徐文俊　李鳳華　周煒　夏兵兵　趙俊

摘要［目的］研究表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子釀酒酵母對(duì)長(zhǎng)江絨螯蟹生長(zhǎng)性能、免疫功能以及腸道發(fā)育的影響。［方法］試驗(yàn)分為2組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在1 kg基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加5 mL表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子釀酒酵母發(fā)酵液，螃蟹按照15 000 只/hm2進(jìn)行投放，試驗(yàn)周期為9個(gè)月。［結(jié)果］與對(duì)照組相比，添加釀酒酵母能夠顯著提高螃蟹存活率（P＜0.05），存活率提高了6.1%；但添加釀酒酵母對(duì)螃蟹血液中溶菌酶含量和組織中SOD和MDA含量沒(méi)有顯著性影響；而添加釀酒酵母能夠顯著提高螃蟹后腸腸道上皮細(xì)胞高度（P＜0.05）。［結(jié)論］在長(zhǎng)江絨螯蟹飼料中添加表達(dá)EGF釀酒酵母能夠提高機(jī)體非特異性免疫力，促進(jìn)腸道生長(zhǎng)發(fā)育，提高螃蟹平均體重和存活率。

關(guān)鍵詞 釀酒酵母；表皮生長(zhǎng)因子；中華絨螯蟹；生長(zhǎng)性能；免疫功能；腸道發(fā)育

中圖分類號(hào) S963 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2023）06-0078-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.020

Effects of Saccharomyces cerevisiae Expressing Epidermal Growth Factor on Growth Performance，Immune Function and Intestinal Development of Mitten Crab from the Yangtze River System

XU Wen－jun1，LI Feng－h(huán)ua2，3，ZHOU Wei1 et al

（1.Wuhu Interferon Biological Products Industrial Research Institute Co.，Ltd.，Wuhu，Anhui 241000;2.Shandong Xundakang Veterinary Medicine Co.，Ltd.，Jinan，Shandong 250000;3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070）

Abstract ［Objective］ The purpose of the experiment was to study the effect of Saccharomyces cerevisiae expressing epidermal growth factor on the growth performance，immune function and intestinal development of mitten crab.［Method］ The mitten crab was divided into two groups.The control group was fed the basal diet，and the experimental group was fed the basal diet supplementing with 5 mL Saccharomyces cerevisiae expressing epidermal growth factor.The crabs were released at a rate of 15 000 inds per hectare.The experiment period was 9 months.［Result］The results showed that compared with the control group， the addition of Saccharomyces cerevisiae could significantly improve the survival rate of mitten crab （P<0.05）， the survival rate increased by 6.1%. The addition of Saccharomyces cerevisiae had no significant effect on the contents of lysozyme in blood and SOD and MDA in mitten crab tissues; the addition of Saccharomyces cerevisiaecan could significantly increase the height of intestinal villi in the hindgut of mitten crab （P<0.05）.［Conclusion］Adding Saccharomyces cerevisiae expressing epidermal growth factor to the basal diet could improve the non－specific immunity，promote intestinal growth and development，and improve the average weight and survival rate of mitten crab.

Key words Saccharomyces cerevisiae;Epidermal growth factor;Mitten crab;Growth performance;Immune function;Intestinal development

隨著抗生素在飼料中逐步禁止使用，人們不斷開(kāi)發(fā)出新的抗生素替代品。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，益生菌是一種最有潛力的抗生素替代品［1］，釀酒酵母作為益生菌的一種，能夠有效增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的消化吸收率，提高生長(zhǎng)性能，同時(shí)增強(qiáng)動(dòng)物的免疫水平，提高動(dòng)物的存活率［2-3］，酵母菌和酵母細(xì)胞壁中富含的β-葡聚糖和甘露寡糖能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原菌在腸道上定植，減少病原數(shù)量，維持腸道菌群的平衡［4-5］。

表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF）作為一種有絲分裂原，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化［6］，其在畜禽養(yǎng)殖無(wú)抗生產(chǎn)中也得到研究與應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加EGF能夠提高仔豬日增重，刺激腸道緊密連接蛋白mRNA的表達(dá)，抑制炎癥基因mRNA表達(dá)，抑制有害菌的繁殖［7］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加EGF能夠顯著提高肉雞生長(zhǎng)性能、免疫功能，并且促進(jìn)肉雞的腸道發(fā)育［8］。該試驗(yàn)旨在研究釀酒酵母表達(dá)EGF對(duì)長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹生長(zhǎng)性能、腸道發(fā)育以及免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹蟹苗購(gòu)自南京高淳，蟹苗按照15 000只/hm2的密度投放至池塘中。

