姜春輝

（北京高博博仁醫(yī)院分子診斷科，北京 100070）

感染屬于臨床惡性血液病患者十分常見的一種并發(fā)癥，主要因患者自身免疫功能低下所致。惡性血液病患者需要接受放化療治療，或應用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制等藥物，會對自身的免疫功能造成影響，極大程度地增加了感染的風險。目前，臨床診斷惡性血液病患者是否合并感染的技術較多，包括炎癥指標檢測、影像學檢查、病原體檢測等，但傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測技術易出現(xiàn)漏診、誤診的情況，且難以鑒別病原體類型，治療方案也多是根據(jù)臨床經(jīng)驗制定，可能影響治療效果，甚至延誤治療[1]。因此，尋找一種準確、快速的診斷方法成為臨床深入研究的課題。宏基因組二代測序（mNGS）技術是近幾年新發(fā)展形成的病原體檢測技術，能夠一次檢測完成百萬以上堿基對的核酸序列，通過與基因組數(shù)據(jù)庫進行對比，從而可鑒別病原體種類，制定針對性的治療方案[2]。本次研究以2019 年4 月至2022 年4 月我院收治的260 例惡性血液病疑似并發(fā)感染患者為研究對象，對比分析傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測技術與mNGS 技術診斷惡性血液病合并感染的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年4 月至2022 年4 月我院收治的260例惡性血液病疑似并發(fā)感染患者作為研究對象，其中男性140 例，女性120 例；年齡7 ～93 歲，平均年齡（45.94±5.25）歲；其中，130 例患者確診為急性髓系白血病，74 例患者確診為急性淋巴細胞白血病，24 例患者確診為骨髓增生異常綜合征，14 例患者確診為淋巴瘤，18 例患者確診為其他惡性血液病。納入標準：（1）確診為惡性血液疾病，且符合相關診斷標準；（2）體溫超過37.5℃，考慮并發(fā)感染；（3）同意配合本次診療研究。排除標準：（1）臨床資料缺失；（2）樣本污染；（3）抵觸配合研究。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 對患者臨床癥狀的發(fā)作情況進行統(tǒng)計和評估，于寒戰(zhàn)或高燒發(fā)作的預估高峰前30 ～50 min采集檢驗樣本，包括：外周血、腦脊液、支氣管灌洗液、胸腹水等。

1.2.2 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)方法 體液樣本均使用血培養(yǎng)儀培養(yǎng)，并對樣本中的病原體種類給予鑒別，嚴格按照生產(chǎn)廠家提供的說明書進行操作。

1.2.3 mNGS 檢測方法 體液樣本采集后放于室溫下保存并立即檢測。提取體液中的游離核酸，需要將樣本以4000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層清液進行DNA 提取，使用柱提法進行微生物DNA 提取。取適量純化后的DNA 樣本，在DNA 片段化的同時采用轉(zhuǎn)座酶法進行末端修復和接頭的連接，以確保低起始量的DNA 建庫成功。DNA 文庫純化后進行PCR 富集，利用Realtime 方式對文庫濃度進行絕對定量，以Q-Sep 100 進行插入片段大小的質(zhì)控。待文庫質(zhì)控確認無誤后，使用Nextseq550 測序儀上機測序，有效數(shù)據(jù)不少于20 M。測序完成后，利用生物信息軟件對DNA 序列信息給予分析。先通過測序標簽對樣本進行拆分、剪切接頭、過濾掉低質(zhì)量片段及長度低于35 bp 的序列等操作，獲取高質(zhì)量的DNA 序列。再將其與病原數(shù)據(jù)庫中的參考序列進行比較，比對成功的序列要再去除高重復序列（duplication）、低質(zhì)量比對序列等。根據(jù)生物信息分析后得到的結果計算檢出病原的參數(shù)，包括比對序列數(shù)、覆蓋度以及測序深度等。對數(shù)據(jù)庫中的細菌、真菌、病毒等分類標準進行結果判讀。

