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黑豆、半成品和成品淡豆豉中6 種異黃酮含量變化比較

2023-07-07 10:21:46江玥曈高蔥蔥張玉佳歐煬育周婷婷海軍軍醫(yī)大學藥學系藥物分析學教研室上海200433上海市藥物中藥代謝產物研究重點實驗室上海200433安徽中醫(yī)藥大學安徽合肥23002
藥學實踐雜志 2023年6期
關鍵詞:淡豆豉黑豆異黃酮

江玥曈,高蔥蔥,張玉佳,歐煬育,周婷婷 (.海軍軍醫(yī)大學藥學系藥物分析學教研室, 上海, 200433;2.上海市藥物(中藥)代謝產物研究重點實驗室, 上海 200433;3.安徽中醫(yī)藥大學, 安徽 合肥, 23002)

黑豆是由豆科植物大豆[Glycine max (Linn.)Merr.]的成熟種子,淡豆豉是由黑豆經發(fā)酵后加工而成[1]。淡豆豉性味苦且辛涼,具有解表、除煩和清解郁熱的功效,可用于治療頭痛感冒、胸悶煩躁、失眠等癥狀。淡豆豉中含有異黃酮、多糖、氨基酸、蛋白、皂苷、纖溶酶等成分,其中異黃酮類被廣泛認為是主要活性成分之一。研究發(fā)現,淡豆豉還具有抗細菌、降低血糖、調節(jié)腸道菌群及抗癌等藥理活性[2-6]。

本課題組按照前期優(yōu)化的發(fā)酵工藝自制淡豆豉,并建立通過高效液相色譜對淡豆豉中6 種異黃酮進行含量測定的方法[7-8]。依據建立的分析方法對發(fā)酵前的黑豆、發(fā)酵后的半成品和成品淡豆豉中6 種異黃酮的含量進行檢測,比較黑豆發(fā)酵前后和不同程度發(fā)酵條件下淡豆豉中6 種異黃酮的含量變化,為進一步完善淡豆豉的發(fā)酵工藝和深入研究淡豆豉中異黃酮類化合物的藥理活性奠定研究基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

SHIMAZULC-20ADXR 高效液相色譜儀(日本島津制作所);KQ-800DE 數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Sartorius SQP 型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司);YF103-200G高速中藥粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司);DHG9420 電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);AnkeTDL-2B 臺式低速離心機(濟南存昌生物技術有限公司);Hitech Smart-S15 純水儀(上海和泰儀器有限公司)。

1.2 試劑

大豆苷對照品(批號AZ21091701)、黃豆黃苷對照品(批號AZ22052701)、染料木苷對照品(批號AZ21090901)、大豆苷元對照品(批號AZ21102201)、黃豆黃素對照品(批號AZ22061011)、染料木素對照(批號AZ21101501),均購于成都埃法生物科技有限公司;甲醇和冰醋酸為色譜純(默克股份兩合公司,德國);黑豆購買于安徽亳州神農谷藥材商品交易中心,經海軍軍醫(yī)大學藥學系辛海量教授鑒定為豆科植物大豆的成熟種子;淡豆豉為本實驗室發(fā)酵而成。

2 方法

2.1 淡豆豉的制備

根據《中國藥典》中淡豆豉的制作標準[1],按質量比1∶1∶10 稱量青蒿、桑葉和黑豆,用量筒量取青蒿桑葉總質量的8 倍水,將青蒿、桑葉倒入圓底燒瓶中,加入量好的水,冷凝回流煎煮1 h,將煎煮好的中藥用尼龍紗布過濾,藥渣放入托盤中,濾液倒入燒杯中。將處理后的黑豆放入濾液中,浸泡16 h。取出黑豆,放入蒸煮鍋蒸煮1 h。晾約1 h 至黑豆表面基本干燥,之后放入燒杯中,將一定量的半干半濕的青蒿桑葉置于黑豆上層,覆蓋1.5 cm,置于35 ℃、濕度50%的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵,6 天后取出一半,做為半成品淡豆豉樣品。剩余一半清洗稍晾后繼續(xù)放入燒杯中,上層覆蓋干燥的混勻后的青蒿、桑葉,置于35 ℃、濕度50%的恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)發(fā)酵15 天,即為成品淡豆豉樣品。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對照品溶液制備

