岳蕓蕓 尚靖

關(guān)鍵詞：替代技術(shù)；化妝品；毒理學(xué)檢驗(yàn)；功效評價(jià)

隨著全球生命科學(xué)和信息技術(shù)的高速發(fā)展，動物實(shí)驗(yàn)替代技術(shù)作為實(shí)驗(yàn)動物學(xué)和毒理學(xué)學(xué)科的重要分支得到了快速發(fā)展，其應(yīng)用涵蓋了生物醫(yī)藥、化工和環(huán)境科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。從1959 年“3R”原則提出，60 年來，全球動物實(shí)驗(yàn)替代技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了起步和累積階段（1959 ～ 1990 年）和法規(guī)接受階段（1991 ～ 2012 年），目前已進(jìn)入快速發(fā)展階段（2013 ～ 2023 年）。自2013 年起，歐盟宣布全面禁止對化妝品成分進(jìn)行動物測試，并禁止銷售經(jīng)動物測試的化妝品和化妝品原料，截至目前，全球已經(jīng)有30 多個(gè)國家和地區(qū)實(shí)施了關(guān)于化妝品動物實(shí)驗(yàn)的禁令。受國際實(shí)驗(yàn)動物福利及“3R”原則的影響，我國科技部于1997 年在“九五”和“十五”計(jì)劃期間將實(shí)驗(yàn)動物替代研究列入實(shí)驗(yàn)動物基礎(chǔ)性研究的重點(diǎn)內(nèi)容，明確指出動物實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循“3R”原則。并且自2014 年起，首次免除國產(chǎn)非特殊用途化妝品的強(qiáng)制性動物實(shí)驗(yàn)要求，近20 多年來我國有序穩(wěn)步地推進(jìn)化妝品替代實(shí)驗(yàn)的發(fā)展。目前，相關(guān)技術(shù)主要用于毒理學(xué)檢測和安全評估方面。本文對國內(nèi)外動物實(shí)驗(yàn)替代的發(fā)展歷程與新替代技術(shù)進(jìn)行了綜述，為我國化妝品的國際化發(fā)展提供借鑒。

20 世紀(jì)初，全球范圍內(nèi)多起嚴(yán)重的藥品安全事故推動了動物實(shí)驗(yàn)在新藥開發(fā)過程中應(yīng)用于毒理和安全性測試。1938 年，F(xiàn)DA 頒布的《聯(lián)邦食品藥品及化妝品法案》要求化妝品提供確保安全性的證明，實(shí)施“動物試驗(yàn)強(qiáng)制令”。毫無疑問，動物試驗(yàn)為人類健康作出了重要貢獻(xiàn)。從概念及內(nèi)涵上看，動物實(shí)驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動物為材料，采用各種方法在實(shí)驗(yàn)動物身上進(jìn)行的科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，但實(shí)驗(yàn)周期長、花費(fèi)大，且由于種屬差異等使實(shí)驗(yàn)結(jié)果在預(yù)測人體毒性風(fēng)險(xiǎn)時(shí)存在著不確定性[1-3]。

1959 年，英國學(xué)者Russell和Burch 最早在著名出版物《Theprinciples of humane experimentaltechnique 》（《人道主義實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理》） 中系統(tǒng)提出“3R” 原則，即通過使用無知覺的材料代替（replace）有意識的活體高等動物，在確保獲取一定數(shù)量和精度的信息前提下盡量減少（reduction） 動物使用量，采取優(yōu)化措施（refinement） 減輕動物痛苦的發(fā)生和嚴(yán)重程度[4]。1978年，David Smith 在《Alternatives toanimal experimentation 》一書中將“3R”統(tǒng)稱為“替代”（Alternatives）?！?R” 不僅是替代方法的發(fā)展方向，也是替代方法的代名詞，更是動物實(shí)驗(yàn)替代方法的核心和主要研究內(nèi)容。替代試驗(yàn)與“3R” 原則反映了實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)由技術(shù)上的嚴(yán)格要求轉(zhuǎn)向人道主義管理，在保證實(shí)驗(yàn)科學(xué)性的前提下盡可能地減少實(shí)驗(yàn)動物的使用、減輕或消除動物痛苦，提倡實(shí)驗(yàn)動物福利與動物保護(hù)[2]。20 世紀(jì)下半葉，全球各地替代方法研究和驗(yàn)證機(jī)構(gòu)的成立推動了全球替代方法的推廣和應(yīng)用[4-6]。至20 世紀(jì)80 年代，動物保護(hù)組織反對化妝品的動物測試，以歐盟為首的多個(gè)國家和地區(qū)實(shí)施化妝品動物實(shí)驗(yàn)禁令；到2022 年9 月，美國參議院通過FDA 現(xiàn)代化法案《FDA Modernization Act 2.0 》，其中提到終止“動物實(shí)驗(yàn)強(qiáng)制令”，標(biāo)志著動物實(shí)驗(yàn)在全球多個(gè)國家和地區(qū)由“強(qiáng)制執(zhí)行” 轉(zhuǎn)為“強(qiáng)制禁止”。

