陳瑞強(qiáng)，羅祥超，林厚文, *，焦偉華*

海綿共附生鏈霉菌162432次級代謝產(chǎn)物研究

陳瑞強(qiáng)1，羅祥超2，林厚文1, 2*，焦偉華2*

1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306 2. 癌基因與相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋藥物研究中心，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海 200127

研究海綿共附生鏈霉菌162432的化學(xué)成分。采用十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（ODS）中壓柱色譜和半制備高效液相色譜等技術(shù)進(jìn)行分離純化，得到的單體化合物采用HR-ESI-MS、NMR以及文獻(xiàn)比對等方法進(jìn)行鑒定，新化合物的絕對構(gòu)型通過計算NMR和圓二色譜（ECD）確定。從菌株162432中分離純化了9個環(huán)二肽類化合物，包括1個新化合物鏈霉菌二肽A（1）和8個已知化合物：環(huán)-(-順式-羥脯氨酸--苯丙氨酸)（2）、環(huán)-(-脯氨酸--苯丙氨酸)（3）、環(huán)-(-羥脯氨酸--亮氨酸)（4）、環(huán)-(-羥脯氨酸--亮氨酸)（5）、環(huán)-(-脯氨酸--亮氨酸)（6）、環(huán)-(-脯氨酸--亮氨酸)（7）、環(huán)-(-脯氨酸--異亮氨酸)（8）、環(huán)-(-亮氨酸--纈氨酸)（9）。對分離得到的化合物1～9進(jìn)行腫瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞毒和抗菌活性評價，活性結(jié)果顯示，化合物1～9在10 μg/mL下對腫瘤細(xì)胞增殖均未顯示出明顯的細(xì)胞毒活性；化合物9對蘇云金芽孢桿菌顯示抑菌活性，最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為25 μg/mL。化合物1為新化合物，化合物2和4～9為首次從鏈霉菌中分離得到，化合物9具有一定的抗菌活性。

海綿；鏈霉菌162432；鏈霉菌二肽A；環(huán)-(-亮氨酸--纈氨酸)；海洋天然產(chǎn)物；抗菌活性

近年來，新型致病菌以及耐藥菌株的不斷出現(xiàn)引起了藥學(xué)家們的關(guān)注，迫切需要發(fā)掘更多的天然活性產(chǎn)物來應(yīng)對當(dāng)今所面臨的困局[1-3]。海洋放線菌因其次級代謝產(chǎn)物具有豐富的化學(xué)多樣性和良好的生物活性而受到人們的廣泛關(guān)注[4]。鏈霉菌為放線菌中物種最多、分布范圍最廣且形態(tài)特征最為典型的一類菌屬，產(chǎn)生了大量生物堿、大環(huán)內(nèi)酯、萜、聚酮及肽等類化合物[5-8]，部分化合物表現(xiàn)出抗菌、細(xì)胞毒等活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療健康、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。本課題組前期從西沙群島采集的海洋海綿的樣本中分離得到一株鏈霉菌，經(jīng)鑒定為系列，命名為162432。本研究對該菌采用大米固體發(fā)酵，對發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，綜合利用ODS中壓色譜柱和半制備高效液相色譜等分離手段，從醋酸乙酯層分離得到9個環(huán)二肽類化合物，分別為鏈霉菌二肽A（streptomyces dipeptide A，1）、環(huán)-(-順式-羥脯氨酸--苯丙氨酸) [cyclo-(-cis-Hyp--Phe)，2]、環(huán)-(-脯氨酸--苯丙氨酸) [cyclo-(-Pro--Phe)，3]、環(huán)-(-羥脯氨酸--亮氨酸) [cyclo-(-Hyp--Leu)，4]、環(huán)(-羥脯氨酸--亮氨酸) [cyclo-(-Hyp--Leu)，5]、環(huán)-(-脯氨酸--亮氨酸) [cyclo-(-Pro--Leu)，6]、環(huán)-(-脯氨酸--亮氨酸) [cyclo-(-Pro--Leu)，7]、環(huán)-(-脯氨酸--異亮氨酸) [cyclo-(-Pro--Ile)，8]、環(huán)-(-亮氨酸--纈氨酸) [cyclo-(-Leu--Val)，9]，結(jié)構(gòu)見圖1。已知化合物的結(jié)構(gòu)由NMR數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)比對確定，化合物2和4～9為首次從鏈霉菌中分離得到；新化合物（1）的平面結(jié)構(gòu)通過NMR、HR-ESI-MS數(shù)據(jù)確定，立體構(gòu)型通過DP4+分析以及計算ECD確定。同時對分離得到的化合物評價了其細(xì)胞毒性和抗菌活性。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Waters 1525/2996型半制備高效液相色譜（Waters公司，美國）；Bruker AVANCE-600 MHz核磁共振儀；Interchim puriflash 450 instruments中壓色譜儀（Interchim公司，法國）；JASCO P-2000型旋光儀（JASCO公司，日本）；JASCO FT/IR-4100型分光光度計（JASCO公司，日本）；半制備色譜柱為YMC-Pack Pro C18RS（250 mm×10 m，5 μm，YMC公司，日本）；柱色譜硅膠（200～300、300～400目，山東青島海洋化工有限公司）；Waters Xevo G2-XS Q-Tof、Waters Q-Tof micro YA019液質(zhì)聯(lián)用儀（Waters公司，美國）；分析級甲醇和乙腈、二氯甲烷（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；色譜級甲醇和乙腈（Merck公司，德國）。萬古霉素（Adamas，批號22961A）。

