張澤宇　肖揚(yáng)　詹亞斌　魏雨泉　徐道清　李季

摘要：通過采用Biolog EcoPlate 培養(yǎng)、16S r RNA基因高通量測(cè)序技術(shù)等方法研究不同培養(yǎng)基上植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成差異，探究不同培養(yǎng)基等營養(yǎng)條件對(duì)番茄內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：（1）4種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的內(nèi)生菌群在Biolog EcoPlate 微平板培養(yǎng)96 h 后，菌群生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，且在牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基下菌群代謝活性較高。R2A培養(yǎng)基下菌群代謝活性較低。（2） 番茄內(nèi)生微生物組包括檸檬酸桿菌屬（Citroebacteria）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘脂單胞菌（Sphingbacterium）、布克氏菌屬（Burkholderia）。（3）LB、TSA培養(yǎng)基分離到的內(nèi)生菌多為芽孢桿菌屬；在NA、R2A培養(yǎng)基中番茄內(nèi)生菌組成多為檸檬酸桿菌、芽孢桿菌、鞘脂單胞菌、布克氏菌，為優(yōu)勢(shì)菌種。（4）NA培養(yǎng)基中番茄內(nèi)生微生物組香農(nóng)指數(shù)高于其他處理（P<0.05）差異；PCoA分析顯示4種培養(yǎng)基中番茄內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有差異（P<0.05）。（5）網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)NA、R2A培養(yǎng)基中番茄內(nèi)生細(xì)菌微生物組模塊化水平更高，而且網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫愿摺＃?）LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，LB富集的物種為芽孢桿菌，NA培養(yǎng)基富集物種多為假單胞菌（Pseudomonas），R2A培養(yǎng)基富集物種多鞘脂單胞菌，TSA培養(yǎng)基富集物種多布克氏菌屬。 本研究通過高通量測(cè)序分析不同營養(yǎng)類型培養(yǎng)基對(duì)番茄內(nèi)生微生物組群落結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)于生產(chǎn)中通過利用營養(yǎng)條件調(diào)控植物內(nèi)生菌群群落結(jié)構(gòu)組成及靶向篩選有益微生物具有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)基；營養(yǎng)條件；Biolog EcoPlate微平板；16S rRNA基因高通量測(cè)序；內(nèi)生菌群

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2023）11-0128-05

植物內(nèi)生菌是指真菌和細(xì)菌在某個(gè)生活階段能夠進(jìn)入活體植物組織內(nèi)，并且在植物組織內(nèi)不引起顯著變化的一類微生物［1］。植物內(nèi)生菌主要來源于土壤微生物，或者大氣中的微生物通過植物氣孔、自然傷口進(jìn)入植物組織內(nèi)。內(nèi)生細(xì)菌作為一類特殊的微生物，與植物宿主一同演化共生，但不引起宿主的明顯癥狀，所處環(huán)境穩(wěn)定，營養(yǎng)來源豐富、可靠［2］。研究表明，植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，如各類型保護(hù)酶、生長(zhǎng)素等物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)植物代謝，幫助植物抵御逆境脅迫，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，具有良好的生態(tài)功能［3］。

植物內(nèi)生菌是一類多樣性十分豐富的微生物類群，與宿主存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系［4］，隨著研究領(lǐng)域的不斷擴(kuò)寬和研究方法的改進(jìn)，探尋植物內(nèi)生菌的最適營養(yǎng)條件成為當(dāng)下植物與微生物互作研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一［5］。自然生長(zhǎng)環(huán)境下有很多因素均可以影響植物內(nèi)生菌的組成結(jié)構(gòu)，如碳源、氮源、根系分泌物等關(guān)鍵營養(yǎng)因子［6-7］。內(nèi)生菌群與植物之間的相互作用對(duì)植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)具有重要影響，如促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防止病原微生物的侵害［8-10］等。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和微生物組研究的深入，越來越多的模式植株如擬南芥、水稻、小麥、番茄、甜菜等多種植物根系微生物組的結(jié)構(gòu)得到了解析。研究表明，無論是單子葉植物還是雙子葉植物，根系微生物組多集中于變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門［4］。由植物自身代謝引起的營養(yǎng)調(diào)節(jié)作用對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌的組成有很大影響［4］，因此從營養(yǎng)成分差異角度揭示營養(yǎng)成分對(duì)番茄內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響對(duì)于有益內(nèi)生菌的定向篩選及有益生物學(xué)功能的發(fā)揮具有重要意義。

本研究通過將番茄根部組織研磨液涂布在LB、TSA、NA、R2A這4種培養(yǎng)基上，通過制備不同營養(yǎng)條件下的番茄內(nèi)生微生物組，通過Biolog Ecoplate測(cè)定和16S r RNA gene高通量測(cè)序技術(shù)分析番茄根部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，研究不同營養(yǎng)類型培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期能夠利用營養(yǎng)條件定向調(diào)控內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成，以期為靶向篩選目標(biāo)內(nèi)生菌提供理論依據(jù)。