化妝品的安全性和功效性評價(jià)在保障化妝品質(zhì)量和消費(fèi)者使用安全方面具有重要意義，尤其是隨著國際動物福利和“3R” 理念的發(fā)展與科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的替代新方法、新工具被應(yīng)用到化妝品評價(jià)中。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，F(xiàn)DA 于2022 年9 月提出新的指導(dǎo)方針，要求減少動物試驗(yàn)并盡量利用動物實(shí)驗(yàn)替代技術(shù)取代動物試驗(yàn)?；瘖y品領(lǐng)域，目前世界范圍禁止動物實(shí)驗(yàn)主要有兩種模式：一是歐盟、印度等采用的一刀切形式，全面禁止各種動物實(shí)驗(yàn)；二是依據(jù)科學(xué)的發(fā)展規(guī)律，切實(shí)考慮到安全性評價(jià)的實(shí)際需要，只禁止部分存在其他優(yōu)選方法的動物實(shí)驗(yàn)，分階段試行，其中我國和日本等國家采用后者。

全球化妝品動物替代的發(fā)展歷程

世界動物保護(hù)組織很早就提出疑問，化妝品僅僅是為了人類自己的美麗，而要給動物帶來痛苦和死亡，這不符合人道主義，這也是目前國際上反對進(jìn)行化妝品動物實(shí)驗(yàn)的主要理由。而這種動物保護(hù)主義的呼聲客觀地推動了動物替代方法在化妝品毒性實(shí)驗(yàn)中的研究和開展?！?R” 理論的提出，影響著世界各國有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物法規(guī)的研究和制定，并激勵(lì)著科學(xué)家和研究機(jī)構(gòu)投入替代技術(shù)開發(fā)[7]。

1969 年，英國成立了醫(yī)學(xué)試驗(yàn)用動物中替代法基金會（FRAME），成為全球最早的替代方法研究機(jī)構(gòu)，此后世界各國相繼成立替代方法研究和驗(yàn)證中心，開展替代方法的研究、驗(yàn)證、標(biāo)準(zhǔn)化和推廣應(yīng)用。1994 年，世界經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織（OECD） 開始編制替代方法的驗(yàn)證指南。這些替代方法驗(yàn)證機(jī)構(gòu)的成立，使得大量研發(fā)投入產(chǎn)生的新技術(shù)、新方法和新產(chǎn)品有了被法規(guī)認(rèn)可的渠道，推動了替代技術(shù)的進(jìn)步。其中，經(jīng)替代方法驗(yàn)證中心認(rèn)可的試驗(yàn)方法可以申請納入OECD、人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）、國際化妝品監(jiān)管合作組織（ICCR） 或其他國家地區(qū)的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。2013 年3 月11 日起，歐盟完成了化妝品及成分的動物試驗(yàn)禁令和銷售禁令的實(shí)施，給全球法規(guī)和替代方法的研究帶來深遠(yuǎn)的影響[8-9]。2008 年，ICCR 成立替代試驗(yàn)方法國際合作組織（ICATM） 相關(guān)工作組，以加強(qiáng)技術(shù)交流與合作，并逐步對已有替代方法組織討論，并列出認(rèn)為可用于化妝品的方法，涉及皮膚刺激性/ 腐蝕性、光毒性、眼刺激性/ 腐蝕性、急性毒性、內(nèi)分泌干擾物、基因毒性等，多為OECD 發(fā)布方法。隨后幾年，逐步對列舉方法做出更新[10]。