1.2 菌株來源

鏈霉菌162432是2013年分離自西沙群島采集的海綿，由生工生物工程股份有限公司經(jīng)分子生物學(xué)方法確定其種屬[9]，樣本存放于上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院的癌基因與相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋藥物研究中心。

1.3 細(xì)胞

人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U343、人急性粒細(xì)胞HL-60、人急性早幼粒細(xì)胞NB4、人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937均來自ATCC細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

2.1.1 菌株培養(yǎng)基 菌株活化ISP-2培養(yǎng)基：葡萄糖4 g、酵母提取物4 g、麥芽提取物10 g、海鹽17.5 g、去離子水1 L、pH為7.0～7.2。大米發(fā)酵培養(yǎng)基：海鹽17 g、大米105 g、加水定容至200 mL。

2.1.2 菌株發(fā)酵 將菌株鏈霉菌162432從?80 ℃冰箱保藏的甘油管中取出，接種到ISP-2瓊脂培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d。挑取單菌落將其接種到ISP-2瓊脂培養(yǎng)基中復(fù)壯，培養(yǎng)3 d后，將1/2的平板切成小塊（1 cm×1 cm）接種于大米培養(yǎng)基內(nèi)（200 mL培養(yǎng)基/2 L錐形瓶），靜置常溫（25 ℃）培養(yǎng)6周。共發(fā)酵60瓶。

2.2 提取與分離

將大米發(fā)酵物用甲醇（800 mL/瓶）滲漉提取，提取液減壓濃縮蒸干獲得10.2 g粗浸膏。將粗浸膏懸浮于2 L的水中，用等體積的醋酸乙酯萃取5次，獲得醋酸乙酯萃取物（1.3 g），經(jīng)ODS中壓柱色譜，乙腈-水（5%→100%，450 min）梯度洗脫獲得10個流分（Fr. 1～10）。流分Fr. 5（308.4 mg）經(jīng)過半制備HPLC（甲醇-水13∶87）純化，得到化合物1（2.3 mg，R＝40 min）、2（6.4 mg，R＝23 min）和3（4.8 mg，R＝35 min）；流分Fr. 6（68.3 mg）經(jīng)過半制備HPLC（甲醇-水20∶80）純化，得到化合物4（5.6 mg，R＝25 min）、5（3.8 mg，R＝34 min）、6（4.7 mg，R＝20 min）以及7（2.4 mg，R＝40 min）；流分Fr. 7（125.8 mg）經(jīng)過半制備HPLC（甲醇-水25∶75）純化，得到化合物8（3.3 mg，R＝28 min）和9（6.2 mg，R＝34 min）。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀物，易溶于甲醇。[α]20 D?48.2 (0.1，CH3OH)。HR-ESI-MS給出/277.119 0 [M＋H]+（C14H16N2O4，理論值為277.118 3），有8個不飽和度。IR光譜圖顯示有1 662.8、3 260.0 cm?1的吸收，推測該化合物含有羰基及氨基或羥基。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) 顯示出16個質(zhì)子信號：5個芳香質(zhì)子重疊信號H-12、H-15、H-16 (H7.26, 3H, d,= 7.3 Hz) 和H-13、H-14 (H7.33, 2H, d,= 7.3 Hz)；4個質(zhì)子所在的碳是連接有氧或氮，分別是H-3 (H4.04, 1H, dd,= 10.0, 4.7 Hz)、H-8 (H4.63, 1H, m)、H-9a (H3.58, 1H, dd,= 12.1, 4.4 Hz) 和H-9b (H3.78, 1H, dd,= 12.1, 6.3 Hz)；還有2個亞甲基質(zhì)子信號H-7a (H2.41, 1H, dd,= 14.0, 6.3 Hz), H-7b (H2.48, 1H, dd,= 14.0, 6.1 Hz) 和H-10a (H3.26, 1H, dd,= 13.3, 10.1 Hz), H-10b (H3.20, 1H, dd,= 13.4, 4.7 Hz)。

