李艷萍，王協(xié)濤，史立彬，劉瓊

根據(jù)獨特的形態(tài)特征，細胞死亡主要被分為細胞凋亡、自噬性細胞死亡以及壞死［1］。2012 年，Dixon提出鐵死亡的概念，這種細胞死亡方式是基于脂質(zhì)活性氧物質(zhì)的積累而引起的鐵依賴性調(diào)節(jié)的細胞死亡形式，具有不同于其他形式的分子特征［2］，在器官損傷以及腫瘤、神經(jīng)退行性病變等疾病中起著關鍵作用［3］。鐵死亡不僅表現(xiàn)為線粒體變小、膜密度增高和嵴減少，還表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化升高。研究表明鐵死亡也與肺部疾病密切相關［4］。白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種天然植物抗毒素多酚，可從漿果、葡萄皮及花生中提取，具有抗氧化、調(diào)節(jié)線粒體呼吸、抗炎及抗癌等特性［5-6］。然而，RES 對過氧化氫（H2O2）誘導的肺泡上皮細胞損傷的影響尚不清楚。研究表明，核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是調(diào)節(jié)抗氧化反應的關鍵因素之一，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）4 是受Nrf2 調(diào)控的基因之一，且Nrf2-GPX4 通路對鐵死亡的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用［7］。研究表明，激活Nrf2-GPX4通路、抑制鐵死亡可改善尿毒癥引起的急性肺損傷［8］。但該通路在H2O2處理的肺泡上皮細胞中是否具有同樣的作用尚未得到證實。本研究以H2O2處理肺泡上皮細胞A549，通過檢測鐵死亡相關指標，探究RES對H2O2誘導A549細胞鐵死亡以及Nrf2-GPX4信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 A549 細胞購自中國科學院上海細胞庫。RES（上海源葉生物科技有限公司）；H2O2溶液（上海赫澎生物科技有限公司）；Nrf2抑制劑ML385（北京百奧萊博科技有限公司）；MTT 試劑（上海澤葉生物技術有限公司）；丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；鐵離子試劑盒（浙江奧的特生物技術有限公司）；兔抗人Nrf2、GPX4、血紅素加氧酶（HO-1）、β-actin 一抗及羊抗兔IgG 二抗（Abcam 公司）。CO2培養(yǎng)箱、Talos F200X S/TEM 透射電子顯微鏡（Thermo scientific公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組及干預 將A549 細胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基接種，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%融合時進行傳代。取對數(shù)生長期細胞，按隨機數(shù)字表法分為對照組、H2O2組、RES 低濃度（RES-L）組、RES中濃度（RES-M）組、RES高濃度（RES-H）組、ML385 組、RES-H+ML385 組。除對照組外，其余各組均經(jīng)0.5 mmol H2O2處理細胞［9］。24 h后，RES-L組、RES-M組、RES-H組分別設置培養(yǎng)基中RES濃度為50、100、150 μmol/L干預［10］；ML385 組設置培養(yǎng)基中ML385 濃度為2 μmol/L干預［11］；RES-H+ML385組設置培養(yǎng)基中RES、ML385濃度分別為150μmol/L、2μmol/L干預，干預48 h后進行指標分析。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力 取各組對數(shù)生長期A549細胞接種于96 孔板，避光條件下每孔加入10μL MTT 試劑，室溫孵育4 h后，加入150μL DMSO，采用酶標儀在490 nm波長處測量光密度（OD490）。細胞存活率（%）=（實驗組OD490/對照組OD490）×100%。

1.2.3 鐵離子含量的檢測 取各組細胞，使用離心機以3 000 r/min離心15 min，留取上清液，嚴格按照鐵離子試劑盒說明書檢測鐵離子含量。

1.2.4 線粒體形態(tài)變化觀察 將各組細胞使用2.5%戊二醛固定，定位后制備50～70 nm超薄切片，利用枸櫞鉛酸染色，于透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.5 ELISA 測定細胞內(nèi)氧化應激水平 收集各組細胞，嚴格按照ELISA 試劑盒方法測定各組細胞中MDA、SOD、GSH含量。

1.2.6 Western blot 法檢測細胞中Nrf2、GPX4、HO-1 蛋白表達水平 蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，定量后，進行電泳分離、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，依次加入Nrf2、GPX4、HO-1、β-actin 一抗（均1∶1 000），4 ℃恒溫箱過夜；次日加入二抗（1∶2 000），以ECL 發(fā)光試劑、凝膠成像儀進行檢測，以βactin為內(nèi)參，分析細胞中不同蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2 組間均數(shù)比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RES 對H2O2誘導的A549 細胞存活率和鐵離子含量的影響 與對照組相比，H2O2組A549細胞存活率降低，鐵離子含量增加（P＜0.05）；與H2O2組相比，RES-L組、RES-M組、RES-H組A549細胞存活率逐漸升高，鐵離子含量逐漸降低（P＜0.05），但ML385組A549細胞存活率明顯降低，鐵離子含量增加（P＜0.05）；與RES-H 組相比，RES-H+ML385 組A549 細胞存活率降低，鐵離子含量升高（P＜0.05）；與ML385 組相比，RES-H+ML385 組A549 細胞存活率升高，鐵離子含量降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of survival rate and iron content of A549 cells between different groups表1 各組A549細胞存活率和鐵離子含量比較（n=6，）