我國科技部最早于1997 年在“九五” 和“十五” 計(jì)劃期間將動物實(shí)驗(yàn)替代研究列入實(shí)驗(yàn)動物基礎(chǔ)性研究的重點(diǎn)內(nèi)容，明確指出動物實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循“3R” 原則，并于2006 年發(fā)布了《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。2011年，國家藥品監(jiān)督管理局啟動《化妝品動物實(shí)驗(yàn)替代方法體系研究》項(xiàng)目；2018 年，中檢院成立全國化妝品替代方法研究與驗(yàn)證工作組。但截至目前，我國尚無“3R” 立法及國家層面的替代中心來主導(dǎo)替代方法的研究和驗(yàn)證工作。到2016 年，首個(gè)替代方法被納入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》，標(biāo)志著我國正跟隨國際化妝品替代的步伐，穩(wěn)步推進(jìn)化妝品產(chǎn)業(yè)的國際化水平（見圖1）[11，12]。

我國化妝品動物實(shí)驗(yàn)替代方法的現(xiàn)狀

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和化妝品動物禁令的不斷推廣 ，動物替代試驗(yàn)的發(fā)展和應(yīng)用成為化妝品評價(jià)中的重要課題。我國在動物替代試驗(yàn)技術(shù)研究和方法推行方面起步較晚，但在化妝品動物替代試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可方面緊隨國際標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展趨勢。2016 年，《化妝品用化學(xué)原料體外3T3 中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法》是首個(gè)被納入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》（以下簡稱“《規(guī)范》”） 的替代方法。截至目前，我國已有近10 項(xiàng)替代方法被列入《規(guī)范》，此外還在同步針對多項(xiàng)OECD 驗(yàn)證的方法進(jìn)行研究、驗(yàn)證和轉(zhuǎn)化。但目前我國化妝品行業(yè)發(fā)展和產(chǎn)品注冊備案對動物實(shí)驗(yàn)替代方法仍然需求迫切，化妝品替代標(biāo)準(zhǔn)不足和必需的細(xì)胞、模型或試劑等存在國際技術(shù)壟斷的現(xiàn)狀，因此，重點(diǎn)研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)、助力產(chǎn)業(yè)、服務(wù)注冊備案的靶標(biāo)細(xì)胞系、3D 組織、器官芯片、低等模式生物等模型及技術(shù)是我國化妝品行業(yè)未來替代方法發(fā)展重點(diǎn)關(guān)注的方向（見表1）[13，14]。

下一代替代理念與技術(shù)的興起

隨著生命科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，全球替代方法進(jìn)入快速發(fā)展階段，在21 世紀(jì)毒性測試新觀念（TT21C）、整合測試評估策略（IATA）、有害結(jié)局通路（AOP）、下一代風(fēng)險(xiǎn)評估（NGRA）等理論的指導(dǎo)下出現(xiàn)一系列的新技術(shù)、新方法， 如靶標(biāo)細(xì)胞模型、器官芯片、低等模式生物、計(jì)算毒理學(xué)等高通量的動物實(shí)驗(yàn)替代新技術(shù)。傳統(tǒng)的替代技術(shù)，主要體現(xiàn)為動物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)向體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換而建立的方法，如體外細(xì)胞培養(yǎng)、離體器官等。在現(xiàn)代替代方法中，則體現(xiàn)在充分理解生物學(xué)過程及在分子機(jī)制的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)及信息技術(shù)，如非生物測試技術(shù)（如定量構(gòu)效關(guān)系、交叉參照、分類法、毒理學(xué)閾值、計(jì)算毒理學(xué)等）、基因編輯技術(shù)、組學(xué)技術(shù)（基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、脂質(zhì)組）、基于微生理的組織工程技術(shù)、干細(xì)胞技術(shù)、圖像識別技術(shù)、計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)等，使替代方法更多元化，也更符合人整體的生理病理過程[15-18]。

1. 整合測試評估方法與有害結(jié)局路徑評價(jià)技術(shù)

由于單一替代方法存在局限性和適用性問題，因此在毒理學(xué)全面評估中可參考OECD 發(fā)布的整合測試與評估方法（IATA） 指南，進(jìn)而合理地、科學(xué)地采用單一方法的組合模式。評估過程不僅可以考慮現(xiàn)有的測試方法，還加入計(jì)算機(jī)預(yù)測方法、化學(xué)結(jié)構(gòu)特征信息、人群暴露等。此外，對于復(fù)雜的毒性終點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)評估，也可以采用IATA，以避免單一替代方法無法完整覆蓋有害結(jié)局路徑（AOP） 全過程的局限。如OECD 于2016 年通過皮膚致敏AOP 框架，皮膚致敏的 AOP 事件總共包含 4 個(gè)“關(guān)鍵事件”：關(guān)鍵事件 1（KE1） 分子啟動事件是親電物質(zhì)與皮膚中的親核中心共價(jià)結(jié)合，為分子層面的表達(dá)（替代方法為DPRA，ADRA）；KE2 事件是角質(zhì)細(xì)胞的活化，為細(xì)胞水平的表達(dá)（替代方法為KeratinoSensTM，Lusens）；KE3 是樹突狀細(xì)胞的活化，為細(xì)胞水平的表達(dá)（替代方法為h-CLAT，U-SENS，IL-8-Luc）；KE4 是 T 細(xì)胞活化和增殖，為組織器官層面的表達(dá)檢測（替代方法為LLDA）[19，20]。