13C-NMR (150 MHz, CD3OD) 和DEPT譜顯示該化合物含有14個碳：4個季碳，包含2個羰基碳C-2 (C170.0) 和C-5 (C170.2)，1個sp2雜化的季碳C-11 (C138.6)，1個sp3雜化的季碳C-6 (C88.6)；7個次甲基信號，其中C-12/16 (C130.9)、C-13/15 (C130.0) 和C-14 (C128.3) 為sp2雜化，C-3 (C60.8) 和C-8 (C68.4) 為sp3雜化；3個亞甲基C-7 (C46.8)、C-9 (C54.0) 和C-10 (C42.8)。該化合物的核磁譜圖和環(huán)二肽類化合物的核磁譜圖極其相似[10]。1H-1H COSY譜圖的H-12/H-13/H-14/ H-15/H-16相關(guān)結(jié)合在HMBC譜圖中的H2-10與C-2、C-12、C-11、C-16相關(guān)，確定了單取代苯環(huán)的存在。進(jìn)一步通過H-3/H-10的COSY相關(guān)以及(H2-10, H-3)/C-2的HMBC相關(guān)推導(dǎo)出該化合物中含有苯丙氨酸殘基；1H-1H COSY譜圖的H-7/H-8/H-9相關(guān)結(jié)合在HMBC譜圖中的H2-7與C-5相關(guān)，H-8與C-6相關(guān)，H2-9與C-2相關(guān)推導(dǎo)出該化合物含有脯氨酸殘基[10]。值得注意的是，該化合物C-6 (C88.6) 和C-8 (C68.4) 化學(xué)位移明顯增加，推測其H-6和H-8被羥基取代，隨后通過HR-ESI-MS進(jìn)一步確定了推測，確定了化合物1的平面結(jié)構(gòu)（圖2）。對化合物1的數(shù)據(jù)歸屬（表1）。該化合物有3個手性中心，無法通過ROESY譜圖確定該化合物的相對構(gòu)型，因此通過計算4種相對構(gòu)型的NMR數(shù)據(jù)，分別是3R, 6R, 8R、3R, 6R, 8S、3R, 6S, 8R、3R, 6S, 8S，基于NMR數(shù)據(jù)擬合DP4+分析（99.99%），確定化合物的相對構(gòu)型為3R, 6R, 8S（圖3）。隨后用ECD計算2個對映異構(gòu)體（3, 6, 8、3, 6, 8），計算值和實(shí)驗(yàn)值曲線模擬（圖4），最后確定化合物的立體構(gòu)型為3, 6, 8。

圖2 化合物1的COSY和HMBC相關(guān)