精密稱取對照品大豆苷10.93 mg、黃豆黃苷10.18 mg、染料木苷10.84 mg、大豆苷元5.09 mg、黃豆黃素5.19 mg 和染料木素8.95 mg,分別加入甲醇超聲溶解,于10 ml 容量瓶內定容,制成濃度 分 別 為1 093 μg/ml、1 018 μg/ml、1 084 μg/ml、509 μg/ml、519 μg/ml 和895 μg/ml 的單一對照品儲備液,再分別精密量取6 種異黃酮對照品儲備液適量,用甲醇稀釋,配制成一系列濃度的混合對照品溶液[9-10]。

2.2.2 供試品溶液制備

將黑豆及自制淡豆豉樣品60 ℃干燥,粉碎,過四號篩。取樣品粉末約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入10 ml 色譜甲醇,混勻,超聲處理2 h,放冷,再次稱重,甲醇補足減失重,搖勻,進樣前用 0.45 μm 濾膜濾過,取續(xù)濾液,得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱:DiamonsilC18(4.6×250 mm,5 μm);流動相為0.2%醋酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脫(0~6 min,20%B;6~7 min,20%~40%B;7~12 min,40%B;12~22 min,40%~60%B;22~27 min,60%B;27~35 min,60%~90%B;35~40 min,90%B;40~41 min,90%~20%B;41~45 min,20%B),流速:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:260 nm;進樣量:10 μl??瞻兹軇?、對照品、黑豆和淡豆豉樣品色譜峰如圖1 所示。大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的保留時間依次為16.72 min、17.56 min、20.63 min、27.40 min、28.03 min 和30.95 min。

圖1 6 種異黃酮HPLC 色譜圖 (260nm 檢測波長)

2.4 標準曲線的制備

分別精密量取“2.1”項下對照品儲備液溶液適量,置同一10ml 容量瓶中,加50%甲醇至刻度,即得大豆苷54.65 μg/ml、黃豆黃苷50.90 μg/ml、染料木苷54.20 μg/ml、大豆苷元50.90 μg/ml、黃豆黃素51.90 μg/ml 和染料木素44.75 μg/ml 混合對照品溶液。取混合對照品溶液加50%甲醇進行逐級稀釋,制成系列濃度的混合對照品溶液,進樣分析。將信噪比大于且接近于10 的對照品溶液濃度作為定量限(LOQ),對于高于定量限的系列濃度的混合對照品溶液,以峰面積(Y)為縱坐標、濃度(X)為橫坐標,進行線性回歸,得到大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的標準曲線,結果見表1。結果顯示 6 種化學成分在相應濃度范圍內呈現良好線性關系。

表1 6 種異黃酮標準曲線試驗結果

2.5 精密度試驗

取濃度分別為低、中、高的對照品溶液,在同一天內連續(xù)重復進樣3 次,以峰面積計算3 次結果的RSD 值。低濃度對照品中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素峰面積結果的RSD 值分別為1.83%、0.39%、1.56%、1.45%、2.89%和0.59%;中濃度對照品中6 種異黃酮成分峰面積結果的RSD 值分別為0.08%、0.05%、0.05%、0.01%、0.41%和0.07%;高濃度對照品中6 種異黃酮成分面積結果的RSD 值分別為0.48%、0.42%、0.38%、0.44%、1.10%和0.59%。結果表明,此方法的日內精密度良好。

取濃度分別為低、中、高的對照品溶液,連續(xù)3 天進樣檢測,以峰面積計算3 次結果的RSD 值。低濃度對照品中6 種異黃酮成分峰面積結果的RSD值分別為0.13%、3.72%、3.52%、2.33%、2.15%和1.18%;中濃度對照品中6 種異黃酮成分峰面積結果的RSD 值分別為2.46%、2.61%、2.58%、2.28%、1.06%和1.81%;高濃度對照品中6 種異黃酮成分面積結果的RSD 值分別為3.44%、3.62%、3.70%、3.37%、3.08%和2.98%。結果表明,此方法的日間精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批自制淡豆豉按上述條件制備 6 份供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣測定,6 種異黃酮大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的平均含量分別為124.2 μg/g、37.11 μg/g、252.5 μg/g、273.4 μg/g、58.65 μg/g、283.3 μg/g,并計算含量的RSD 值分別為1.89%、1.79%、2.50%、2.04%、2.51%、2.67%,結果表明該方法的重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批自制淡豆豉的供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件,在制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 進樣測定。測定6 種異黃酮的峰面積,計算6 種異黃酮峰面積的RSD 值,結果分別為1.93%、2.43%、0.94%、0.88%、1.01%和0.89%,結果表明供試品溶液在室溫下放置8h 的穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取重復性試驗同批次淡豆豉粉末約0.5 g,精密稱定,平行6 份,分別置于具塞錐形瓶中,每份分別精密加入近似等量的 6 種對照品溶液,精密加入色譜甲醇至10 ml,混勻,超聲處理2h,放冷,再次稱重,甲醇補足減失重,搖勻,進樣前用0.45 μm 濾膜濾過,取續(xù)濾液,得加樣回收供試品溶液。按上述色譜條件測定各成分的峰面積,計算各個化合物的回收率和回收率的RSD 值,結果見表2。結果表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗結果