試驗(yàn)用表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子釀酒酵母由蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)用飼料為海大螃蟹膨化配合飼料，主要營(yíng)養(yǎng)成分：粗蛋白≥36.0%，粗纖維≤6.0%，粗灰分≤16.0%，粗脂肪≥4.0%，賴氨酸≥1.8%。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與場(chǎng)地 試驗(yàn)時(shí)間：2021年3—11月；試驗(yàn)場(chǎng)地：無(wú)為縣賢銘特種水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)將螃蟹隨機(jī)分為2組，對(duì)照組池塘面積0.285 hm2，全程飼喂海大螃蟹配合飼料，試驗(yàn)組池塘面積0.315 hm2，試驗(yàn)組在1 kg配合飼料中添加5 mL的表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子釀酒酵母發(fā)酵液，飼料經(jīng)攪拌均勻后，室內(nèi)低溫晾干保存，并對(duì)試驗(yàn)組螃蟹進(jìn)行全程飼喂。

試驗(yàn)過(guò)程中飼養(yǎng)管理按照養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖規(guī)范進(jìn)行，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程對(duì)照組和試驗(yàn)組的藥物、添加劑等產(chǎn)品試用均保證一致。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和試驗(yàn)組的螃蟹數(shù)量、體重，按下方公式計(jì)算螃蟹平均體重、單位面積螃蟹數(shù)量、螃蟹存活率、單位面積螃蟹產(chǎn)量。

螃蟹平均體重（g/只）=m/n

單位面積螃蟹數(shù)量（只/hm2）=n/t

螃蟹存活率（%）=n/（t×15 000）×100

單位面積螃蟹產(chǎn)量（kg/hm2）=m/t

式中，m為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所有螃蟹總體重，n為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)螃蟹數(shù)量，t為試驗(yàn)池塘大小。

1.5 血清溶菌酶測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后，在試驗(yàn)組和對(duì)照組中分別隨機(jī)抽取6只大小接近的螃蟹將河蟹螯足第2對(duì)關(guān)節(jié)處折斷取血淋巴，置于離心管中4 ℃過(guò)夜，經(jīng)冷凍高速離心機(jī)4 000 r/min離心后吸出血清，-20 ℃保存?zhèn)溆茫芫富钚圆捎媚暇┙ǔ缮锕こ萄芯克噭┖袦y(cè)定。

1.6 組織超氧化物歧化酶和丙二醛含量測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后，分別將2組螃蟹的肝臟、性腺和肌肉組織，按照重量體重比加入生理鹽水制備成10%的組織勻漿，1 000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃保存，用于超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定。SOD活性用呤氧化酶法測(cè)定，MDA含量用過(guò)氧化脂質(zhì)硫代巴比妥酸分光光度計(jì)法測(cè)定，兩者均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.7 腸道粘膜的組織學(xué)觀察 分別取出2組螃蟹的后腸，4 ℃預(yù)冷1×PBS輕輕漂洗，然后投入預(yù)先配好的10%福爾馬林固定液中，固定完成后進(jìn)行脫水透明、浸蠟包埋、制片和HE染色的步驟，利用尼康E-CLIPSE80i型高級(jí)研究用正置生物數(shù)碼攝影顯微鏡觀察切片，測(cè)定腸上皮細(xì)胞高度和腸絨毛高度。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016進(jìn)行初步處理，用

SPSS 18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析差異顯著性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)EGF釀酒酵母對(duì)中華絨螯蟹生產(chǎn)性能的影響

由表1可看出，與對(duì)照組相比，在飼料中添加表達(dá)EGF釀酒酵母能夠顯著提高螃蟹存活率（P＜0.05），存活率提高了6.1百分點(diǎn)，而對(duì)螃蟹的平均體重提高了3.33 g/只，同時(shí)螃蟹產(chǎn)量提高201.00 kg/hm2，預(yù)計(jì)經(jīng)濟(jì)效益可提高20 100元/hm2（中華絨螯蟹單價(jià)約為100元/kg）。

2.2 表達(dá)EGF釀酒酵母對(duì)中華絨螯蟹血清溶菌酶含量和組織中SOD和MDA含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在飼料中添加表達(dá)EGF釀酒酵母對(duì)中華絨螯蟹血清溶菌酶含量影響不顯著，對(duì)照組和試驗(yàn)組含量分別為44.44和66.67 U/mL。由表2可看出，與對(duì)照組相比，在飼料中添加表達(dá)EGF釀酒酵母對(duì)肝臟、性腺、肌肉組織中SOD和MDA的含量影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 表達(dá)EGF釀酒酵母對(duì)中華絨螯蟹腸道生長(zhǎng)發(fā)育的影響