化合物2：無色油狀物，[α]20 D＋28 (0.1, CH3OH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 4.22 (2H, m, H-3, 8), 2.80 (1H, t,= 8.5 Hz, H-6), 2.24 (1H, m, H-7a), 1.96 (1H, dd,= 13.7, 4.8 Hz, H-10b), 7.19 (2H, m, H-12), 1.98 (1H, m, H-7b), 3.60 (1H, dd,= 12.4, 3.9 Hz, H-9a), 3.34～3.24 (1H, m, H-9b), 3.19(1H, dd,= 13.7, 5.1 Hz, H-10a), 3.01 (1H, dd,= 13.7, 4.8 Hz, H-10b), 7.19 (2H, m, H-12, 16), 7.33～7.28 (3H, m, H-13～15)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 168.0 (C, C-2), 59.9 (CH, C-3), 171.3 (C, C-5), 57.5 (CH, C-6), 38.3 (CH2, C-7), 68.8 (CH, C-8), 54.3 (CH2, C-9), 41.2 (CH2, C-10), 137.1 (C, C-11), 131.5 (CH, C-12, 16), 130.0 (CH, C-13, 15), 128.8 (CH, H-14)。以上譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[11]，故確定該化合物為環(huán)-(-順式-羥脯氨酸--苯丙氨酸)二肽。

表1 化合物1的一維和二維數(shù)據(jù)NMR譜圖(600/150 MHz,CD3OD)

圖3 化合物1的實(shí)驗(yàn)和計算NMR數(shù)據(jù)的擬合線

圖4 化合物1的實(shí)測ECD和計算ECD

化合物3：棕黃色油狀物，[α]20 D＋65 (0.1, CH3OH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 3.50 (1H, m, H-3), 4.16 (1H, m, H-6), 2.00 (1H, m, H-7a), 1.86 (1H, m, H-7b), 1.62 (2H, m, H-8), 3.27 (1H, m, H-9a), 2.58 (1H, m, H-9b), 3.15 (1H, dd,= 13.8, 4.8 Hz, H-10a), 3.00 (1H, dd,= 13.8, 4.8 Hz, H-10b), 7.15 (2H, m, H-12, 16), 7.26 (3H, m, H-13～15)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 171.6 (C, C-2), 59.4 (CH, C-3), 167.7 (C, C-5), 60.0 (CH, C-6), 30.1 (CH2, C-7), 22.8 (CH2, C-8), 46.4 (CH2, C-9), 41.3 (CH2, C-10), 137.0 (C, C-11), 129.9 (CH, C-12, 16), 131.5 (CH, C-13, 15), 128.8 (CH, C-14)。以上譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[12]，故確定該化合物為環(huán)-(-脯氨酸--苯丙氨酸)二肽。

化合物4：黃色結(jié)晶，[α]20 D?81 (0.15, CH3OH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 4.17 (1H, m, H-3), 4.46 (1H, t,= 4.2 Hz, H-6), 2.09 (1H, m, H-7a), 2.27 (1H, dd,= 6.0, 13.2 Hz, H-7b), 4.52 (1H, dd,= 6.6, 10.2 Hz, H-8), 3.43 (1H, d,= 12.6 Hz, H-9a), 3.66 (1H, dd,= 4.8, 13.2 Hz, H-9b), 1.51 (1H, m, H-10a), 1.91 (2H, m, H-10b, 11), 0.96 (6H, dd,= 3.0, 6.0 Hz, H-12, 13)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 169.3 (C, C-2), 54.9 (CH, C-3), 173.3 (C, C-5), 59.0 (CH, C-6), 38.5 (CH2, C-7), 69.4 (CH, C-8), 55.5 (CH2, C-9), 39.7 (CH2, C-10), 26.1 (CH, C-11), 22.5 (CH3, C-12), 23.6 (CH3, C-13)。以上譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[13]，故確定該化合物為環(huán)-(-羥脯氨酸--亮氨酸)二肽。

化合物5：無色結(jié)晶（甲醇），[α]20 D＋37 (0.34, CH3OH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 3.87 (1H, dd,= 5.4, 9.0 Hz, H-3), 4.35 (1H, t,= 9.0 Hz, H-6), 2.23 (1H, m, H-7a), 2.49 (1H, m, H-7b), 4.42 (1H, m, H-8), 3.67 (1H, m, H-9a), 3.45 (1H, m, H-9b), 1.58 (2H, m, H-10), 1.78 (1H, m, H-11), 0.97 (3H, d,= 6.6 Hz, H-12), 1.00 (3H, d,= 6.6 Hz, H-13)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 169.7 (C, C-2), 57.2 (CH, C-3), 171.5 (C, C-5), 57.8 (CH, C-6), 38.0 (CH2, C-7), 69.1 (CH, C-8), 54.6 (CH2, C-9), 43.7 (CH2, C-10), 25.9 (CH, C-11), 22.3 (CH3, C-12), 23.6 (CH3, C-13)。以上譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[13]，故確定該化合物為環(huán)-(-羥脯氨酸--亮氨酸)二肽。