2. 基于干細(xì)胞的評價(jià)技術(shù)

干細(xì)胞具有無限增殖及分化潛能，利用人胚胎干細(xì)胞（ESCs） 或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSCs） 技術(shù)，為替代方法的研究提供了穩(wěn)定的人源化干細(xì)胞衍生細(xì)胞的來源，有望在一定程度上解決物種間外推的需要。例如，利用iPSCs 定向誘導(dǎo)分化腎近端小管上皮細(xì)胞，可用于評價(jià)靶器官毒性的替代方法開發(fā)；利用iPSCs 定向誘導(dǎo)分化角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種皮膚組織的細(xì)胞類型，可用于構(gòu)建體現(xiàn)皮膚結(jié)構(gòu)與功能特征的人源化的表皮、全皮和功能性皮膚類器官模型。但多能干細(xì)胞誘導(dǎo)形成各類組織細(xì)胞類型的一致性、穩(wěn)定性和功能性是干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于替代方法開發(fā)中需要解決的關(guān)鍵問題[5，21]。

3. 基于組學(xué)分析的評價(jià)技術(shù)

近年來，基于人體遺傳物質(zhì)信息傳遞及機(jī)體代謝流程的多組學(xué)技術(shù)，包括基因組學(xué)（遺傳信息）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA）、蛋白質(zhì)組學(xué)（基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)）、代謝組學(xué)（代謝產(chǎn)物）、脂質(zhì)組學(xué)（脂質(zhì)類代謝產(chǎn)物）、微生物組學(xué)（與人體共生的微生物，如細(xì)菌、真菌等） 在內(nèi)的組學(xué)技術(shù)得到了快速發(fā)展。

人們逐漸從過去關(guān)注某一個(gè)基因、蛋白或代謝產(chǎn)物的變化轉(zhuǎn)向關(guān)注整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化，這使研究者們從更為宏觀的角度去發(fā)現(xiàn)生物體生理代謝的整體微觀變化，有助于推動建立更有效的安全性評估策略和毒性預(yù)測技術(shù)[5，15]。

4. 基于組織工程的評價(jià)技術(shù)

器官芯片是由微流控設(shè)備與活細(xì)胞結(jié)合而成的微型結(jié)構(gòu)，可在體外重現(xiàn)體內(nèi)器官的生理和病理特征。盡管ICCR 將器官芯片技術(shù)應(yīng)用于化妝品原料風(fēng)險(xiǎn)評估中被認(rèn)為是目前尚不足以成熟運(yùn)用的方法。但2022 年8 月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了全球首個(gè)完全基于“類器官芯片” 研究獲得臨床前數(shù)據(jù)的新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)（NCT04658472），成為行業(yè)里程碑事件。模擬皮膚結(jié)構(gòu)的3D 皮膚模型是組織工程技術(shù)在皮膚方面的成功應(yīng)用實(shí)例。

由于進(jìn)口3D 皮膚模型的儲存、運(yùn)輸以及使用的時(shí)效性問題，OECD 中的替代方法TG 431、439、498，利用3D 皮膚器官芯片進(jìn)行化妝品原料或成品的皮膚腐蝕性、刺激性、光毒性等安全性測試，目前在我國尚未推廣應(yīng)用。因此，構(gòu)建自主知識產(chǎn)權(quán)3D 組織器官模型，建立皮膚芯片、多器官級聯(lián)系統(tǒng)，如結(jié)合微流控技術(shù)構(gòu)建3D肝—皮膚、腎—皮膚雙器官芯片模型，通過理化試驗(yàn)方法、分子生物學(xué)方法、病理染色及診斷技術(shù)對模型進(jìn)行表征和驗(yàn)證是我國組織工程技術(shù)應(yīng)用于化妝品替代方法開發(fā)的關(guān)鍵方向。

