胡燕 李英娜 劉瑩瑩 胡艦 王榮蘭 朱云龍 何志貴

摘要：該研究以紅蘿卜為原料，用硫酸銨沉淀法提取芥子苷酶，使用考馬斯亮藍(lán)法和雙縮脲法對粗提物進(jìn)行了蛋白質(zhì)定性分析。以提取率為指標(biāo)，考察液料比、浸提時間、緩沖溶液pH 3個因素對提取率的影響，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，得到最佳提取條件為液料比3（mL/g），浸提時間3 h，緩沖溶液pH 7.0。在此條件下，芥子苷酶粗提物提取率為5.74%，采用DNS法測定酶活，結(jié)果顯示酶活為96 U。此研究結(jié)果能為紅蘿卜中芥子苷酶的后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為紅蘿卜的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紅蘿卜；酶活；芥子苷酶；提取率

中圖分類號：TS201.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）07-0128-05

Abstract： In this study， red radish is used as the raw material to extract myrosinase by ammonium sulfate precipitation method， and the protein in crude extract is qualitatively analyzed using Bradford method and biuret method. With extraction rate as the index， the effects of three factors including liquid-solid ratio， extraction time and pH of buffer solution on the extraction rate are investigated. According to the results of single factor experiment， orthogonal experiment is carried out. It is determined that the best extraction conditions are the liquid-solid ratio of 3 （mL/g）， the extraction time of 3 h and pH of the buffer solution of 7.0. Under such conditions， the extraction rate of crude extract of myrosinase is 5.74%. The enzyme activity is determined by DNS method. The results show that the enzyme activity is 96 U. The results can provide experimental basis for the follow-up study on myrosinase in red radish and scientific basis for the development and utilization of red radish.

Key words： red radish; enzyme activity; myrosinase; extraction rate

遍布全球的十字花科植物（Cruciferac）有著獨(dú)特的生存和擴(kuò)展優(yōu)勢，主要得益于它們特殊的芥子苷酶防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)由一種次生代謝物硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷水解酶組成[1]，如莖用芥菜、蘿卜、雪里蕻等。含硫代葡萄糖苷的植物總是攜帶能夠水解硫代葡萄糖苷的芥子苷酶，硫代葡萄糖苷存在于液泡中，不與芥子苷酶直接接觸。當(dāng)植物的結(jié)構(gòu)被破壞時，硫代葡萄糖苷被芥子苷酶水解，葡萄糖被釋放[2]。因此，對芥子苷酶的研究具有重大意義。

目前對芥子苷酶的研究主要集中在對芥子苷酶的分離純化和芥子苷酶的特性兩個方面。趙大云等[3]對雪菜芥子苷酶的特性研究和徐偉麗等[4]對莖用芥菜芥子苷酶的特性研究皆表明，芥子苷酶會影響含硫甙蔬菜加工中風(fēng)味和色澤。芥子苷酶對于腌制蘿卜風(fēng)味的形成有重要作用，同時腌制過程中蘿卜會逐漸變黃甚至變褐[5]，何鳳平等[6]研究發(fā)現(xiàn)蘿卜腌制品中黃色素的形成與蘿卜中芥子苷酶催化的硫甙的降解有關(guān)，可見芥子苷酶對腌制蘿卜的質(zhì)量產(chǎn)生重大影響，但目前未見對蘿卜中芥子苷酶提取方法的研究。本實(shí)驗(yàn)用硫酸銨鹽析法提取蘿卜中芥子苷酶，通過考馬斯亮藍(lán)法和雙縮脲法對酶粗提取物進(jìn)行定性分析，再通過酶聯(lián)檢測法檢測酶活性，有助于對芥子苷酶的后續(xù)研究，對于蘿卜加工的研究具有支撐作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

紅蘿卜：購于哈爾濱市地利生鮮水果超市。

磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、硫酸銨、聚乙二醇6000、丙酮、硫酸銅、考馬斯亮藍(lán)、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、無水亞硫酸鈉、Vc、偏磷酸、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、鹽酸、辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷：均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