化合物6：白色粉末，[α]20 D＋42.7 (0.1, CH3OH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 3.85 (1H, dd,= 5.4, 9.6 Hz, H-3), 4.26 (1H, m, H-6), 1.93 (2H, m, H-7), 2.02 (1H, m, H-8a), 2.34 (1H, m, H-8b), 3.50 (1H, m, H-9a), 3.58 (1H, m, H-9b), 1.78 (1H, m, H-10a), 1.68 (1H, m, H-10b), 1.57 (1H, m, H-11), 0.97 (3H, d,= 6.6 Hz, H-12), 1.00 (3H, d,= 6.6 Hz, H-13)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 171.9 (C, C-2), 57.2 (CH, C-3), 169.2 (C, C-5), 59.6 (CH, C-6), 30.1 (CH2, C-7), 23.4 (CH2, C-8), 44.0 (CH2, C-9), 46.9 (CH2, C-10), 25.8 (CH, C-11), 22.1 (CH3, C-12), 23.4 (CH3, C-13)。以上譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[14]，故確定該化合物為環(huán)-(-脯氨酸--亮氨酸)二肽。

化合物7：白色粉末，[α]20 D?94 (0.1, CH3OH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 4.26 (1H, t,= 7.2 Hz, H-3), 4.13 (1H, m, H-6), 2.30 (1H, m, H-7a), 2.03 (4H, m, H-7b, 8a, 10a, 11), 1.89 (1H, m, H-8b), 3.51 (2H, m, H-9), 1.52 (1H, m, H-10b), 0.96 (6H, dd,= 3.6, 6.0 Hz, H-12, 13)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 173.1 (C, C-2), 54.9 (CH, C-3), 169.2 (C, C-5), 60.6 (CH, C-6), 29.4 (CH2, C-7), 23.9 (CH2, C-8), 46.7 (CH2, C-9), 39.7 (CH2, C-10), 26.4 (CH, C-11), 23.6 (CH3, C-12), 22.5 (CH3, C-13)。以上譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[15]，故確定該化合物為環(huán)-(-脯氨酸--亮氨酸)二肽。

化合物8：白色粉末，[α]20 D＋68 (0.1, CH3OH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 3.68 (1H, d,= 6.6 Hz, H-3), 4.24 (1H, dd,= 10.2, 6.6 Hz, H-6), 2.35 (1H, m, H-7a), 1.90 (3H, m, H-7b, 8), 3.49 (1H, m, H-9a), 3.62 (1H, m, H-9b), 2.02 (1H, m, H-10), 1.61 (1H, m, H-11a), 1.23 (1H, m, H-11b), 0.96 (3H, t,= 5.2 Hz, H-12), 1.01 (3H, d,= 4.4 Hz, H-13)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 168.2 (C, C-2), 60.0 (CH, C-3), 171.9 (C, C-5), 63.8 (CH, C-6), 30.6 (CH2, C-7), 23.2 (CH2, C-8), 47.0 (CH2, C-9), 41.3 (CH, C-10), 26.4 (CH2, C-11), 11.9 (CH3, C-12), 16.0 (CH3, C-13)。以上譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報道的一致[16]，故確定該化合物為環(huán)-(-脯氨酸--異亮氨酸)二肽。

化合物9：白色粉末，[α]20 D＋4 (0.1, CH3OH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 3.98 (1H, t,= 6.0 Hz, H-3), 3.82 (1H, d,= 4.2 Hz, H-6), 2.32 (1H, m, H-7), 1.05 (3H, d,= 7.2 Hz, H-8), 0.95 (9H, d,= 6.6 Hz, H-9, 12, 13), 1.73 (2H, m, H-10), 1.85 (1H, m, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 171.9 (C, C-2), 61.6 (CH, C-3), 170.5 (C, C-5), 54.5 (CH, C-6), 33.9 (CH, C-7), 19.1 (CH3, C-8), 17.3 (CH3, C-9), 43.4 (CH2, C-10), 25.5 (CH, C-11), 23.6 (CH3, C-12), 22.8 (CH3, C-13)。以上譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[17]，故確定該化合物為環(huán)-(-亮氨酸--纈氨酸)二肽。