此外，器官芯片中所使用細(xì)胞的來源及異質(zhì)性問題，限制了器官芯片的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；皺z測穩(wěn)定性；而缺少系統(tǒng)性環(huán)境，如血管、神經(jīng)、屏障功能等也限制了其適用范圍。因此，未來器官芯片領(lǐng)域是否提供即用型穩(wěn)定的微流體設(shè)備，能否提供完全可操作、適用性強(qiáng)的器官芯片，能否提供從初始設(shè)計(jì)到售后的全方位服務(wù)解決方案是行業(yè)發(fā)展的方向[15，22]。

5. 基于低等脊椎動物的系統(tǒng)評價(jià)技術(shù)

近年來，以斑馬魚為代表的低等脊椎動物，由于實(shí)驗(yàn)材料豐富、成本低、研究時(shí)間短、直觀性好等優(yōu)勢，成為替代模型候選生物材料。目前，斑馬魚已被廣泛用于環(huán)境毒性檢測、藥物早期高通量篩選等毒性測試中。針對斑馬魚在生態(tài)環(huán)境檢測中的應(yīng)用，OECD 專門制定了一系列基于斑馬魚的毒性測試操作指南。根據(jù)歐盟動物保護(hù)法規(guī)定，5 天以內(nèi)的斑馬魚胚胎和幼魚由于自帶卵黃囊，無須進(jìn)食，因此不受動物保護(hù)法限制，被國際科學(xué)家大力推薦用于替代哺乳動物測試，符合“3R” 原則。

多項(xiàng)研究表明斑馬魚皮膚結(jié)構(gòu)、功能以及生物信號傳導(dǎo)通路都與人類皮膚具有一定相似性。而國際上早在20 世紀(jì)90 年代就開始應(yīng)用斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行色素調(diào)節(jié)成分的篩選和評價(jià)、抗紫外線成分的篩選和評價(jià)、防曬劑、染發(fā)劑、激素以及納米材料的體內(nèi)毒理學(xué)評價(jià)、皮膚傷口炎癥反應(yīng)與愈合機(jī)理、皮膚色素沉著機(jī)理及修護(hù)方法等方面的皮膚科學(xué)研究以及化妝品開發(fā)研究。此外，針對我國的原料，有近三分之一是組分和濃度不確定的動植物提取物，斑馬魚作為整體模型具備細(xì)胞和離體組織器官不具備的多維評價(jià)潛能。但值得注意的是，由于斑馬魚缺乏皮膚角質(zhì)層、毛囊、皮脂腺等皮膚結(jié)構(gòu)，且我國實(shí)驗(yàn)用魚尚缺少標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，因此，開展模式動物斑馬魚應(yīng)用于化妝品安全及功效評價(jià)的適用性研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及試驗(yàn)管理規(guī)范對于推進(jìn)斑馬魚應(yīng)用于化妝品研究與評價(jià)具有重要意義。

總結(jié)與展望

動物實(shí)驗(yàn)替代技術(shù)是未來發(fā)展的趨勢。皮膚組織是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)調(diào)控器官。作為化妝品安全及功效評價(jià)的替代模型，首先要關(guān)注模型與人體皮膚組織生理反應(yīng)的相關(guān)性，使用時(shí)需要考慮方法的局限性和適用條件[23]。替代方法的結(jié)果應(yīng)當(dāng)與預(yù)期回答的毒性或功效終點(diǎn)之間建立預(yù)測關(guān)系，如何建立與人類皮膚生理反應(yīng)更相關(guān)、重復(fù)性好、評價(jià)可信度高且可標(biāo)準(zhǔn)化、易推廣的替代模型，是未來動物實(shí)驗(yàn)替代技術(shù)在全球化妝品行業(yè)推廣應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)問題。但同時(shí)我們應(yīng)該認(rèn)識到，動物是一個(gè)完整的生物系統(tǒng)，這是任何一個(gè)替代方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)。只有這樣，才能避免夸大替代方法的作用，給替代方法一個(gè)正確的、客觀的評價(jià)。

總的來看，我國化妝品動物實(shí)驗(yàn)替代方法研究起步較晚，與歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)還存在一定差距。我們需要加強(qiáng)對人體皮膚生理反應(yīng)、分子機(jī)制的充分理解認(rèn)識，并在此基礎(chǔ)上加強(qiáng)替代方法的研究與驗(yàn)證工作，開發(fā)精準(zhǔn)的、科學(xué)的、可驗(yàn)證、可重復(fù)推廣的動物實(shí)驗(yàn)替代方法，推動我國化妝品行業(yè)與全球技術(shù)接軌，這也是保證我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會進(jìn)步的需要[24，25]。