1材料與方法

番茄植株來自于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)園溫室，栽培管理措施均按日常管理措施進(jìn)行。

1.1供試分離培養(yǎng)基

R2A培養(yǎng)基：稱取R2A瓊脂培養(yǎng)基41 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20 g，pH值7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

TSA培養(yǎng)基：稱取TSA瓊脂培養(yǎng)基40 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

NA培養(yǎng)基：稱取蛋白胨 10 g，牛肉粉3 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂15 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

PBS緩沖液：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na₂HPO₄，pH值7.4，去離子水定容至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

1.2番茄根部?jī)?nèi)生微生物組的制備

番茄植株于2021年8月采集自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)園溫室，栽培管理措施均按照日常管理措施進(jìn)行。采集4葉期番茄苗，稱取番茄根1 g，在PBS緩沖液中將其研磨后將研磨液用無菌水按照倍比稀釋法，取100 μL稀釋液分別涂布于TSA、LB、NA、R2A培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，各培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落即為番茄根部?jī)?nèi)生微生物組。

1.3Biolog EcoPlate測(cè)定

植物研磨液在各類型培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，用無菌水沖洗各個(gè)培養(yǎng)基平板，并用涂布棒將培養(yǎng)基平板上的菌在無菌水中涂抹均勻，最后用移液器吸取各培養(yǎng)基平板上的菌懸液1 mL到裝有10 mL PBS緩沖溶液的50 mL離心管中，振蕩2 min 后，5 000 g 離心5 min，取1 mL上清液加入到裝有20 mL PBS緩沖液的離心管中，混合均勻后加入到Biolog EcoPlate 平板中，每孔加入100 mL懸浮液。將接種后的微平板置于25 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 24 h用細(xì)菌讀數(shù)儀讀取微平板吸光度，連續(xù)測(cè)定5 d。

1.416S rRNA基因高通量測(cè)序分析內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

培養(yǎng)7 d后，用無菌水沖洗各培養(yǎng)基平板，并用涂布棒涂抹，用移液槍吸取各平板上的菌懸液1 mL提取菌懸液DNA，采用特異性引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′） 和1193R （5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′），以菌懸液DNA為模板，擴(kuò)增16S rRNA基因V7～V9區(qū)，擴(kuò)增片段大小約為394 bp。反應(yīng)體系25 μL：TaKaRa Mix 12.5 μL，779F 1 μL，1392R 1 μL，DNA 1 μL，ddH₂O 9.5 μL，PCR 擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸 5 min。產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用PCR純化試劑盒（Cycle-Pure Kit，OMEGA，美國）將PCR產(chǎn)物純化，按照說明書的操作步驟進(jìn)行，然后將純化后的產(chǎn)物按照測(cè)序要求建立測(cè)序文庫，送交廣州美格生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，并分析結(jié)果。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用Origin軟件畫圖。

2結(jié)果與分析

2.1番茄內(nèi)生菌菌群的AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

平均顏色變化率（AWCD）是反映微生物代謝活性（即微生物利用碳源的能力）的指標(biāo)（圖1），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物利用碳源數(shù)量整體逐漸增加。在24～96 h內(nèi)，番茄內(nèi)生菌群處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌群代謝活性逐漸升高；在培養(yǎng)96 h后，番茄菌群的生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，NA培養(yǎng)基下菌群代謝活性較高。R₂A培養(yǎng)基下菌群代謝活性較低。

2.2不同類型培養(yǎng)基番茄內(nèi)生細(xì)菌種屬分布

各個(gè)類型培養(yǎng)基分離出的內(nèi)生菌大部分屬于檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘脂單胞菌（Sphinogbacterium）、布克氏菌屬（Burkholderia）。R₂A培養(yǎng)基作為一種廣譜的營養(yǎng)來源，內(nèi)生細(xì)菌組成種類較多，各類型內(nèi)生菌分布較為均勻；NA培養(yǎng)基中內(nèi)生菌分布情況與R₂A類似：芽孢桿菌、布克氏菌屬、鞘脂單胞菌、檸檬酸桿菌均為優(yōu)勢(shì)物種；但是在TSA和LB培養(yǎng)基中，內(nèi)生菌群中芽孢桿菌屬豐度較高，所占比例均在80%左右，成為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)物種（圖2）。

2.3不同類型培養(yǎng)基番茄內(nèi)生菌群多樣性分析

TSA、LB、NA、R2A 4種類型的培養(yǎng)基上內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異（P<0.05），不同營養(yǎng)類型的培養(yǎng)基成分對(duì)植物內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響。α多樣性分析中，辛普森指數(shù)（Simpson）之間沒有顯著差異，但從香農(nóng)指數(shù)（Shannon）來看，牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基中的番茄內(nèi)生微生物組高于其他處理（P<0.05）（圖3）。

