食18 h。隨后,將小鼠分為4組(每組10只):假手術(shù)對照(Control)組、模型(Model)組、miR-27a抑制劑陰性對照(miR-NC antagomir)組和miR-27a抑制劑(miR-27a antagomir)組。小鼠均使用10%水合氯醛進(jìn)行腹膜內(nèi)麻醉,并將由凡士林潤滑的硅膠管(直徑2 mm)通過肛門插入結(jié)腸(約8 cm)。除Control組外的其他3組小鼠注射TNBS溶液(3 mg/kg,含50%乙醇)[7],灌腸后,慢慢拔出硅膠管,用棉簽堵住小鼠肛門,將尾部提起,直至自然蘇醒;Control組注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。隨后,miR-NC antagomir組和miR-27a antagomir組小鼠分別尾靜脈注射miR-NC antagomir、miR-27a antagomir(200 nmol/d),Control組和Model組尾部靜脈注射等量的0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)3 d。然后,將各組小鼠10%水合氯醛麻醉處死,收集結(jié)腸組織和血液用于進(jìn)一步的實驗研究。

1.2.2 結(jié)腸組織學(xué)染色與評分:結(jié)腸組織經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋后,制備為4 μm切片。將切片在二甲苯中脫蠟,并在梯度濃度的乙醇中水化。使用蘇木精染色5 min后進(jìn)入1%酸性乙醇(70%乙醇中添加1% HCl)中3 s,后添加伊紅染色3 min。使用梯度乙醇脫水,并在二甲苯中透明。經(jīng)光學(xué)顯微鏡拍照觀察。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)腸組織學(xué)損傷進(jìn)行評分[8]:0分,黏膜、黏膜下層、固有肌層、漿膜結(jié)構(gòu)正常,無炎性細(xì)胞;1分,黏膜和黏膜下層有炎性細(xì)胞;2分,透壁急性炎癥;3分,小潰瘍,透壁急性炎癥;4分,多處大潰瘍和透壁炎癥;5分,廣泛潰瘍、部分壞死和硬膜內(nèi)炎癥。

1.2.3 TUNEL染色檢測結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡:將結(jié)腸組織切片在二甲苯中脫蠟,并在梯度濃度的酒精中水化后使用20 μg/ml蛋白酶K室溫下孵育15～30 min,后添加50 μl TUNEL溶液在37℃下避光孵育1 h。使用PBS漂洗后添加DAPI染核,再次漂洗,添加一滴防褪色固化劑孵育5 min,通過熒光顯微鏡觀察并拍照。細(xì)胞凋亡率(%)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.2.4 結(jié)腸組織中MPO活性檢測:首先使用預(yù)冷的裂解緩沖液裂解結(jié)腸組織,離心20 min(1 000 r/min),之后按照嚴(yán)格遵循試劑盒說明書檢測。

