陳鵬宇 黃荷 朱興旺 李汛,2,3

(1.蘭州大學第一臨床醫(yī)學院,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學第一醫(yī)院普外科,甘肅 蘭州 730000;3.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學重點實驗室,甘肅 蘭州 730000)

肝癌具有高發(fā)病率,其在男性和女性中分別占癌癥總發(fā)病率的6.3%和3.0%。在致死率方面, 分別占總死亡率的10.5%和5.7%。在一些亞洲國家,如蒙古國、泰國和柬埔寨,肝癌是最常診斷的癌癥,也是癌癥死亡的主要原因[1]。HBV和HCV感染、黃曲霉素污染的食物、吸煙、高酒精攝入、肥胖及糖尿病是肝癌的高風險因素[2]。 健康的飲食可以減少癌癥風險[3]。目前的流行病學證據(jù)支持飲食在肝癌發(fā)展中的重要作用,研究發(fā)現(xiàn)攝入咖啡[4]、魚[5]和綠茶[6]可能會降低肝癌風險。隨著大規(guī)模全基因組關聯(lián)分析究(Genome-wide Association Study, GWASs)的不斷增加,MR方法作為一種有效的流行病學工具,已被用于對不同表型進行因果推斷[7]。通過使用遺傳變異作為工具變量,MR可以克服傳統(tǒng)觀察性研究中反向因果關系的干擾并且最大限度地減少混雜因素[8]。Deng[9]探討不同飲食習慣和肝癌的潛在因果關系,他們認為飲酒與肝癌風險增加呈正相關。相反,飲用咖啡與肝癌發(fā)生呈反比。Yun[10]評估肉類攝入與消化道癌癥的因果效應,結果表明加工肉類攝入與結腸直腸癌的風險增加有關,不能得到紅肉和白肉的攝入與消化道癌癥風險增加有關。

隨著現(xiàn)代飲食的改變,健康負擔逐漸由感染性疾病轉移到代謝性疾病以及腫瘤發(fā)病, 研究[11]已證明代謝性疾病,如糖尿病,非酒精性脂肪肝等在肝癌的發(fā)病方面具有顯著的促進作用,但是并沒有明確現(xiàn)代飲食對于肝癌發(fā)病的影響。因此,本研究使用基因代理的不同飲食習慣,用雙樣本的MR方法探討不同飲食習慣和日本人群肝癌發(fā)生的因果關系。

1 資料與方法

1.1 研究設計 本研究利用公開可獲取的GWASs來進行感興趣的暴露(飲食習慣)和結局(肝癌)之間的因果關系推斷。研究的所有人群主要限制于日本人群。以IVW法作為主要的方法,同時用多個敏感性檢測方法來確保結果的可靠性。

1.2 數(shù)據(jù)來源 從UK Biobank獲取了不同飲食習慣的GWASs數(shù)據(jù)(茶攝入、熟食蔬菜攝入、豬肉攝入、干果攝入、谷物攝入、加工肉攝入、家禽攝入、面包攝入、使用的牛奶種類、羊肉/牛羊肉攝入、水攝入、飲酒者狀況、魚油攝入)。食物攝入量是由參與者的每日攝入量決定的。所有參與者完成了食物頻率調查表,來了解過去一年的食物攝入量。參與者必須對每種食物的攝入選擇“從不”到“每天一次或更多”,不規(guī)則飲食習慣的參與者被排除。 編碼內容包括以下:每周少于一次,每周一次,每周2～4次,每周5～6次,每天一次或以上,不知道以及不愿意回答。家庭調查表記錄了關于食物攝入頻率的詳細數(shù)據(jù)(https://biobank.ndph.ox.ac.uk/ukb/label.cgi?id=100052)。肝癌的GWASs數(shù)據(jù)從日本生物銀行(Biobank Japan)獲取,總共包含了1866個肝癌病人和195745個對照組的數(shù)據(jù) 。

