張素冰 高輝 趙濱濱 張丹琦

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉手術(shù)科,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉手術(shù)科,黑龍江 哈爾濱 150000)

缺血性腦卒中是常見(jiàn)的腦血管疾病,具有較高的致殘率和致死率[1]。腦缺血誘導(dǎo)大腦神經(jīng)元損傷,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元活性降低及凋亡增加[2]。因此,抑制腦缺血引起的大腦神經(jīng)元損傷可減緩及治療腦損傷。普魯卡因(Procaine,PROC)是臨床常用的局部麻醉劑,近年來(lái)研究顯示PROC可能在腫瘤[3]、心肌損傷[4-5]等疾病中發(fā)揮鎮(zhèn)痛外效用。同時(shí),PROC還具有鈉通道阻滯作用,可抑制細(xì)胞膜缺血去極化,從而保護(hù)腦缺血[6],然而其具體保護(hù)機(jī)制還未知。微小RNA(miRNA)是小分子非編碼RNA,研究[7]顯示,miR-138在氧糖剝奪(Oxgen-glucose deprivation,OGD)誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-138可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷,其表達(dá)異?？赡軈⑴c缺血性腦卒中發(fā)病。鑒于此,本研究將從miR-138角度,探究普魯卡因?qū)GD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;PROC購(gòu)自常州市卓燊醫(yī)藥化工材料有限公司;DMEM培養(yǎng)液、Annexin V-FITC/PI試劑盒、LipofectamineTM 2000試劑盒和CCK-8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司;乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase,LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成公司;胎牛血清購(gòu)自浙江天杭公司;活化的半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)、cleaved-caspase9抗體、pro-caspase3抗體、pro-caspase 9抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司;引物序列、miR-138模擬物(mimics)及抑制劑(anti-miR-138)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)由上海生工生物工程公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)[8]方法建立OGD模型:以無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,置于5% CO2、95% N2、37 ℃條件下培養(yǎng)90 min;加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將細(xì)胞以1.0×105個(gè)/孔接種至96孔板,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,分別用含0.00、3.50、7.00、14.00 mg/L[3]PROC的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,建立OGD模型,作為OGD組、OGD+PROC-L組、OGD+PROC-M組和OGD+PROC-H組,同時(shí)設(shè)置對(duì)照(Con)組,常規(guī)培養(yǎng),用于觀察PROC對(duì)OGD細(xì)胞模型的影響;將細(xì)胞以1.0×106個(gè)/孔接種至6孔板中,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,利用LipofectamineTM 2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染miR-138 mimics、miR-NC、anti-miR-138、anti-miR-NC,轉(zhuǎn)染12 h,并采用qRT-PCR法檢測(cè)miR-138表達(dá),驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,再建立OGD模型,其中轉(zhuǎn)染anti-miR-138、anti-miR-NC的細(xì)胞用含有14.00 mg/LPROC的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,分別作為OGD+miR-138組、OGD+miR-NC組、OGD+PROC+anti-miR-138組、OGD+PROC+anti-miR-NC組,用于探究PROC對(duì)OGD細(xì)胞模型的潛在機(jī)制。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)神經(jīng)元存活率 各組培養(yǎng)結(jié)束,添加10 μL/孔CCK-8試劑,繼續(xù)孵育2 h,再置于酶標(biāo)儀中,設(shè)置波長(zhǎng)450 nm,測(cè)定各孔吸光度(Absorbance,A)值,計(jì)算存活率(%)=A值實(shí)驗(yàn)組/A值對(duì)照組×100%。

1.2.3 LDH漏出率檢測(cè) 收集各組處理后培養(yǎng)上清液,4500 r/min離心10 min,離心半徑為10 cm,取上清液,嚴(yán)格按照LDH試劑盒說(shuō)明書,檢測(cè)LDH含量,計(jì)算各組LDH釋放率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組處理后細(xì)胞,利用Annexin V-FITC/PI試劑盒,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白 收集各組處理后細(xì)胞,用RIPA試劑提取總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度,用SDS-PAGE分離總蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5 %脫脂牛奶封閉2 h,于4 ℃用cleaved-caspase3(1∶500)、cleaved-caspase9(1∶500)、pro-caspase3(1∶500)、pro-caspase 9(1∶500)和GAPDH(1∶1000)一抗孵育過(guò)夜,室溫用山羊抗兔二抗孵育1 h,加顯影液顯影,曝光拍照,Image軟件分析條帶灰度值,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值表示。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-138表達(dá) 收集各組處理后細(xì)胞,按照1.2.1分組處理后收集細(xì)胞,用miRNA提取試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列:miR-138上游5′-GGTGTC CGTGGAGTCGGCAA-3′,下游5′-AACTTCACAA CACCAGCTTA-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCA GCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3′。2-△△Ct法計(jì)算miR-138相對(duì)U6的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元存活率和LDH釋放的影響 OGD組存活率低于對(duì)照組(P<0.05),LDH釋放率高于對(duì)照組(P<0.05)。OGD+PROC-L組、OGD+PROC-M組和OGD+PROC-H組存活率均高于OGD組(P<0.05),LDH釋放率均低于OGD組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元存活率和LDH釋放的影響Table 1 Effects of PROC on the survival rate and LDH release of OGD-induced rat cortical neurons