Tab.1 Comparison of survival rate and iron content of A549 cells between different groups表1 各組A549細胞存活率和鐵離子含量比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與H2O2組比較，c與RES-L 組比較，d與RES-M組比較，e與RES-H組比較，f與ML385組，P＜0.05。

組別對照組H2O2組RES-L組RES-M組RES-H組ML385組RES-H+ML385組F細胞存活率（%）100.00±0.00 36.27±1.88a 51.15±2.34b 66.29±2.61bc 95.82±2.87bcd 21.35±1.25b 37.01±1.69ef 1 368.036＊＊鐵離子含量（μg/g）95.12±9.51 238.61±23.84a 182.36±18.23b 142.31±14.23bc 95.72±9.57bcd 279.64±27.94b 236.12±23.61ef 86.010＊＊

2.2 RES 對H2O2誘導A549 細胞內(nèi)氧化應激水平的影響 與對照組相比，H2O2組A549 細胞內(nèi)SOD、GSH 含量降低，MDA 含量增加（P＜0.05）；與H2O2組相比，RES-L 組、RES-M 組、RES-H 組A549 細胞內(nèi)SOD、GSH 含量依次增加，MDA 含量依次降低（P＜0.05），但ML385 組A549 細胞內(nèi)SOD、GSH 含量降低，MDA 含量增加（P＜0.05）；與RES-H 組相比，RES-H+ML385組A549細胞內(nèi)SOD、GSH含量降低，MDA 含量增加（P＜0.05）；與ML385 組相比，RESH+ML385 組A549 細胞內(nèi)SOD、GSH 含量增加，MDA含量降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of oxidative stress levels in A549 cells between different groups表2 各組A549細胞內(nèi)氧化應激水平比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of oxidative stress levels in A549 cells between different groups表2 各組A549細胞內(nèi)氧化應激水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與H2O2組比較，c與RES-L 組比較，d與RES-M組比較，e與RES-H組比較，f與ML385組，P＜0.05。

組別對照組H2O2組RES-L組RES-M組RES-H組ML385組RES-H+ML385組F SOD（U/mg）35.16±3.56 16.25±1.62a 22.36±2.24b 28.68±2.87bc 35.18±3.51bcd 10.59±1.05b 16.35±1.63ef 89.533＊＊GSH（mmol/g）239.68±23.96 126.26±12.52a 153.65±15.36b 182.35±18.24bc 233.64±23.36bcd 93.36±8.53b 127.18±12.72ef 63.216＊＊MDA（μmol/g）4.68±0.46 14.52±1.45a 8.34±0.83b 6.65±0.62bc 4.72±0.47bcd 21.21±2.12b 14.48±1.45ef 160.027＊＊

2.3 RES 對H2O2誘導A549 細胞線粒體形態(tài)變化的影響 與對照組相比，H2O2組A549細胞線粒體發(fā)生膜皺縮、密度增加、面積縮小等形態(tài)損傷；與H2O2組相比，RES-L組、RES-M組、RES-H組線粒體形態(tài)損傷現(xiàn)象逐漸得到改善，但ML385 組線粒體形態(tài)損傷進一步加重；與RES-H組相比，RES-H+ML385組線粒體形態(tài)損傷明顯加重；與ML385組相比，RES-H+ML385組損傷程度輕微改善，見圖1。

Fig.1 Mitochondrial morphological changes of A549 cells in each group(×10 000)圖1 各組A549細胞線粒體形態(tài)變化（×10 000）

2.4 RES 對H2O2誘導A549 細胞Nrf2、GPX4、HO-1蛋白表達水平的影響 與對照組相比，H2O2組Nrf2、GPX4、HO-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與H2O2組相比，RES-L 組、RES-M 組、RES-H 組Nrf2、GPX4、HO-1 蛋白表達水平依次增加（P＜0.05），但ML385組Nrf2、GPX4、HO-1蛋白表達水平依次降低（P＜0.05）；與RES-H 組相比，RES-H+ML385 組Nrf2、GPX4、HO-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與ML385 組相比，RES-H+ML385 組Nrf2、GPX4、HO-1蛋白表達水平增加（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Western blot results of Nrf2,GPX4 and HO-1 proteins in A549 cells of each group圖2 各組A549細胞中Nrf2、GPX4、HO-1蛋白免疫印跡圖

Tab.3 Comparison of protein expression levels of Nrf2,GPX4 and HO-1 in A549 cells between different groups表3 各組A549細胞中Nrf2、GPX4、HO-1蛋白表達水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of protein expression levels of Nrf2,GPX4 and HO-1 in A549 cells between different groups表3 各組A549細胞中Nrf2、GPX4、HO-1蛋白表達水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與H2O2組比較，c與RES-L 組比較，d與RES-M組比較，e與RES-H組比較，f與ML385組，P＜0.05。