MB1002型多功能食品加工機(jī) 寧波美居電器有限公司；85-2A型恒溫磁力攪拌器 天津市賽多利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；DHG-9175A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-5200型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-3C型臺式酸度計(jì) 上海雷磁儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芥子苷酶的提取

1.2.1.1 芥子苷酶提取方法

使用硫酸銨鹽析法[7]，稱取新鮮的蘿卜樣品，加磷酸緩沖液后于組織攪碎機(jī)上勻漿，在4 ℃下浸提，勻漿液用80目的紗布過濾，濾液以12 000 r/min離心20 min（4 ℃），取上清液緩慢地加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)到67%，持續(xù)緩慢1 h后，以12 000 r/min離心20 min，取沉淀（粗酶提取物），用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液溶解后透析，溶解后置于分子截留量為1 000的透析袋中對蒸餾水透析24 h，透析內(nèi)液用PEG-6000濃縮至20 mL后，冷凍貯藏待用。

1.2.1.2 芥子苷酶提取率計(jì)算方法

芥子苷酶提取率的計(jì)算見下式：

R（%）=m 1-m 2m 3×100。

式中：R為芥子苷酶提取率（%）；m 1為離心筒與沉淀物質(zhì)量總和（g）；m 2為離心筒的質(zhì)量（g）；m 3為紅蘿卜的質(zhì)量（g）。

1.2.2 芥子苷酶粗提取物定性分析

1.2.2.1 考馬斯亮藍(lán)法

取1 mL待測液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液于比色皿中，取1 mL磷酸緩沖溶液于比色皿中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，在595 nm處測定吸光度值。

1.2.2.2 雙縮脲試劑顯色法

配制A液（100 mL 0.1 g/mL NaOH溶液），B液（100 mL 0.01 g/mL硫酸銅溶液）。先吸取3 mL雙縮脲試劑A加入3 mL組織樣液，將其振蕩均勻（需營造一個堿性環(huán)境），然后加1～2滴雙縮脲試劑B，再次振蕩均勻。如果組織中含有蛋白質(zhì)，溶液就會變成紫色，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。

1.2.3 芥子苷酶提取率的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 液料比對芥子苷酶提取率的影響

取50 g紅蘿卜樣品，分別加入50，100，150，200，250 mL pH值為7.0的磷酸緩沖液，于組織攪碎機(jī)上勻漿，4 ℃浸提3 h，勻漿液用80目紗布過濾，濾液以12 000 r/min離心20 min（4 ℃），取上清液緩慢加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)到60%，持續(xù)緩慢1 h后，以12 000 r/min離心20 min，取沉淀（粗酶提取物）用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液溶解后透析，溶解后置于分子截留量為1 000的透析袋中對蒸餾水透析24 h，透析內(nèi)液用PEG-6000濃縮至20 mL后，冷凍貯藏待用。

1.2.3.2 浸提時間對芥子苷酶提取率的影響

取50 g紅蘿卜樣品，分別加入150 mL pH值為7.0的磷酸緩沖溶液，于組織攪碎機(jī)上勻漿，4 ℃條件下分別浸提0.5，1，2，3，4，5 h，勻漿液用80目紗布過濾，后續(xù)操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 緩沖溶液pH對芥子苷酶提取率的影響

取50 g紅蘿卜樣品，分別加入150 mL pH值為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的磷酸緩沖溶液，于組織攪碎機(jī)上勻漿，4 ℃條件下浸提3 h，勻漿液用80目紗布過濾，后續(xù)操作同1.2.3.1。

1.2.4 芥子苷酶提取率的正交實(shí)驗(yàn)

為使提取率最高，在芥子苷酶提取率單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的3個因素的3個最佳水平，進(jìn)一步進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而確定芥子苷酶提取率的最優(yōu)條件。正交實(shí)驗(yàn)的3個因素為液料比、浸提時間、緩沖溶液pH，每個因素取3個水平，見表1。選用L 9（33）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算最終提取率，確定提取芥子苷酶最佳方案。