1.2.5 ELISA檢測血清中炎性因子含量:將收集到的血液,室溫靜置凝固后離心收集血清,根據(jù)ELISA試劑盒方法檢測TNF-α、IL-1β、ICAM-1和MCP-1含量。

1.2.6 qRT-PCR檢測結(jié)腸組織中miR-27a表達(dá):使用TRIzol試劑從結(jié)腸組織中提取總RNA,并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。接著使用SYBR Green PCR Master Mix和實時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR測定。U6作為內(nèi)部對照。通過2-ΔΔCT(ΔCTsample-ΔCTcontrol)來評估m(xù)iR-27a的相對表達(dá)水平。本研究使用的引物序列如下:miR-27a:5’-TGCGCTTCACAGTGGCTAAGT-3’(正向),5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’(反向);U6:5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’(正向),5’-AAATATGGAAACGCTTCACGA-3’(反向)。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡測定結(jié)腸組織中PPARγ/SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá):使用含PMSF蛋白酶體抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解結(jié)腸組織,低溫離心后收集上清液作為完整蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)樣品的濃度按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定。每個樣品中20 μg蛋白質(zhì)通過12% SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,使用5%牛血清白蛋白封閉1 h,然后使用TBST洗滌膜。并在4℃下用以下一抗孵育過夜:PPARγ、SIRT1、NF-κB p65和β-actin(內(nèi)參)。然后將膜與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。使用TBST洗滌膜后添加ECL顯影液對蛋白質(zhì)條帶顯影。使用凝膠成像系統(tǒng)和Image J軟件對蛋白印跡進(jìn)行分析,計算。目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-27a和PPARγ靶向關(guān)系:Starbase網(wǎng)站(https://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測了PPARγ的3’-UTR含有miR-27a的假定結(jié)合位點。將PPARγ 3’-UTR的野生型或突變型質(zhì)粒插入到pmirGLO質(zhì)粒中,構(gòu)建WT-PPARγ和MUT-PPARγ質(zhì)粒。將miR-NC mimics或miR-27a mimics與WT-PPARγ或MUT-PPARγ瞬時共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,用于熒光素酶報告基因檢測。熒光素酶活性=螢火蟲熒光值/海腎熒光值。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷情況 (1)Control組小鼠結(jié)腸黏膜光滑完整,無炎性細(xì)胞浸潤和潰瘍,上皮細(xì)胞排列整齊;Model組和miR-NC antagomir組小鼠結(jié)腸黏膜潰瘍和糜爛,大量炎性細(xì)胞浸潤,上皮細(xì)胞排列混亂且部分損壞、脫落;miR-27a antagomir處理后小鼠結(jié)腸黏膜潰瘍和糜爛減輕,炎性細(xì)胞浸潤減少,上皮細(xì)胞排列較整齊且脫落減少。(2)對結(jié)腸組織微觀損傷進(jìn)行評分,結(jié)果顯示:與Control組相比,Model組評分明顯升高(P<0.05);與miR-NC antagomir組相比,miR-27a antagomir組評分明顯降低(P<0.05);miR-NC antagomir組和Model組評分變化比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1,表1。

圖1 4組小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷(蘇木精-伊紅染色×200)

表1 4組小鼠結(jié)腸炎評分 n=10,分,

2.2 4組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡情況 與Control組相比,Model組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡率明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與miR-NC antagomir組相比,miR-27a antagomir組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡率明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);miR-NC antagomir組和Model組細(xì)胞凋亡率變化比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2,表2。

圖2 4組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色×200)

表2 4組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡率 n=10,%,

2.3 4組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性 與Control組相比,Model組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性明顯增高(P<0.05);與miR-NC antagomir組相比,miR-27a antagomir組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性明顯降低(P<0.05);miR-NC antagomir組和Model組MPO活性變化比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 4組小鼠血清中炎性因子含量 與Control組相

表3 4組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性 n=10,pg/mg tissue,

比,Model組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1和MCP-1含量明顯增高(P<0.05);與miR-NC antagomir組相比,miR-27a antagomir組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1和MCP-1含量明顯降低(P<0.05);miR-NC antagomir組和Model組以上炎性因子含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 4組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1和MCP-1含量 n=10,pg/ml,

2.5 4組小鼠結(jié)腸組織中miR-27a和PPARγ/SIRT1/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與Control組相比,Model組小鼠結(jié)腸組織中miR-27a表達(dá)水平和乙?；疦F-κB p65蛋白水平明顯增高(P<0.05),PPARγ和SIRT1蛋白水平明顯降低(P<0.05);與miR-NC antagomir組相比,miR-27a antagomir組小鼠結(jié)腸組織中miR-27a表達(dá)水平和乙?；疦F-κB p65蛋白水平顯著降低(P<0.05),PPARγ和SIRT1蛋白水平明顯增高(P<0.05);miR-NC antagomir組和Model組以上指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3,表5。

圖3 Western blot檢測4組小鼠結(jié)腸組織中PPARγ、SIRT1和NF-κB p65蛋白水平

表5 4組小鼠結(jié)腸組織中miR-27a、PPARγ、SIRT1和NF-κB p65表達(dá)水平 n=10,

2.6 雙熒光素酶分析miR-27a與PPARγ靶向關(guān)系 經(jīng)生物信息學(xué)分析,PPARγ和miR-27a可能的結(jié)合位點如圖所示。應(yīng)用雙熒光素酶報告基因檢測以確認(rèn)miR-27a和PPARγ的3’-UTR之間的結(jié)合位點,結(jié)果表明,與miR-NC mimics組相比較,miR-27a mimics組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PPARγ細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而轉(zhuǎn)染MUT-PPARγ細(xì)胞中熒光素酶活性變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4,表6。