3 結果

用上述建立的方法對發(fā)酵前的黑豆、發(fā)酵中的半成品淡豆豉和發(fā)酵后的成品淡豆豉中6 種異黃酮的含量進行檢測,每個樣品平行測定3 次,計算3 次檢測結果的平均值,并對檢測結果比較。結果見表3。

表3 黑豆、發(fā)酵中和發(fā)酵后的淡豆豉中 6 種異黃酮類成分含量比較

將上述結果用柱形圖表示,如圖2。

圖2 黑豆、淡豆豉半成品和淡豆豉成品中 6 種異黃酮類成分含量比較

4 討論

本實驗建立了一種通過高效液相色譜法對黑豆及發(fā)酵淡豆豉中的6 種異黃酮成分進行含量檢測的分析方法,并對建立的分析方法進行了系統(tǒng)性的方法學驗證。從圖1 中可以看出,該方法能夠檢測出黑豆及淡豆豉中的大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素這6 種異黃酮成分,且空白溶劑對檢測無影響。說明該高效液相色譜分析方法專屬性良好,適用于本實驗發(fā)酵工藝下的淡豆豉中異黃酮的含量測定。經線性、精密度、重復性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗考查,該分析方法檢測6 種異黃酮的含量線性關系良好,較為精密和穩(wěn)定,回收率符合《中國藥典》規(guī)定標準[11-12]。其中,大豆苷、染料木苷和黃豆黃素的回收率偏低,可能是由于這3 種化合物的穩(wěn)定性較差,易分解或轉化,也可能是在濃縮等預處理過程中由于溶解度偏低的原因導致化合物一定程度上的損失。

通過上述分析方法對發(fā)酵前的黑豆和課題組自制的半成品淡豆豉及成品淡豆豉進行含量測定,并對檢測出的含量進行比較。根據圖2 所示,6 種異黃酮在發(fā)酵后淡豆豉中的含量相較于在未發(fā)酵的黑豆中,均有顯著性提升。其中,相較于大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷等結合型糖苷,大豆苷元、黃豆黃素和染料木素等游離型苷元的提升更加明顯。此外,與半成品淡豆豉相比較,成品淡豆豉中的6 種異黃酮的含量均較高,其中大豆苷、黃豆黃苷、大豆苷元這3 種異黃酮的含量增多較為明顯。從整體趨勢來看,在黑豆發(fā)酵成半成品淡豆豉再至成品淡豆豉的過程中,這6 種異黃酮的含量逐漸增多,在黑豆發(fā)酵為淡豆豉后,其中的異黃酮含量顯著升高,但隨著發(fā)酵時間的延長,淡豆豉中異黃酮含量的增速變緩。

大豆異黃酮多以結合型糖苷的形式存在,一般認為結合型的糖苷是無活性的,大量研究表明,異黃酮苷元具有較強的生物活性[13]。所以,上述結果可以表明,黑豆經過發(fā)酵成淡豆豉后,其生物活性有明顯提升。另外,在黑豆發(fā)酵過程中,6 種異黃酮的含量持續(xù)提升,但隨著發(fā)酵時間的推移,異黃酮含量提升趨勢變緩。這種趨勢的原因可能是,在黑豆發(fā)酵過程中,隨著呼吸作用的增強,異黃酮的生物合成的關鍵酶——苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)含量也隨之提高,使得發(fā)酵后的淡豆豉中的異黃酮的含量隨之提高,但隨著發(fā)酵時間的延長,呼吸作用的增強變緩[14]。

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