曹文瓊 黃新梅 高紅梅 朱學新 馬瀟 賈新燕

(蘭州市第一人民醫(yī)院腎病科,甘肅 蘭州 730050)

近年來,慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)的發(fā)病率不斷增加。CKD是一種多因素疾病,糖尿病和高血壓是導致CKD的主要原因,此外,還有一些其他常見原因,包括腎小球腎炎、多囊腎病、腎結石、尿路感染和腎毒素等[1]。CKD的確切機制尚不清楚,最終共同途徑涉及腎小球硬化、血管硬化和腎小管間質纖維化。高尿酸血癥是導致腎功能損害的重要因素,研究[2]表明,高尿酸血癥可通過多種機制加重CKD患者的腎功能損害,包括直接毒性作用、促進炎癥反應、激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、誘導線粒體功能障礙以及氧化應激等。據(jù)統(tǒng)計,我國CKD患者高尿酸血癥的患病率為36.6%～50%[3-4],且隨著CKD的進展呈現(xiàn)不斷增加的趨勢。

NOD樣受體家族核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3) 屬于核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族成員,作為固有免疫系統(tǒng)的模式識別受體,可識別病原體相關分子模式以及損傷相關分子模式?；罨腘LRP3能夠與凋亡相關斑點樣蛋白和pro-Caspase-1相互作用,形成胞質復合物從而產(chǎn)生具有活性的Caspase-1,并觸發(fā)下游促炎介質IL-1β的成熟和釋放,從而參與各種炎癥性疾病[5-6]。已有研究[7]表明,高尿酸血癥腎病患者外周血單核細胞中NLRP3和Caspase-1的mRNA表達水平明顯升高,血漿內(nèi)IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18水平也均升高,因此推測NLRP3/IL-1β信號通路及其相關炎癥因子參與了高尿酸所致CKD的腎功能損害。此外,在缺血/再灌注誘導急性腎損傷后引起的CKD 模型小鼠中檢測到血清、尿液和腎組織中NLRP3表達均升高,并檢測到腎組織內(nèi)NLRP3信號通路相關炎癥因子表達上調,這一現(xiàn)象與腎功能損害程度密切相關[8]。鑒于上述內(nèi)容,為了驗證干預高尿酸血癥CKD中NLRP3/IL-1β信號通路能否對腎功能起到保護作用,本研究通過構建高尿酸血癥CKD大鼠模型并以NLRP3抑制劑MCC950與IL-1β抑制劑GIBH-130進行作用, 觀察該作用下大鼠模型相關指標變化,并初步探討作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 體重為180～220 g的雄性SD大鼠,由甘肅中醫(yī)藥大學提供,健康且無特定病原體,飼養(yǎng)條件設置為溫度23～25℃,相對濕度控制在55%～65%,12 h/12 h交替照明,噪音小于60分貝,環(huán)境經(jīng)嚴格滅菌處理,環(huán)境清潔、通風良好。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2 主要試劑 氧嗪酸鉀購于美國Sigma公司;NLRP3抑制劑MCC950購于美國MedChemExpress公司;IL-1β抑制劑GIBH-130和免疫組織化學染色(DAB顯色)試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司;IL-1β、TNF-α、IL-18 ELISA測定試劑盒購于江蘇凱基生物公司;SOD與MDA檢測試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司;HE染色試劑盒和PAS染色試劑盒購于北京索萊寶生物公司;Epon812、醋酸鈾和檸檬鉛購于美國EMS公司;PVDF膜購于美國Millipore公司;BCA蛋白測定試劑盒、DAB顯色試劑盒和ECL增強化學發(fā)光液購于上海碧云天生物公司;兔抗人Nephrin、Podocin、NLRP3、IL-1β、Caspase-1、GAPDH多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG等抗體均購于英國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 動物造模 參考文獻方法[9]制備高尿酸血癥CKD大鼠模型。將30只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后,切除右腎,按照數(shù)字隨機表法分為模型組、NLRP3抑制劑組、IL-1β抑制劑組,每組10只。術后1周,3組大鼠均開始以800 mg/kg的劑量灌胃氧嗪酸鉀,每日一次,連續(xù)24 d,以構建高尿酸血癥CKD模型。同時,NLRP3抑制劑組大鼠以10 mg/kg 的劑量灌胃NLRP3抑制劑MCC950,1次/日,連續(xù)24 d;IL-1β抑制劑組大鼠以0.25 mg/kg的劑量灌胃IL-1β抑制劑GIBH-130,1次/日,連續(xù)24 d;另取10只健康SD大鼠作為對照組,以等容量蒸餾水灌胃。 實驗期間,所有大鼠均提供普通飼料和蒸餾水以自由飲食飲水。