2.2 PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響 OGD組凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組,pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)。OGD+PROC-L組、OGD+PROC-M組和OGD+PROC-H組凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達(dá)均低于OGD組,pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表達(dá)均高于OGD組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響Figure 1 Effects of PROC on OGD-induced apoptosis of cortical neurons in rats注:A.凋亡相關(guān)蛋白表達(dá); B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

表2 PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響Table 2 Effects of PROC on OGD-induced apoptosis of cortical neurons in rats

2.3 PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元中miR-138表達(dá)的影響 對(duì)照組、OGD組、OGD+PROC-L組、OGD+PROC-M組和OGD+PROC-H組miR-138表達(dá)量分別為(1.00±0.00)、(0.28±0.03)、(0.43±0.04)、(0.69±0.05)和(0.86±0.06)。OGD組miR-138表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。OGD+PROC-L組、OGD+PROC-M組和OGD+PROC-H組miR-138表達(dá)均高于OGD組(P<0.05)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-138對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的影響 OGD+miR-138組miR-138表達(dá)量高于OGD+miR-NC組[(2.94±0.27)vs(1.00±0.00)](P<0.05)。OGD+miR-138組存活率高于OGD+miR-NC組(P<0.05),LDH釋放率、凋亡率及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達(dá)均低于OGD+miR-NC組,pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表達(dá)均高于OGD+miR-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-138對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響Figure 2 Effect of overexpression of miR-138 on OGD-induced apoptosis of rat cortical neurons注:A.凋亡相關(guān)蛋白表達(dá); B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

表3 過(guò)表達(dá)miR-138對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的影響Table 3 Effects of overexpression of miR-138 on OGD-induced rat cortical neurons damage

2.5 敲減miR-138逆轉(zhuǎn)PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的作用 OGD+PROC+anti-miR-138組miR-138表達(dá)量低于OGD+PROC+anti-miR-NC組[(0.33±0.03)vs(1.00±0.00)](P<0.05)。OGD+PROC+anti-miR-138組存活率低于OGD+PROC+anti-miR-NC組(P<0.05),LDH釋放率、凋亡率及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達(dá)均高于OGD+PROC+anti-miR-NC組,pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表達(dá)均低于OGD+PROC+anti-miR-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 敲減miR-138逆轉(zhuǎn)PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的作用Figure 3 Knocking down miR-138 reverses the effect of PROC on OGD-induced cortical neuron apoptosis in rats注:A.凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);B.細(xì)胞凋亡流式圖。

表4 敲減miR-138逆轉(zhuǎn)PROC對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的作用Table 4 Knocking down miR-138 reverses the effect of PROC on OGD-induced cortical neuron injury in rats

3 討論

缺血性腦卒中是常見(jiàn)的腦血管疾病,缺血狀態(tài)下,神經(jīng)元活性降低,凋亡增加,導(dǎo)致神經(jīng)功能受損[9-10]。OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型是常見(jiàn)的缺血神經(jīng)損傷體外模型[11]。LDH是廣泛分布于機(jī)體組織中的胞內(nèi)酶,細(xì)胞受損時(shí)被大量釋放[12-13]。本實(shí)驗(yàn)顯示,大鼠皮層神經(jīng)元經(jīng)OGD誘導(dǎo)后,神經(jīng)元存活率降低,凋亡率和LDH釋放量明顯增加,說(shuō)明OGD模型建立成功。同時(shí),PROC可提高OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元存活率,降低凋亡率、LDH漏出率,說(shuō)明其對(duì)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞凋亡,其中caspase9是該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始因子,其在活化后生成cleaved-caspase9,傳遞凋亡信號(hào);caspase3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的核心分子,其被活化后生成cleaved-caspase3,進(jìn)而剪切細(xì)胞內(nèi)各種底物,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究表明,PROC可降低OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元中cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白的表達(dá),增加pro-caspase3、pro-caspase 9蛋白表達(dá),這提示PROC可能通過(guò)抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),阻礙OGD誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡。

miR-138可參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥及免疫等多種生理病理過(guò)程,其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[16-18]。miR-138在缺血性腦卒中內(nèi)表達(dá)降低,上調(diào)miR-138可減輕OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷[19-20]。表明miR-138有望成為缺血性腦卒潛在標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)顯示,miR-138在OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元中表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)miR-138后,OGD組細(xì)胞增殖活性增加,LDH釋放量和細(xì)胞凋亡減少,這與李敏等[7]報(bào)道結(jié)果一致,提示miR-138可保護(hù)大鼠皮層神經(jīng)元免受OGD損傷。本研究還顯示,普魯卡因可促進(jìn)OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元中miR-138表達(dá),而恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示,敲減miR-138可部分逆轉(zhuǎn)普魯卡因?qū)GD誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的作用,這提示普魯卡因在OGD誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷中的保護(hù)作用,可能通過(guò)上調(diào)miR-138實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié)論

普魯卡因可抑制OGD誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷,其作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-138有關(guān),但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究,未來(lái)將從miR-138靶基因及下游信號(hào)通路深入分析。