主成分分析可以將不同樣本的多元變量變換為互不相關(guān)的主元變量（PC1和PC2），在降維后主元向量空間中可以利用點(diǎn)的位置直觀反映出不同培養(yǎng)基微生物群落代謝特征。發(fā)現(xiàn)4種培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下番茄內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異（P<0.05）（圖4）。

2.4不同類型培養(yǎng)基番茄內(nèi)生菌群網(wǎng)絡(luò)共線性分析及物種差異分析

網(wǎng)絡(luò)共線性分析發(fā)現(xiàn)，NA、R2A培養(yǎng)基中番茄

內(nèi)生細(xì)菌微生物組模塊化水平更高，而且網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫愿?，LB、TSA培養(yǎng)基中番茄內(nèi)生細(xì)菌微生物組模塊化水平較低（圖5）。LEfSe分析發(fā)現(xiàn)LB培養(yǎng)基富集的物種為芽孢桿菌，NA培養(yǎng)基富集物種多為假單胞菌（Pseudomonas），R₂A培養(yǎng)基富集物種多為鞘脂單胞菌，TSA培養(yǎng)基富集物種多為布克氏菌屬（圖6）。

3討論

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)各類型培養(yǎng)基上得到的番茄內(nèi)生微生物組組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，LB、TSA培養(yǎng)基中芽孢桿菌屬是優(yōu)勢(shì)物種，但是在R₂A、NA培養(yǎng)基中，內(nèi)生菌群組成較為均勻，不存在絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)物種。

微平板培養(yǎng)96 h后，菌群生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，NA培養(yǎng)基下菌群代謝活性較高。R₂A培養(yǎng)基下菌群代謝活性較低，可能是NA培養(yǎng)基中氨基酸含量較高引起［11］?？梢姷磳?duì)于增強(qiáng)微生物代謝活性具有重要意義。4種培養(yǎng)基分離到的內(nèi)生菌多為檸檬酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、鞘脂單胞菌、布克氏菌屬，且不同營養(yǎng)類型的培養(yǎng)基下內(nèi)生菌群中優(yōu)勢(shì)物種有所差異：LB、TSA培養(yǎng)基分離到的內(nèi)生菌多為芽孢桿菌，為優(yōu)勢(shì)物種；NA、R₂A培養(yǎng)基分離到的內(nèi)生菌中檸檬酸桿菌、芽孢桿菌、鞘脂單胞菌、布克氏菌為優(yōu)勢(shì)菌屬。何紅通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)番茄內(nèi)生菌中放線菌、假單胞菌含量較高［12］，與本研究結(jié)果有所差異?？梢娡ㄟ^培養(yǎng)組學(xué)獲得的物種信息與生物信息學(xué)分析相比，還存在一定差距，今后還需要改善營養(yǎng)條件以期獲得更為全面的物種分類信息。PCoA分析顯示β多樣性有顯著差異（P<0.05），即在不同營養(yǎng)水平下番茄內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)不同，文才藝等也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果［13］：不同生境下的番茄微生物組不同，可能是由于理化環(huán)境中營養(yǎng)條件的異質(zhì)性引起的。

本研究中培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)條件與自然環(huán)境植物相比，成分有所不同［14］，番茄根系分泌物中多含有醛類、酸類等物質(zhì)，根系分泌物等復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)對(duì)番茄內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的影響有待于進(jìn)一步研究。

不同種類微生物所需要的營養(yǎng)條件不同，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康目赏ㄟ^調(diào)控營養(yǎng)水平達(dá)到靶向分離內(nèi)生細(xì)菌的方法。本研究分析了外源營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于番茄內(nèi)生菌群的影響，進(jìn)一步探求內(nèi)生菌群中的重要成員結(jié)構(gòu)變化，分析各類型營養(yǎng)條件下優(yōu)勢(shì)菌群特征，為更好地研究?jī)?nèi)生菌與植物互作奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為改善植物生長(zhǎng)環(huán)境達(dá)到服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的目的創(chuàng)造理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

（1）4種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的內(nèi)生菌群在Biolog 微平板培養(yǎng)96 h 后，菌群生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，NA培養(yǎng)基

下菌群代謝活性較高，R₂A培養(yǎng)基下菌群代謝活性較低。（2）4種培養(yǎng)基下番茄微生物組成分多為檸檬酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、鞘脂單胞菌、布克氏菌屬，且群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異。（3）LB、TSA培養(yǎng)基分離到的內(nèi)生菌多為芽孢桿菌屬，為優(yōu)勢(shì)物種；NA、R₂A培養(yǎng)基分離到的內(nèi)生菌中檸檬酸桿菌、芽孢桿菌、鞘脂單胞菌、布克氏菌為優(yōu)勢(shì)菌種。（4）網(wǎng)絡(luò)共線性分析發(fā)現(xiàn)，R₂A、NA培養(yǎng)基中的網(wǎng)絡(luò)模塊化程度更高，具有更強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫浴?/p>

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