1.3 觀察指標

（1）檢出率、敏感性、特異性。以臨床綜合診斷結果為金標準，分別計算傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測技術與mNGS 技術對惡性血液病并發(fā)感染的檢出率，以及診斷惡性血液病并發(fā)感染的敏感性與特異性。細菌/ 病毒陽性標準：覆蓋率超過其他微生物10 倍以上；真菌陽性診斷標準：覆蓋率超過其他真菌5 倍以上。敏感性= 真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+ 假陽性例數(shù)）×100.00% ；特異性= 真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100.00%。（2）多種病原菌檢出率。分別計算兩種診斷技術對不同病原菌的檢出率。

1.4 統(tǒng)計學方法

以SPSS 25.0 軟件作為結果統(tǒng)計學分析的專用處理軟件，% 作為計數(shù)資料結果記錄的格式，用χ2 檢驗，±s作為計量資料結果記錄的格式，用t檢驗，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術的檢測結果

260 例惡性血液病患者經(jīng)臨床綜合判斷，確診186 例患者并發(fā)感染，占比71.54%。傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術的檢測結果如表1 所示。

表1 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術的檢測結果（例）

2.2 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術診斷敏感性、特異性的比較

通過計算，mNGS 技術診斷惡性血液病合并感染的敏感性、特異性均明顯高于傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測技術（P＜0.05）。詳見表2。

表2 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術診斷敏感性、特異性的比較[%（例/例）]

2.3 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術對多種病原菌的檢出率

通過計算，mNGS 技術檢出細菌、真菌及病毒的陽性率均明顯高于傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測技術（P＜0.05）。詳見表3。

表3 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術對多種病原菌的檢出率[例（%）]

3 討論

并發(fā)感染是臨床患者病情快速加重或死亡的重要誘因。感染產(chǎn)生的多種炎性因子具有不同的細胞毒性，可直接對組織、系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響，給機體造成更大的負荷。尤其對于惡性血液病群體而言，其本身便有全身性癥狀，并伴有機體的免疫功能下降，同時需接受化療、放療、靶向治療等多種方式干預，易引發(fā)骨髓抑制等問題，因此惡性血液病患者均表現(xiàn)出不同程度的免疫功能衰退特性，使其成為院內(nèi)感染的高危群體[3-4]。此外，惡性血液病患者體內(nèi)的粒細胞數(shù)量大幅度減少，甚至部分群體可能出現(xiàn)粒細胞缺乏的問題，這種情況會造成感染病原體后無法形成具有感染特性的病灶，最終嚴重影響臨床對感染病原體種類的判斷，延誤治療時機，甚至可引起多重病原體感染，使患者的病情在短時間內(nèi)快速惡化。近年來，憑借現(xiàn)代醫(yī)療技術的不斷革新和完善，雖然惡性血液病患者的死亡率得到一定控制，但并發(fā)感染后引起死亡的概率仍居高不下。國內(nèi)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，惡性血液病患者并發(fā)感染后的死亡率可達23% 左右，而此類患者并發(fā)感染的概率則超過了50%，尤以血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)感染占比最高，前者的發(fā)生率甚至占所有惡性血液病并發(fā)感染的1/3 以上。因此，臨床上在治療惡性血液病并發(fā)感染時，需要快速、準確地判斷導致感染的病原體種類，以便采取針對性的抗菌治療措施，在最短的時間內(nèi)控制感染，避免患者的病情加重，縮短整體治療周期[5-6]。