1.3 工具變量提取 為了獲取與不同飲食習慣顯著相關的(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點,設置了P<5e-6的閾值,通常來說,工具變量的篩選的條件為P<5e-8。但本研究為了納入更多的工具變量,設置了一個寬松的閾值,這個閾值在以往的研究中也經(jīng)常被使用到[12]。 為了減弱不同SNP位點的連鎖不平衡,設置了r2<0.001,窗口大小kb=10000的篩選條件。為了避免弱工具變量偏倚,本研究計算了每個SNP的F值(F=β2/se2),F值大于10被認為是一個強的工具變量[13]。

1.4 統(tǒng)計學分析 本研究使用IVW、MR-Egger、加權中位數(shù),加權眾數(shù)法和簡單眾數(shù)法的方法進行因果推斷[14]。IVW對單個SNP的Wald比值進行薈萃分析,并假定遺傳變異只能通過感興趣的暴露而不是通過其他途徑影響結果[15]。MR-Egger和加權中位數(shù)可以補充IVW[16]。簡單眾數(shù)法對SNP位點進行聚類。加權模式通過引入權重,對聚類的貢獻度進行加權[17]。在敏感性分析中,Cochran's Q統(tǒng)計來檢測異質性,采用MR-Egger回歸、MR-Pleiotropy殘差和離群點方法來檢測多效性。MR-Egger回歸方法中的截距被認為是存在多效性的標志,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。MR-Pleiotropy Residual Sum and Outlier methods (MR-PRESSO)方法可以檢測離群SNP位點的存在。采用留一法來檢測因果推斷是否會被某一特定SNP位點影響。R2來評估SNP位點所解釋的變異程度(R2=2×(1-MAF)×MAF×β2)。采用F統(tǒng)計量來計算工具變量的強弱程度(β是SNP的系數(shù),MAF是小等位基因頻率,se是系數(shù)的標準誤差)。對每個納入研究的SNP位點,在Pheo Scanner網(wǎng)站排除和混雜因素相關的SNP位點[18]。本研究進行的所有的MR分析都是在R(version 4.2.1)中進行的并用“TwoSampleMR” 包(version 0.5.6)[7]和“MRPRESSO” 包(version 1.0)[19]進行分析。

2 結果

2.1 工具變量 本研究用SNP位點代理的暴露揭示不同飲食習慣和日本人群肝癌發(fā)生的因果關聯(lián)。通過篩選,研究得到了和不同飲食習慣顯著相關且彼此獨立的SNP位點,在結局中提取SNP位點信息并且協(xié)同了SNP位點在暴露和結局中的信息。移除了回文序列、不兼容的SNP位點、離群的SNP位點以及和混雜因素有關的SNP位點。HBV和HCV感染、黃曲霉素污染的食物、吸煙、高酒精攝入、肥胖和糖尿病是肝癌的高危因素,因此,在PheoScanner網(wǎng)站查詢,如果納入研究的SNP位點和這些高危因素有關則剔除。 對于剩余的SNP位點,計算每個SNP位點的F值。結果表明,本研究中納入的SNP位點都是強工具變量。部分SNP位點基本信息,見表1。

表1 與不同飲食攝入有關的SNP位點信息Table 1 Information on SNP loci associated with different dietary intake

2.2 兩樣本MR分析 本研究用五種方法來揭露不同飲食習慣和日本人群肝癌發(fā)生的因果關系。作為主要的因果推斷方法,IVW方法得到了面包的攝入會增加肝癌患病的風險(IVW:面包攝入OR:1.32,95%CI:1.09-1.60,P=0.004),用加權中位數(shù)的方法也得到了相同的結論(加權中位數(shù):面包攝入OR:1.40,95%CI:1.09-1.80,P=0.01),但是用其他3種方法并沒有得出相同的結論。用IVW方法沒有得到其他不同飲食習慣和肝癌具有因果關聯(lián),其他方法也得到了相同的結論,見表2。

表2 不同飲食攝入與日本人群肝癌的MR結果Table 2 MR estimations of different dietary intakes on liver cancer in Japan population