圖4 PPARγ和miR-27a結(jié)合位點圖

表6 雙熒光素酶報告基因檢測共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中的熒光素酶活性n=3,

3 討論

MPO是一種溶酶體蛋白,主要在中性粒細(xì)胞中表達(dá),其活性是中性粒細(xì)胞浸潤和急性炎癥的重要生物標(biāo)志物之一[9]。本研究結(jié)果表明,TNBS誘導(dǎo)后小鼠結(jié)腸炎評分和MPO活性顯著上調(diào),小鼠結(jié)腸組織有明顯的潰瘍和糜爛,且大量炎性細(xì)胞浸潤,表明TNBS誘導(dǎo)的UC小鼠模型成功建立。同時,本研究結(jié)果證明,在TNBS誘導(dǎo)的UC小鼠中,結(jié)腸組織中miR-27a的表達(dá)被顯著上調(diào)。而以往研究顯示,miR-27a在硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的小鼠UC模型中顯著下調(diào)[10],與本研究結(jié)果不同,這可能是因為miR-27a在不同UC模型構(gòu)建方法或不同周期的小鼠中的作用機(jī)制不同。

炎性分子被認(rèn)為是通過影響腸道通透性和細(xì)菌易位參與UC進(jìn)展的重要因素。TNF-α觸發(fā)結(jié)腸上皮細(xì)胞中其他炎性細(xì)胞因子和黏附分子表達(dá);IL-1β通過作用于終末細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫和非免疫細(xì)胞的功能,其水平與UC的疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11];另外,ICAM-1和MCP-1等炎性細(xì)胞因子被視為結(jié)腸炎炎癥的生物標(biāo)志物[12,13]。本研究結(jié)果表明,表明miR-27a抑制腸黏膜炎癥。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),TNBS誘導(dǎo)后,小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡率升高,而抑制miR-27a表達(dá)可降低細(xì)胞凋亡率。據(jù)以往研究發(fā)現(xiàn),適應(yīng)性的升高細(xì)胞凋亡水平可在一定程度上清除堆積的炎性因子[14]。結(jié)合本研究結(jié)果,推測抑制miR-27a表達(dá)減輕了炎性反應(yīng),而凋亡反應(yīng)下調(diào)可能是為了適應(yīng)炎性反應(yīng)的程度,此結(jié)果也間接證實了miR-27a對炎癥的調(diào)節(jié)作用。

據(jù)報道,PPARγ/SIRT1/NF-κB信號通路參與治療硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的小鼠UC過程[15]。PPARγ是過氧化物酶體增殖物激活受體的一員,在UC患者結(jié)腸上皮中的表達(dá)低于對照,且可顯著抑制巨噬細(xì)胞的激活和TNF-α、IL-1β在內(nèi)的多個炎性因子的產(chǎn)生[16]。SIRT1作為長壽蛋白SIR2的哺乳動物同源物,在UC小鼠結(jié)腸組織中可通過在賴氨酸310處脫乙?；疪elA/p65來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,從而減少NF-κB活化,從而減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]。本研究結(jié)果顯示,TNBS誘導(dǎo)后,小鼠結(jié)腸組織中PPARγ和SIRT1蛋白水平降低,乙?；疦F-κB p65蛋白水平增高,而抑制miR-27a表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)TNBS誘導(dǎo)對PPARγ、SIRT1、NF-κB表達(dá)的影響。另外,生物信息學(xué)分析顯示,miR-27a靶向調(diào)節(jié)PPARγ/SIRT1/NF-κB信號通路參與調(diào)控TNBS誘導(dǎo)的UC小鼠腸道損傷過程。

綜上所述,miR-27a靶向調(diào)控PPARγ/SIRT1/NF-κB信號通路在UC發(fā)病過程中的炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。抑制miR-27a表達(dá)可以減輕TNBS誘導(dǎo)的UC小鼠腸道損傷并抑制炎性因子的表達(dá)。