既往臨床針對感染的診斷方法以病原學檢測為主，可通過分離、提純樣本中的微生物，并進一步培養(yǎng)，從而獲得具體的微生物種類，使用的方法有免疫學檢測、PCR 技術、微生物培養(yǎng)等。但這些方法均存在一定的局限性，即鑒別的準確性完全依賴于分離的活體菌株，若分離活體菌株的數(shù)量不足，則體外培養(yǎng)結果可能存在偏差，加之該培養(yǎng)過程需要至少48 h，而部分真菌、結核分枝桿菌等對外界生存環(huán)境要求苛刻的病原體種類所需的培養(yǎng)時間還會被進一步延長，甚至部分菌株完全不適合在體外分離培養(yǎng)，故可導致漏檢、誤檢等問題[7]。在臨床實踐工作中，通過血樣微生物培養(yǎng)方式得出的陽性率相對較低，且精準度也欠缺，加之消耗的周期較長，因而正在被逐漸淘汰。免疫學檢測中的抗原/ 抗體檢測可通過人體受到抗原刺激后產(chǎn)生的特異性抗體完成檢測，從而快速、準確地判斷病原體種類，但實際操作過程中會受到抗原包被、洗滌等客觀因素的影響，導致假陽性問題的出現(xiàn)。同時，該檢測技術在病毒種類的鑒別方面存在一定的不足，尤其是針對具有快速變異特性的病毒而言，檢出率極低[8]。分子診斷技術屬于新型檢測技術的一種，但需借助PCR 技術對已知特定的核酸序列給予分辨，操作時需設計特定的引物，消耗的時間過長，且若患者存在多重感染的情況，會進一步增加檢驗的難度。近年來，隨著醫(yī)學界對惡性血液病研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)此類患者并發(fā)感染時出現(xiàn)混合型、多重耐藥菌感染的概率越來越高，使得病原體譜系越發(fā)復雜，給病原體的鑒別工作提出了更高的要求，傳統(tǒng)檢驗方式越來越不適應現(xiàn)代臨床需求。

mNGS 技術屬于新型非靶向、廣譜病原體篩查技術之一，能夠獲得采集樣本中所有病原體的基因核酸片段，且無需對各片段給予分離、提純等處理工序，大幅節(jié)省了整體檢查時間，并且在檢查過程中不會出現(xiàn)偏移現(xiàn)象。該技術的優(yōu)勢在于檢測速度快、通量高、敏感度高、準確性高、覆蓋面廣等，可用于快速、精準檢測病原體的工作當中[9]。mNGS 技術能夠?qū)崿F(xiàn)對病原體種類的全覆蓋檢測，且測序技術無偏倚性缺陷，因而敏感性、準確性均相對較高。該技術在檢測DNA、RNA 核酸序列時使用的是平行排列測序法，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對所有感染病原體的鑒別，為后續(xù)靶向治療方案的擬定提供準確的參考，最大程度地減少了漏診、誤診情況的發(fā)生，同時也能夠縮短獲取病原體種類的時間，為早期的抗感染治療提供了保障，避免患者的病情進一步惡化，并減少了多重耐藥菌株的出現(xiàn)。但需要注意的是，實際采樣過程中無法完全避免核酸污染的情況，加之人體內(nèi)本身也含有部分菌群，使得感染群體的原生菌群鑒別難度增加，因此操作過程中必須嚴格遵照無菌操作標準，最大程度地避免核酸污染的發(fā)生[10]。同時，mNGS 技術在應用時需標明檢出基因的序列數(shù)，再參照人類現(xiàn)有的病菌基因數(shù)據(jù)庫進行對比，從而判斷、鑒別所感染的病原菌種類。但由于mNGS 結果的產(chǎn)生存在較高的復雜性，因此通常將檢出序列數(shù)值最高者認定為病原體的主要數(shù)據(jù)，而少部分病原體的基因序列數(shù)值偏低，這類病菌在檢測時往往會被認定為疑似病原體。另外，各地區(qū)醫(yī)院搭建的病原菌數(shù)據(jù)庫標準不同、解讀人員依照的標準不同，使得不同醫(yī)院間的診斷標準缺乏統(tǒng)一性，患者轉(zhuǎn)院后的檢查報告可能存在出入[11]。除此之外，雖然近幾年國家對于醫(yī)療費用的控制仍在不斷加強，使得多項臨床檢查的成本得以降低，其中就包括基因測序鑒別（目前國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院已經(jīng)實現(xiàn)了“千元級”的基因測序），但對于普通群眾來說仍屬于高額醫(yī)療成本[12]。且mNGS 技術常被應用于重大疾病、突發(fā)性公共衛(wèi)生事件、重癥感染、免疫缺陷人群的檢查等工作當中，這也使得其臨床應用受到極大限制。

總之，臨床可利用mNGS 技術診斷惡性血液病患者是否并發(fā)感染，具有較高的準確率和敏感性，同時可判斷具體的病原體種類，為進一步制定治療方案提供依據(jù)及支持，值得臨床運用推廣。