1.2.5 芥子苷酶提取正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行測定3次，計(jì)算提取率。

1.2.6 芥子苷酶酶活的測定

芥子苷酶活力單位（U）定義：1 g酶粉在一定溫度和pH條件下酶解反應(yīng)1 h，釋放出1 μmol葡萄糖為1個酶活力單位，以μmol葡萄糖/（g·h）表示。

精密稱取粗酶粉0.02 g，加入0.4 mL濃度為0.04 mol/L的Vc，0.8 mL濃度為0.1 mol/L（pH 8.0）的磷酸緩沖液，隨后將其置于50 ℃的水浴鍋中保溫5 min，添加0.5 mL濃度為3 mg/mL的辛基硫代葡萄糖苷，定容至3.5 mL。反應(yīng)1 h，以0.2 mL 18%的偏磷酸終止反應(yīng)。使用DNS法測定釋放出的葡萄糖量。

1.2.6.1 配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取分析純葡萄糖100 mg，將其放置于小燒杯中，加入少量的蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，混勻，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2 DNS試劑的配制

稱取酒石酸鉀鈉182 g、3，5-二硝基水楊酸7 g，加熱溶于500 mL水中，加入15 g NaOH，邊加邊攪拌，再加入4 g苯酚和1 g無水亞硫酸鈉，溶解冷卻后加入水定容到1 000 mL，靜置7 d。

1.2.6.3 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

按表2中方法混合均勻后，沸水浴5 min，冷卻后加入4 mL蒸餾水，混勻，在540 nm下測OD值。

1.2.6.4 樣品酶活的測定

取4支比色管，標(biāo)號0，1，2，3，其中0號試管為對照，設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)，分別加入酶解后的樣品0，0.5，0.5，0.5 mL，再分別加入DNS試劑0.5 mL混勻，沸水浴5 min，冷卻后加入4 mL蒸餾水混勻，測OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥子苷酶粗提物定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 雙縮脲法測定結(jié)果與分析

將芥子苷酶粗提取物用雙縮脲法檢測，結(jié)果顯示，樣液振蕩均勻后由藍(lán)色變?yōu)榈仙?，由此確定粗酶提取物中含有蛋白質(zhì)。

2.1.2 考馬斯亮藍(lán)法測定結(jié)果與分析

將芥子苷酶粗提取物進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)法定性分析，在595 nm下測定吸光度值為2.234，吸光度值較高，由此可確定芥子苷酶粗提取物中蛋白質(zhì)含量高。

2.2 芥子苷酶提取率的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 液料比對芥子苷酶提取率的影響

芥子苷酶提取過程中，在其他因素相同的條件下，考察液料比對芥子苷酶提取率的影響，見圖1。

由圖1可知，當(dāng)液料比在1∶1～2∶1之間時，芥子苷酶提取率顯著升高，從3.18%上升至5.48%；液料比在2∶1～3∶1之間時，提取率趨緩，從5.48%上升至5.56%，且當(dāng)液料比為3∶1時，提取率出現(xiàn)峰值5.56%；液料比在3∶1～5∶1之間時，提取率稍有下降，從5.56%下降至5.33%。所以液料比在3∶1時，粗酶提取物已經(jīng)被最大程度提取，再增加磷酸緩沖溶液，提取率也不會增高，并且會造成溶劑的浪費(fèi)，增加成本損耗，在保證浸提率的同時應(yīng)減少溶劑用量。

2.2.2 浸提時間對芥子苷酶提取率的影響

芥子苷酶提取過程中，在其他因素相同的條件下，考察浸提時間對芥子苷酶提取率的影響，見圖2。

由圖2可知，當(dāng)浸提時間在1～3 h之間時，芥子苷酶提取率顯著上升，從3.18%上升至5.83%；當(dāng)浸提時間在3～5 h之間時，提取率稍有下降，從5.83%下降至5.76%；當(dāng)浸提時間在5～6 h之間時，提取率上升幅度很小，從5.76%上升至5.80%。說明當(dāng)浸提時間達(dá)到3 h時，粗酶提取物已完全提取出來，繼續(xù)增加浸提時間，粗酶提取物的提取率只會小幅度增加，并且不會超過浸提3 h時的最大提取率。