3.2 細(xì)胞毒和抗菌活性篩選及結(jié)果

3.2.1 細(xì)胞毒活性 采用CCK8法[18]檢測全部化合物對U343細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、NB4細(xì)胞、U937細(xì)胞的腫瘤增殖抑制活性。首先，在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞U343貼壁處理并將其培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h（37 ℃、5% CO2），而懸浮細(xì)胞（HL-60、NB4、U937）不用預(yù)培養(yǎng)，隨后向培養(yǎng)板加入10 μL濃度為100 μmol/L的待測化合物，將其放在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，再向每孔加入10 μL CCK8溶液，最后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～4 h后，通過酶標(biāo)儀測定其在450 nm處的吸光度（），重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每組設(shè)定3個復(fù)孔。按照公式計算抑制率，結(jié)果在10 μmol/L下，化合物均未顯示明顯的細(xì)胞毒活性。

抑制率＝1－(給藥－空白)/(0給藥－空白)

給藥為具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的；空白為具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的；0給藥為具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的

3.2.2 抗菌活性 用DMSO將待測樣品溶解，并分別配制成50、25、20、15 μg/mL質(zhì)量濃度，備用。蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和表皮金黃色葡萄球菌接種于TSB培養(yǎng)基，在37 ℃過夜。挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基TSB，在37 ℃條件下過夜培養(yǎng)。取190 μL TSB培養(yǎng)基、1 μL菌液、10 μL待測化合物于96孔板，并以萬古霉素（Vancomycin）作為陽性對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（微量肉湯稀釋法）[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度為25 μg/mL下，化合物9對蘇云金芽孢桿菌顯示抗菌活性。

4 討論

本研究從海綿的共附生鏈霉菌162432的發(fā)酵產(chǎn)物分離得到9個二酮哌嗪類化合物，其中化合物1為新化合物，化合物2和4～9均是首次從該種中分離得到。所分得的化合物在10 μg/mL下對上述腫瘤細(xì)胞增殖均未顯示出明顯的細(xì)胞毒活性；化合物9對蘇云金芽孢桿菌顯示出抗菌活性，最小抑菌濃度為25 μg/mL。該研究提示海綿共附生鏈霉菌是活性天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的一個新來源，具有重要的研究價值和廣闊的開發(fā)前景。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Vu H N T, Nguyen D T, Nguyen H Q,. Antimicrobial and cytotoxic properties of bioactive metabolites produced byYBQ59 isolated fromprels in yen Bai Province of Vietnam [J]., 2018, 75(10): 1247-1255.

[2] Wu C S, Zacchetti B, Ram A F J,. Expanding the chemical space for natural products by-co-cultivation and biotransformation [J]., 2015, 5: 10868.

[3] Zhen X, Gong T, Liu F,. A new analogue of echinomycin and a new cyclic dipeptide from a marine-derivedsp. LS298 [J]., 2015, 13(11): 6947-6961.

[4] Genilloud O. Actinomycetes: Still a source of novel antibiotics [J]., 2017, 34(10): 1203-1232.

[5] Zhang S Y. Morindolestatin, naturally occurring dehydromorpholinocarbazole alkaloid from soil-derived bacterium of the genus[J]., 2020, 22(3): 1113-1116.

[6] Sun J D, Zhao G X, O'Connor R D,. Vertirhodins A-F, C-linked pyrrolidine-iminosugar-containing pyranonaphthoquinones fromsp. B15-008 [J]., 2021, 23(3): 682-686.

[7] Marchbank D H, Ptycia-Lamky V C, Decken A,. Guanahanolide A, a meroterpenoid with a sesterterpene skeleton from coral-derivedsp [J]., 2020, 22(16): 6399-6403.

[8] An J S, Shin B, Kim T H,. Dumulmycin, an antitubercular bicyclic macrolide from a riverine sediment-derivedsp [J]., 2021, 23(9): 3359-3363.

[9] Jiao W H, Yuan, W L, Li Z Y,. Anti-MRSA actinomycins D1-D4from the marine sponge-associatedsp. LHW52447 [J]., 2018, 74(40): 5914-5919.