1.3.2 血清生化指標 測定各組大鼠在最后一次給藥24 h后,通過眶靜脈采血,室溫靜置2 h后,以3500 rpm/min 離心10 min,收集上清。通過全自動生化分析儀測定血清中SUA、BUN和Scr水平,具體根據(jù)檢測試劑盒說明書進行測定。

1.3.3 腎組織炎癥因子水平檢測 各組大鼠取血后處死,在無菌環(huán)境下解剖取左腎組織,剪取約0.5 g腎組織,加入預冷的PBS緩沖液,研磨制成勻漿,以4000 rpm/min離心10 min,收集上清液,BCA法測定蛋白濃度,采用ELISA法檢測上清液中IL-1β、TNF-α及IL-18水平,按照試劑盒說明書進行操作,制作標準曲線并計算各因子含量。

1.3.4 HE染色 將解剖的各組大鼠左腎組織固定在10%中性福爾馬林液中,24 h后經(jīng)梯度酒精脫水,常規(guī)石蠟包埋,切片機上連續(xù)切成厚度為4 μm的組織薄片。將切片脫蠟至水,置入蘇木精染色5 min,流水沖洗后,再于伊紅染色液中染色3 min,流水再次沖洗,脫水后晾干,透明,中性樹膠封片,通過光學顯微鏡觀察腎組織形態(tài)變化,攝取圖像。

1.3.5 PAS染色 各組大鼠腎組織切片經(jīng)脫蠟至水后,置入阿利新藍溶液中染色10 min,流水沖洗,利用過碘酸溶液氧化5 min,再浸入SchiffReagent試劑液中染色10 min,流水沖洗,蘇木素染色液復染,酸性乙醇分化,氨水返藍,流水沖洗干凈,脫水與透明,中性樹膠封片,通過光學顯微鏡觀察腎組織染色情況,攝取圖像。

1.3.6 透射電子顯微鏡 觀察各組大鼠腎組織在2.5%戊二醛中固定,切片機上將組織切成大小約為1 mm3的組織塊。固定好后,丙酮脫水,Epon812浸透,純包埋液完全包埋,通過超薄切片機切成厚度約為1 μm的組織薄片,經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鋁染色后,通過透射電鏡觀察足細胞超微結構變化,攝取圖像。

1.3.7 免疫組織化學染色 將固定好的腎組織進行常規(guī)石蠟包埋,切片機切成4 μm 的石蠟組織切片。切片進行脫蠟處理,滴加檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復,用3%H2O2室溫處理30 min。滴入山羊血清室溫封閉30 min,然后滴加稀釋的兔抗人Nephrin多克隆抗體(1∶100)和兔抗人Podocin多克隆抗體(1∶100),置于4℃孵育過夜;次日,PBS 沖洗,滴加對應稀釋的二抗(1∶1000),37℃孵育30 min。PBS沖洗,利用DAB顯色,流水沖洗,在蘇木精溶液中復染,經(jīng)脫水與透明后,晾干,中性樹膠封片,通過光學顯微鏡觀察組織內(nèi)著色情況,攝取圖像,胞質、胞核染為棕色至棕褐色為陽性,隨機選擇5個視野,通過ImageJ軟件進行分析,分別計算Nephrin和Podocin陽性表達率。

1.3.8 Western blot法 將各組大鼠腎組織在無菌環(huán)境下剪碎,加入預冷蛋白裂解液裂解,收集上清,BCA法定量檢測蛋白濃度。取等量各組蛋白樣品分別與5×Loading buffer混合,制備10% SDS-PAGE凝膠,將蛋白上樣至凝膠孔內(nèi),恒壓電泳分離蛋白質,并電轉移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,將稀釋的兔抗人NLRP3、IL-1β、Caspase-1多克隆抗體(1∶1000)作為一抗,與膜共置于4℃下孵育過夜;次日,TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)作為熱炕,與膜室溫孵育1 h,TBST再次洗膜,ECL試劑液顯影,X射線膠片曝光后定影,Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值,內(nèi)參蛋白為GAPDH,以目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為NLRP3、IL-1β以及Caspase-1的蛋白相對表達水平。

1.3.9 氧化應激指標測定 取各組大鼠左腎組織,無菌環(huán)境下剪碎并加入裂解液,利用勻漿機制備勻漿液,以4000 rpm/min離心20 min,收集上清液,檢測SOD活性與MDA含量,步驟參照各試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組大鼠血清腎功能指標 通過檢測各組大鼠血清SUA、BUN和Scr來評價腎功能,與對照組比較,模型組大鼠血清SUA、BUN和Scr水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠血清SUA、BUN以及Scr水平均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清SUA、BUN和Scr水平比較Table 1 Comparison of serum SUA, BUN and Scr levels of rats in each group