組別對照組H2O2組RES-L組RES-M組RES-H組ML385組RES-H+ML385組F Nrf2 0.76±0.07 0.28±0.03a 0.42±0.04b 0.59±0.06bc 0.73±0.07bcd 0.11±0.01b 0.26±0.02ef 160.317＊＊HO-1 0.89±0.09 0.31±0.03a 0.56±0.05b 0.72±0.07bc 0.87±0.08bcd 0.18±0.02b 0.28±0.03ef 149.344＊＊GPX4 0.94±0.09 0.35±0.03a 0.54±0.05b 0.73±0.07bc 0.92±0.09bcd 0.16±0.02b 0.37±0.03ef 147.147＊＊

3 討論

了解肺臟上皮干/祖細胞的調(diào)控網(wǎng)絡有助于研究肺損傷等呼吸系統(tǒng)疾病進展的機制［12］。肺泡細胞是肺臟上皮干/祖細胞的一種，研究影響肺泡細上皮胞氧化損傷的機制對于呼吸系統(tǒng)疾病的治療意義重大。

鐵元素在人體中發(fā)揮重要作用，正常狀態(tài)下，細胞中鐵含量處于平衡狀態(tài)，參與細胞的正常發(fā)育和存活，而鐵含量一旦超出細胞可容納的范圍時則標志著鐵死亡的發(fā)生。鐵死亡誘導因子可通過不同途徑直接或間接影響GPX 表達，導致細胞內(nèi)抗氧化能力下降、脂質(zhì)活性氧積累，最終導致細胞發(fā)生氧化損傷。近年來的研究表明，鐵死亡與血液疾病、缺血再灌注損傷、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎損傷等多種疾病的病理生理過程密切相關，因此通過抑制鐵死亡來治療相關疾病已成為當前研究的熱點［13］。鐵死亡涉及的因素較多，包括順鉑、細顆粒物等。H2O2作為一種強氧化劑，可以破壞細胞分子，使其處于氧化應激狀態(tài)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，造成鐵離子過度積累，最終使細胞受損死亡［3，14］。本研究采用H2O2誘導A549細胞，結果發(fā)現(xiàn)H2O2組線粒體形態(tài)較對照組受損嚴重，細胞存活率、SOD、GSH 含量均明顯降低，鐵離子、MDA含量明顯增加，提示H2O2可使A549細胞產(chǎn)生鐵死亡。

RES是一種多酚，具有抗氧化應激特性，可通過抑制鐵死亡來保護腦出血大鼠免受神經(jīng)損傷［15］。Li等［16］研究證實RES通過抑制氧化應激、鐵死亡，對氧葡萄糖剝奪/復氧（OGD/R）誘導的H9c2 細胞起保護作用。Zhang 等［17］研究發(fā)現(xiàn)RES 可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，抑制丙烯醛誘導的鐵死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與H2O2組相比，隨著RES劑量的增加，線粒體形態(tài)損傷狀況得到改善，細胞存活率、SOD、GSH含量逐漸增加，鐵離子、MDA 含量逐漸下降，表明RES 尤其高劑量RES可以提高抗氧化應激水平，抑制細胞損傷，避免鐵死亡。

Nrf2-GPX4信號通路可影響與鐵死亡相關的酶和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［18］。Wu 等［19］研究發(fā)現(xiàn)激活Nrf2信號通路可促進下游HO-1、GPX4水平表達，抑制葡萄糖誘導的系膜細胞鐵死亡。Liu 等［20］研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞鐵死亡。本研究結果顯示，H2O2組Nrf2、GPX4、HO-1 蛋白表達較對照組均降低，說明H2O2誘導的A549細胞中Nrf2-GPX4信號通路處于阻滯狀態(tài)；與H2O2組相比，RES隨著劑量的增加，Nrf2、GPX4、HO-1 蛋白表達逐漸增加，表明RES 可能通過激活Nrf2-GPX4 信號通路，降低氧化應激水平，減輕H2O2誘導的A549細胞鐵死亡。為進一步驗證該猜想，本研究使用Nrf2 抑制劑ML385 處理H2O2誘導的A549 細胞，結果發(fā)現(xiàn)細胞存活率、SOD、GSH 含量以及Nrf2、GPX4、HO-1 蛋白表達較H2O2組均降低，鐵離子、MDA含量增加，同時可逆轉(zhuǎn)RES對A549細胞的保護作用，說明RES可通過激活Nrf2-GPX4通路，減輕H2O2誘導的A549細胞中氧化應激以及鐵死亡。

綜上所述，RES 可以降低氧化應激水平，減輕H2O2誘導的A549 細胞鐵死亡，作用機制與Nrf2-GPX4信號通路的激活有關，但本研究僅在體外證實了RES對H2O2誘導的A549細胞鐵死亡的影響機制，在體內(nèi)的作用機制還需繼續(xù)探索。