[10] Wang N, Cui C B, Li C W. A new cyclic dipeptide penicimutide: The activated production of cyclic dipeptides by introduction of neomycin-resistance in the marine-derived fungus[J]., 2016, 39(6): 762-770.

[11] Xiang W X, Liu Q, Li X M,. Four pairs of proline-containing cyclic dipeptides fromsp. HT88, an endophytic bacterium ofL [J]., 2020, 34(15): 2219-2224.

[12] 呂海寧, 陳輝, 屈晶, 等. 內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2015, 17(5)427-430.

[13] Cronan J M Jr, Davidson T R, Singleton F L,. Plant growth promoters isolated from a marine bacterium associated withsp [J]., 1998, 11(4): 271-278.

[14] 彭坤, 蘇瑞強(qiáng), 張改云, 等. 深海放線菌sp. R21的次生代謝產(chǎn)物研究 [J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(12): 2367-2371.

[15] Yang B, Dong J D, Zhou X F,. Proline-containing dipeptides from a marine sponge of aspecies [J]., 2009, 92(6): 1112-1117.

[16] Hwang J T, Jang H J, Kim J H,.KR-050L inhibit IL-6/STAT3 activation [J]., 2017, 122(5): 1412-1422.

[17] 龍聰, 劉小宇, 盧小玲, 等. 海洋亞硫酸桿菌M44的代謝產(chǎn)物研究 [J]. 中國抗生素雜志, 2012, 37(4): 51.

[18] Hong L L, Yu H B, Wang J,. Unusual anti-allergic diterpenoids from the marine sponge[J]., 2017, 7: 43138.

[19] Song T F, Chen M X, Ge Z WBioactive penicipyrrodiether A, an aadduct of GKK1032 analogue and phenol A derivative, from a marine-sourced fungussp. ZZ380 [J]., 2018, 83: 13395-13401.

Secondary metabolites of a marine sponge associated162432

CHEN Rui-qiang1, LUO Xiang-chao2, LIN Hou-wen1, 2, JIAO Wei-hua2

1. College of Food, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China 2. Research Center for Marine Drugs, State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China

To reveal the secondary metabolites of a marine sponge associated162432.The organic extract and fractions were separated and purified by octadecylsilyl silica (ODS) medium-pressure column chromatography (MPLC) and semi-preparative high-performance liquid chromatography (HPLC). The obtained purified compounds were identified by high-resolution-electrospray-mass spectrometry (HR-ESI-MS), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and literature data comparison. The absolute configuration of new compound was determined by NMR and electrostatic circular dichroism (ECD) calculations.Nine compounds were isolated from162432, including one new compound streptomyces dipeptide A (1) and eight known compounds: cyclo-(--Hyp--Phe) (2), cyclo-(-Pro--Phe) (3), cyclo-(-Hyp--Leu) (4), cyclo-(-Hyp--Leu) (5), cyclo-(-Pro--Leu) (6), cyclo-(-Pro--Leu) (7), cyclo-(-Pro--Ile) (8), cyclo-(-Leu--Val) (9). The cytotoxicity on tumor cell proliferation and antibacterial activities of the isolated compounds 1—9 were evaluated. None of compounds 1—9 showed significant cytotoxic activity on tumor cell proliferation at the concentration of 10g/mL; compound 9 showed antibacterial activity againstwith the minimal inhibitory concentration (MIC) value of 25 μg/mL.Compound 1 is a new compound, compound 2 and 4—9 are isolated fromfor the first time. Compound 9 showed antibacterial activity against.

marine sponge;162432; streptomyces dipeptide A; cyclo-(-Leu--Val); marine natural product; antibacterial activity

R284.1

A

0253 - 2670(2023)13 - 4104 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.003

2023-03-21

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2022YFC2804100）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（22137006）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82022068）

陳瑞強(qiáng)，碩士研究生，從事海洋天然產(chǎn)物研究。E-mail: 2823468021@qq.com

通信作者：林厚文，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楹Ｑ笏幬?。E-mail: Franklin67@126.com Tel: (021)68383346

焦偉華，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楹Ｑ笏幵捶肿拥慕Y(jié)構(gòu)與功能。E-mail: weihuajiao@hotmail.com Tel: (021)68383339

[責(zé)任編輯 王文倩]