2.2 各組大鼠炎癥因子水平比較 ELISA檢測各組大鼠腎組織炎癥因子含量的結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-18含量均顯著升高(P<0.05);而NLRP3抑制劑組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-18含量均顯著低于模型組(P<0.05);IL-1β抑制劑組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-18含量也均顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-18含量比較Table 2 Comparison of IL-1β, TNF-α and IL-18 contents in kidney tissue of rats in each group

2.3 各組大鼠腎組織病變觀察 經(jīng)過HE染色和PAS染色觀察到,對照組大鼠腎組織形態(tài)清晰,腎小球、腎小管及腎間質均未見明顯病理改變;模型組大鼠腎組織結構異常,可見腎小管上皮細胞明顯壞死、萎縮,腎小球系膜增生,系膜細胞減少,并有較多炎性細胞浸潤等損傷現(xiàn)象;而相較于模型組,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠腎組織病理損傷均減輕,形態(tài)結構有所恢復。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學形態(tài)觀察(上HE,100×;下PAS,100×)Figure 1 Histopathological observation of rat kidney in each group

同時,透射電鏡下可見對照組大鼠腎小球足細胞結構清晰,絕大多數(shù)足突排列整齊,貼附于腎小球基底膜外側;模型組大鼠腎小球足細胞足突增粗,出現(xiàn)融合或消失的現(xiàn)象,且腎小球基底膜增厚;相較于模型組,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠足細胞足突融合或消失現(xiàn)象得到改善,腎小球基底膜也未見明顯增厚。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織足細胞超微結構變化(透射電鏡,20000×)Figure 2 Ultrastructural changes of podocytes in renal tissue of rats in each group 注:紅色箭頭為足突,黃色為基底膜。

2.4 各組大鼠腎組織Nephrin與Podocin表達比較 免疫組織化學染色檢測結果顯示,對照組大鼠腎組織內(nèi)可見明顯陽性染色,模型組大鼠腎組織中陽性染色較對照組變淺,Nephrin陽性率與Podocin陽性率均顯著減少(P<0.05);與模型組比較,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠腎組織中陽性染色均加深,Nephrin陽性率與Podocin陽性率也均顯示為顯著增加(P<0.05)。見圖3。

2.5 各組大鼠腎組織NLRP3/IL-1β信號通路蛋白水平比較 Western blot檢測結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠腎組織內(nèi)NLRP3、IL-1β及Caspase-1蛋白相對表達量均顯著上調(P<0.05);與模型組比較,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠腎組織內(nèi)NLRP3、IL-1β、Caspase-1蛋白相對表達量均顯著下調(P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測各組大鼠腎組織NLRP3/IL-1β信號通路蛋白表達Figure 4 Western blot detection of NLRP3/IL-1β signaling pathway protein expression in kidney tissue of rats in each group注:1.對照組;2.模型組;3.NLRP3抑制劑組;4.IL-1β抑制劑組。與對照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05。

2.6 各組大鼠腎組織氧化應激指標比較 經(jīng)過檢測各組大鼠腎組織SOD活性和MDA含量發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腎組織SOD活性顯著低于對照組,而MDA含量顯著高于對照組(P<0.05);與模型組相比,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組腎組織SOD活性均顯著升高,MDA含量均顯著減少(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠腎組織SOD和MDA水平檢測Figure 5 Detection of SOD and MDA levels in kidney tissue of rats in each group注:與對照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05。

3 討論

高尿酸血癥是高血壓、痛風性關節(jié)炎、代謝綜合征以及CKD發(fā)生的關鍵危險因素。肝臟尿酸生成過多和腎臟排泄不足均可能導致高尿酸血癥,尿酸是嘌呤分解代謝的最終氧化產(chǎn)物,在人體中其濃度的改變通常與腎臟中尿酸結晶的形成有關,從而導致尿酸結石,引起強烈的炎癥反應并引起腎臟損傷[10]。目前,隨著人類生活條件和生活方式的改善,高尿酸血癥腎病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增加。針對高尿酸血癥CKD的治療策略主要集中在使用黃嘌呤氧化還原酶抑制劑減少體內(nèi)尿酸的產(chǎn)生或者利用促尿酸排泄劑促進尿液中尿酸的排泄。然而,這兩種治療劑均由于引起的不良副作用而使得臨床使用受限,例如,別嘌呤醇是常用的黃嘌呤氧化還原酶抑制劑,可損害嘧啶代謝導致部分使用者出現(xiàn)嚴重的超敏反應和粒細胞缺乏癥,并進一步加重了腎毒性和腎損傷[11]。因此,迫切需要尋找有效且毒性小的藥物來治療高尿酸血癥CKD。