在面包攝入和肝癌因果推斷的MR分析中,異質性和多效性不存在(P>0.05)(見表2)。留一法的結果表明,面包攝入和日本人群肝癌發(fā)生的因果推斷具有穩(wěn)健性(見圖1 A)。散點圖表明了用不同的因果推斷方法揭露了代表面包攝入的飲食習慣的SNP位點對日本人群肝癌發(fā)生的影響趨勢(見圖1B)。 森林圖表示了單個的SNP位點在面包攝入與肝癌風險因果推斷中的效力,見圖1C。

圖1 面包攝入與肝癌低風險因果推斷的留一法敏感性分析、數(shù)點圖、森林圖Figure 1 Leave-one-out sensitivity analysis, dot plots, and forest plots for causal inference of the association between bread infake and low risk of liver cancer注:A.面包攝入與肝癌風險因果推斷的留一法敏感性分析;B.面包攝入與肝癌風險因果推斷的散點圖;C.面包攝入與肝癌風險因果推斷的森林圖。

3 討論

隨著生活方式和飲食習慣的改變, 肝癌的發(fā)病率也在逐年提高。由于肥胖、 飲酒和糖尿病作為肝癌的高危因素,飲食在肝癌的發(fā)生中可能起到一定的作用。本研究使用兩樣本孟德爾的方法來揭露不同飲食習慣和日本人群中肝癌發(fā)生的因果關系。研究發(fā)現(xiàn),增加面包的攝入可能增加日本人群罹患肝癌的風險。

本研究表明,面包攝入與肝癌風險增加呈正相關。Hosseini[20]利用標準化的問卷采訪了242例肺癌患者和484例對照組,他們認為面包攝入是伊朗人群中罹患肺癌的一個危險因素。本研究中2/3的參與者攝入的面包種類為全谷物面包,而研究也分析了谷物攝入和肝癌風險增加的因果關聯(lián),可研究并沒有得到谷物攝入和肝癌風險增加的因果關系。因此,面包攝入會增加肝癌的風險而谷物攝入和肝癌風險增加無關的原因可能為:①面包通常缺乏麩皮。由于大部分抗氧化劑都存在于谷類食品的麩皮中,因此去除麩皮可能會消除這些食品對癌癥的預防作用。有研究[21]表明,精制谷物與上呼吸道癌癥的風險直接相關,而全谷物谷類被發(fā)現(xiàn)具有保護作用。用麩皮中的阿魏酸處理的HepG2細胞,處于S期的細胞百分比顯著增加,細胞凋亡和自噬的生物標志物也顯著增加[22]。②面包中含有大量的糖類。研究[23]發(fā)現(xiàn),在HBV陽性組中,血葡萄 糖水平處于第四個四分位數(shù)的受試者的原發(fā)性肝癌的風險增加。胰島素抵抗是糖尿病患者中高血糖的一個主要原因。與糖尿病相關的胰島素抵抗可能會上調胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factors -1, IGF-1)的產(chǎn)生,它刺激細胞增殖和抑制肝臟內的細胞凋亡[24]。此外,胰島素抵抗導致促炎癥細胞因子的水平升高,例如腫瘤壞死因子和白細胞介素-6,這有利于肝臟脂肪變性和炎癥的發(fā)展以及隨后肝癌的產(chǎn)生[25]。③這種作用可能由非酒精性脂肪肝介導的。研究表明,長期食用精制谷物與非酒精性脂肪肝風險的增加顯著相關(OR:3.36;95%CI;1.44-7.87),而后者又是肝癌發(fā)生的一個常見危險因素[26]。非酒精性脂肪肝中致癌機制的非常復雜,如慢性炎癥和高胰島素血癥,可導致較高的肝癌風險,特別是在有基礎的糖尿病患者中。