2.2.3 緩沖溶液pH對芥子苷酶提取率的影響

芥子苷酶提取過程中，在其他因素相同的條件下，考察緩沖溶液pH對芥子苷酶提取率的影響，見圖3。

由圖3可知，緩沖溶液pH在4.0～7.0之間時，芥子苷酶粗提取物的提取率隨緩沖溶液pH的升高而上升，從2.63%上升至2.97%；緩沖溶液pH在7.0～8.0之間時，芥子苷酶粗提取物的提取率隨緩沖溶液pH的升高反而降低，提取率從2.97%下降至2.56%。這是因?yàn)榻孀榆彰冈趐H 7.0時穩(wěn)定性最好，在pH<7.0時，酶不穩(wěn)定，且越偏酸環(huán)境越不穩(wěn)定。當(dāng)提取液pH在7.0時，提取率最高，故提取芥子苷酶應(yīng)在中性條件下進(jìn)行。

2.3 芥子苷酶提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表4可知，對不同的指標(biāo)來說，不同因素的影響程度不同，不同指標(biāo)的對應(yīng)方案也有所不同，但通過綜合平衡法可以得到最終的優(yōu)方案。

由極差分析可知，各因素對芥子苷酶粗提取物提取率的影響為A>C>B，即液料比對芥子苷酶粗提取物提取率的影響較顯著，其次是緩沖溶液pH，最后是浸提時間。最佳組合為A 2B 2C 3，即最優(yōu)提取條件為液料比3（mL/g）、浸提時間3 h、緩沖溶液pH 7.0。

2.4 芥子苷酶提取正交實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在該提取條件下蘿卜中的芥子苷酶提取率為5.74%，提取率相對較高，且重復(fù)性好，說明正交實(shí)驗(yàn)所得條件可靠。

2.5 芥子苷酶酶活測定結(jié)果與分析

2.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相關(guān)回歸方程y=3.255 5x－0.040 4，R2=0.996 1。

2.5.2 芥子苷酶酶活測定結(jié)果與分析

由表6可知，加入酶解后的樣品0.5 mL，DNS試劑0.5 mL，蒸餾水4 mL，得到3組不同的吸光度值，分別為1.132，1.256，1.159，計(jì)算酶解后反應(yīng)液還原糖總含量分別為0.34，0.38，0.37 mg，酶活分別為95，97，96 U，酶活的平均值為96 U，由芥子苷酶提取率計(jì)算公式得出芥子苷酶含量為2.876 g。實(shí)驗(yàn)后測定紅蘿卜中的芥子苷酶活性、含量與何鳳平等[6]的測定結(jié)果相近，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

3 結(jié)論

采用硫酸銨鹽析法提取蘿卜中芥子苷酶，采用考馬斯亮藍(lán)法和雙縮脲法對酶粗提取物進(jìn)行定性分析，以提取率為指標(biāo)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用DNS法測定還原糖含量來反映酶活性。通過以上實(shí)驗(yàn)，得到以下結(jié)論：

第一，對芥子苷酶粗提取物定性分析時，考馬斯亮藍(lán)法和雙縮脲法結(jié)果均顯示粗提物是蛋白質(zhì)。

第二，芥子苷酶最優(yōu)提取條件為液料比3（mL/g）、浸提時間3 h、緩沖溶液pH值7.0，此條件下對應(yīng)的芥子苷酶粗物的提取率為5.74%。

第三，DNS法得到葡萄糖平均含量為96 μmol，芥子苷酶粗提取物活性為96 U，芥子苷酶粗提取物質(zhì)量為2.876 g。

此研究結(jié)果能為紅蘿卜中芥子苷酶的后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為紅蘿卜的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

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