由圖1腸道組織形態(tài)學(xué)可以看出，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組腸道組織形態(tài)完整，腸壁內(nèi)外層分層清晰，腸上皮細(xì)胞連接緊密，沒(méi)有明顯的細(xì)胞損傷和脫落；由表3可看出，與對(duì)照組相比，在飼料中添加釀酒酵母能夠顯著提高螃蟹后腸上皮細(xì)胞高度（P＜0.05），對(duì)后腸絨毛高度有提高趨勢(shì)。

3 討論

中華絨螯蟹是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的不斷增加，細(xì)菌性和病毒性的疾病也越來(lái)越多，嚴(yán)重影響了其生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益［9］。釀酒酵母作為一種益生菌和工程菌，利用其表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子既能發(fā)揮益生菌的功效，又能通過(guò)表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子發(fā)揮其有絲分裂原的功能，是一種具有潛力的微生態(tài)飼料添加劑［10］。

釀酒酵母發(fā)酵液中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞溶解物質(zhì)，其能夠提高動(dòng)物機(jī)體免疫力［11］，酵母細(xì)胞壁中含有的β-葡聚糖和甘露寡糖能夠與巨噬細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合激活巨噬細(xì)胞，同時(shí)增加免疫球蛋白的數(shù)量，提高動(dòng)物的存活率［12］。溶菌酶是水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體重要的非特異性免疫因子之一［13］，其通過(guò)催化水解細(xì)菌的細(xì)胞壁使得細(xì)菌滅亡，同時(shí)增強(qiáng)其他免疫因子活性，協(xié)同抵抗外源致病菌的侵襲［14］。也有研究表明，在日糧中添加EGF能夠促進(jìn)斷奶仔豬機(jī)體免疫功能的發(fā)育，提高腸道的免疫屏障功能［15］。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在中華絨螯蟹飼料中添加表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子釀酒酵母有提高血清溶菌酶含量的趨勢(shì)，提高了螃蟹機(jī)體的非特異性免疫功能，從而提高螃蟹養(yǎng)殖過(guò)程中的存活率。

利用益生菌表達(dá)EGF促進(jìn)腸道發(fā)育已有一定的研究。劉淑杰等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸炎模型小鼠中添加表達(dá)EGF的乳酸乳球菌能夠修復(fù)腸道損傷，改善腸道屏障；Zhou等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞日糧中添加表達(dá)EGF乳酸乳球菌能夠提高肉雞的生長(zhǎng)性能，促進(jìn)肉雞腸道的發(fā)育；Wang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加表達(dá)EGF的釀酒酵母能夠促進(jìn)仔豬腸道絨毛高度、絨毛隱窩比以及腸道的發(fā)育。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在螃蟹飼料中添加表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子釀酒酵母能夠促進(jìn)螃蟹腸道發(fā)育，提高腸絨毛高度和腸上皮細(xì)胞的高度。這可能跟釀酒酵母與EGF的生物活性有關(guān)，酵母菌進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體胃腸后能夠產(chǎn)生多胺類的物質(zhì)，多胺類物質(zhì)能夠直接參與細(xì)胞的增殖分化，以及核酸蛋白質(zhì)的合成［18］。同時(shí)釀酒酵母表達(dá)的EGF能夠與腸上皮細(xì)胞和微絨毛中豐富的EGFR受體結(jié)合，通過(guò)激活MAPK和PI3K型號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，同時(shí)刺激杯狀細(xì)胞分泌Muc2黏蛋白，減少有害菌的定位和遷移，維持腸道固有屏障功能［19-20］，從而促進(jìn)腸道的生長(zhǎng)發(fā)育。飼喂活的酵母菌能夠提高水產(chǎn)動(dòng)物消化酶的活性，如淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的消化吸收能力提升［21］。外源性添加EGF也能夠顯著提高動(dòng)物胃腸道消化酶的活性，如α-淀粉酶、堿性蛋白酶、脂肪酶、堿性磷酸酶、肌酸激酶及乳酸脫氫酶等［10，22-23］。該試驗(yàn)結(jié)果表明，添加表達(dá)EGF釀酒酵母能夠提高螃蟹的平均體重和產(chǎn)量，這可能與螃蟹中胃腸道消化酶的活性提高與腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

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基金項(xiàng)目 安徽省自然科學(xué)基金（1808085MC75）；蕪湖市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YF44）；蕪湖市發(fā)明專利技術(shù)成果產(chǎn)業(yè)化計(jì)劃（202021）。

作者簡(jiǎn)介 徐文俊（1991—），男，安徽蕪湖人，碩士，從事飼料添加劑的研發(fā)。*通信作者，講師，博士，從事生物制品的研究與開(kāi)發(fā)。

收稿日期 2022-04-11；修回日期 2022-05-09