NLRP3炎癥小體由模式識別受體蛋白NLRP3、包含CARD的凋亡相關斑點樣蛋白和效應蛋白前Caspase-1組成。作為NLR炎性通路中的重要組成部分,可被細菌、病毒等多種病原體危險信號刺激后活化,被激活的NLRP3能夠募集凋亡相關斑點樣蛋白與前體Caspase-1形成炎癥小體復合物,并通過自我切割產(chǎn)生具有活性的Caspase-1;Caspase-1作為IL-1β轉化酶,經(jīng)自身催化激活后,可將無活性的促炎因子IL-1β和前體IL-18的前體剪切加工為成熟的IL-1β和IL-18并釋放出來,進一步增加局部炎性相關基因表達,從而誘導炎癥反應和組織損傷[6],此外,Caspase-1還能夠啟動細胞死亡程序[12]。研究[13-14]表明,NLRP3/IL-1β信號通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,包括自身免疫性疾病、感染和非感染性疾病。同樣,該通路參與腎臟疾病的炎癥反應,可引起病理性病變和腎臟損傷,在腎臟疾病進程中起著重要作用。例如,Zhao等[15]研究表明NLRP3炎癥小體的激活可通過誘導線粒體功能障礙來調節(jié)Ang II誘導的足細胞損傷,抑制或阻斷NLRP3可明顯減輕線粒體功能障礙引起的腎損傷;Krishnan等[16]研究發(fā)現(xiàn)在高血壓小鼠模型中,使用NLRP3抑制劑MCC950可以顯著降低血壓和腎組織纖維化,抑制腎臟中IL-18和IL-1β的表達,并減輕了腎功能障礙。同樣,本研究表明,經(jīng)NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑GIBH-130作用的高尿酸血癥CKD大鼠腎組織內(nèi)IL-1β、TNF-α和IL-18含量均下降,這提示腎組織炎癥反應減輕。高尿酸血癥加重腎臟負擔,造成腎臟損害,引起腎臟損害相關指標如Scr 和BUN升高,經(jīng)NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑GIBH-130作用也明顯降低了血清SU A、BUN和Scr水平,因而改善了腎功能。此外,組織病理學觀察結果還表明,NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑GIBH-130治療均明顯減輕了高尿酸血癥CKD大鼠的腎損傷,提高了Nephrin和Podocin的表達水平。Nephrin是由足細胞表達的位于裂孔隔膜上的跨膜蛋白,能夠與Podocin結合形成復合體以維持裂孔隔膜的結構完整,這兩種特異性蛋白是腎小球基底膜的關鍵成分[17]。以上這些結果均表明,利用抑制劑靶向抑制NLRP3/IL-1β信號通路可顯著改善高尿酸血癥CKD大鼠腎功能。

氧化應激是在各種因素刺激下機體活性氧或自由基相對超負荷,引起細胞內(nèi)多種生物大分子發(fā)生損傷,從而對生命活動產(chǎn)生影響的應激反應。腎臟組織是一個高度代謝的器官,線粒體中富含氧化反應,這使得其容易受到氧化應激造成的損害[18]。氧化應激可以加速腎臟疾病的進展,此外,在CKD晚期患者中,氧化應激增加與高血壓、動脈粥樣硬化、炎癥和貧血等并發(fā)癥有關[19]。有研究[20]表明,線粒體能夠通過釋放活性氧促進DNA釋放到胞質溶液中,激活NLRP3炎癥小體并引起腎臟疾病,可見氧化應激在腎臟疾病的發(fā)生中起著重要作用,而通過抑制氧化應激來調節(jié)NLRP3途徑活化,可達到改善腎功能的作用[21]。本研究顯示,高尿酸血癥CKD大鼠腎組織SOD活性下降而MDA含量升高,表明組織內(nèi)發(fā)生了氧化應激反應;在NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑GIBH-130作用下,大鼠腎組織SOD活性升高,同時MDA含量下降,這提示組織內(nèi)氧化應激受到抑制。

4 結論

NLRP3/IL-1β信號通路與高尿酸血癥CKD發(fā)生發(fā)展有關,通過抑制該途徑可阻止腎組織炎癥因子釋放,減輕腎組織損傷,并抑制氧化應激反應,從而起到對腎功能的保護作用。由此推測,NLRP3/IL-1β信號通路可作為高尿酸血癥CKD治療的潛在靶點。