兩項隊列研究發(fā)現(xiàn)較高的乳制品總攝入量(每天三份或更多)和更高的肝癌發(fā)生風險有關,而多飲用酸奶則與較低的風險有關,并且這些關聯(lián)在沒有HBV和HCV感染的患者中仍然存在[27]。乳制品和肝癌風險關聯(lián)的潛在生物機制可能在于循環(huán)中的IGF-1。攝入大量乳制品可能增加血漿IGF-1的水平[28]。研究[29]證 實,IGF-1可能導致肝癌的發(fā)生。以蔬菜為基礎的飲食習慣與較低的肝癌風險有關[30],研究表明總纖維和植物纖維(特別是谷類纖維)與較低的肝癌風險有關,而水果纖維似乎與肝癌風險無關[31]。與水果纖維相比,谷物纖維已經(jīng)被一致認為與癌癥的發(fā)生有較低的關聯(lián)[32]。一個可能的原因是水果汁含有糖或添加糖(果糖和蔗糖),這可能導致肝臟損傷和非酒精性脂肪肝從而掩蓋了纖維攝入的好處。魚的攝入已被證明可以降低癌癥風險[5],這可能是由于魚存在的長鏈n-3多不飽和脂肪酸。大量的實驗研究表明,n-3 多不飽和脂肪酸具有抗炎活性,可以抑制IL-1和TNF的合成[33],這有助于預防肝癌的發(fā)生。此外,包括魚和家禽在內的白肉是豐富的支鏈氨基酸來源。支鏈氨基酸能加速胰島素誘導的血管內皮生長因子mRNA的降解,在肝癌的發(fā)展過程中下調血管內皮生長因子的表達[34]。支鏈氨基酸還可以通過雷帕霉素靶蛋白復合體依賴的途徑抑制胰島素誘導的PI3K/Akt途徑來誘導肝癌細胞的凋亡[35]。研究[36]表明,綠茶與肝癌風險之間有顯著的反向關系(RR:0.79,95%CI:0.68～0.93)。然而,一項病例對照研究[37]顯示,尿液中較高的兒茶素水平可能不會降低而會增加肝癌的發(fā)病風險。 在本研究中,我們并沒有得到乳制品、熟食蔬菜、魚油和綠茶與肝癌發(fā)生的因果關系。

研究表明,肉類攝入與癌癥風險有關。 一項meta分析[38]表明,食用紅肉與肝癌的風險無關(RR: 1.04;95%CI:0.91～1.18;P: 0.033)。然而,較高的加工肉的膳食攝入可能會增加肝癌的風險(RR:1.20;95%CI: 1.02～1.41;P:0.228)。相反,白肉的攝入與肝癌的風險呈反比關系(RR:0.76;95%CI:0.63～0.92;P:0.001)。加工肉制品增加肝癌風險的潛在機制尚不明確,可能是由以下途徑介導的:①多項研究證實致癌物質,如多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)、雜環(huán)胺(Heterocyclic amines, HCAs)、N-亞硝基化合物(N-nitroso compounds, NOCs)和血紅素鐵是在加工肉類時產(chǎn)生的。肉類中的肌酸和肌酐在高溫加工過程中會產(chǎn)生HCAs,并且隨著溫度和時間的增加會產(chǎn)生更多的HCAs。HCAs被代謝激活,誘發(fā)DNA序列突變并促進細胞增殖,從而導致癌癥[39]。②細胞色素P450酶誘導PAHs,與DNA共價結合,促進DNA序列的變異[40]。③不僅高溫加工可以產(chǎn)生NOCs,而且肉類中的血紅素鐵也能誘發(fā)內源性合成NOCs和遺傳毒性的自由基[41]。在本研究中,并沒有得到加工肉、白肉(家禽)和紅肉(牛羊肉)的攝入與日本人群肝癌風險增加有關。這與Yun[10]探討肉類攝入與歐洲人群消化道癌癥風險之間的因果關系,但并沒有得到肉類攝入增加與肝癌風險增加有關的結果一致。

本研究利用MR來揭示不同的飲食習慣和日本人群中肝癌發(fā)生的因果關系,但大多數(shù)暴露和結局之間并沒有得到相應的因果關聯(lián)?？赡茉蛉缦?①本研究的研究人群主要是日本血統(tǒng),有關日本人群研究的GWASs的樣本量過小。②納入本研究的飲食習慣和日本人群肝癌的發(fā)生可能根本上就沒有因果關聯(lián)。以往的觀察性研究得出的結論很可能沒有較好的控制混雜因素。③不同研究對表型的定義不一樣。

4 結論

本研究認為面包的攝入會增加日本人群肝癌患病的風險。 但這需要更大樣本量的GWASs數(shù)據(jù)來證實。