鄺曉嵐，蔡婉娜，馬婷，劉博，徐方方（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，根據(jù)不同的組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué)表現(xiàn)可將其分為小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌病例的75%～80%[1]。超過80%的非小細(xì)胞肺癌患者被確診時已處于中晚期，5 年生存率僅為15%[2]。目前非小細(xì)胞肺癌的治療仍以手術(shù)、放療和化療為主，但其復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率高，且存在術(shù)后并發(fā)癥、藥物不良反應(yīng)和耐藥性等問題[3]。中藥具有多成分、多靶點的治療特點，在改善肺癌患者臨床癥狀、提高生存質(zhì)量以及延長患者生存期等方面具有獨特的優(yōu)勢[4]。因此，探尋非小細(xì)胞肺癌的中醫(yī)藥治療方法具有重要意義。

中藥枳椇為枳椇屬鼠李科植物，該屬植物主要包括北枳椇（HoveniadulcisThunb．）、枳椇（Hovenia acerbaLindl.）以及毛果枳椇（HoveniatrichocarpaChun et Tsiang）等[5]。枳椇屬植物入藥部位為果實、木汁和木皮，其主要成分為黃酮類、三萜類以及苯丙素類[6]。研究[7]表明，枳椇子提取物具有較強的抗腫瘤活性。枳椇子95%乙醇提取物對人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的體外增殖具有良好抑制效果[8]；枳椇子水提物能抑制H22 小鼠腫瘤組織生長[9]；枳椇屬三萜類成分hovenidulciosides C 能抑制A549 細(xì)胞中Nrf2 的表達(dá)[10]。Nrf2 的高表達(dá)不僅與腫瘤惡性程度相關(guān)，也與腫瘤TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-12]。上述研究提示，枳椇屬三萜類成分具有治療非小細(xì)胞肺癌的潛力。故本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)探討枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的關(guān)鍵成分及作用機制，以期為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療及藥物研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 枳椇屬三萜類活性成分虛擬篩選 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php/）結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫檢索、匯總枳椇屬三萜類化合物。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載枳椇屬三萜類化合物的結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)庫中未收載的成分使用Chemdraw V19.0 軟件繪制，并以sdf 格式保存。使用Discovery Studio 軟件計算各化合物的“類藥性”參數(shù)，篩選出符合Lipinski “類藥五法則”[13]的化學(xué)成分作為枳椇屬三萜類活性成分。

1.2 枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點獲取 使用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch）檢索“1.1”項下篩選出的枳椇屬三萜類活性成分的作用靶點，選擇物種為“Homo sapiens”。以“Non-small cell lung cancer”為檢索詞，使用GeneCards、OMIM、TTD 和PharmGkb等疾病數(shù)據(jù)庫[14]檢索、合并、去重后，得到非小細(xì)胞肺癌疾病相關(guān)靶點。使用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）對上述靶基因名稱進(jìn)行確認(rèn)和校正。將枳椇屬三萜類活性成分作用靶點、非小細(xì)胞肺癌疾病相關(guān)靶點上傳至韋恩繪圖平臺（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到二者的交集靶點（共同靶點），作為枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點。

1.3 潛在作用靶點的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.2”項下的交集靶點在線導(dǎo)入STRING 平臺（https://string-db.org），設(shè)定物種為“homo sapiens”、 閾值≥0.900，獲取枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。將結(jié)果下載為“tsv”格式文件，并導(dǎo)入Cytoscape V3.8.2 軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 軟件中的CytoNCA 插件（V2.1.6）進(jìn)行核心靶點篩選。

1.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 使用R 4.0.3軟件中的“clusterProfiler”程序包對枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的核心靶點進(jìn)行GO 功能及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析包括生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular component，CC）。結(jié)果根據(jù)閾值P＜0.05 進(jìn)行篩選，對所得條目以氣泡圖進(jìn)行展示，分析枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用機制。將篩選出的活性成分、核心靶點以及KEGG 通路（前20 條）通過Excel 軟件建立相互作用關(guān)系，并使用Cytoscape V3.8.2 軟件構(gòu)建“活性成分-核心靶點-潛在通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌核心靶點的生物信息學(xué)預(yù)測 肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）及大細(xì)胞癌是非小細(xì)胞肺癌最常見的3 種病理類型，其中肺腺癌和肺鱗癌是非小細(xì)胞肺癌的主要亞型，約占70%[15]。因此利用Ualcan 數(shù)據(jù)庫（https://ualcan.path.uab.edu）獲得核心靶點在肺腺癌或肺鱗癌中的表達(dá)情況并進(jìn)行相關(guān)分析。對正常組織與肺腺癌或肺鱗癌組織的核心靶點表達(dá)差異分析采用獨立樣本t檢驗（以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。

通過Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫（https://kmplot.com/analysis/）進(jìn)行生存分析，在工具欄“mRNA”中選擇“Lung cancer”，選擇“Auto select best cutoff”作為診斷分界點的確定條件，分析核心靶點對非小細(xì)胞肺癌患者5 年生存率的影響。采用用log-rank 檢驗分析核心靶點的表達(dá)水平與肺癌患者生存之間的相關(guān)性（以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。

1.6 分子對接驗證 結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，在核心靶點中選取與非小細(xì)胞肺癌關(guān)聯(lián)性較高的4 個靶點作為受體，分別與潛在活性成分進(jìn)行分子對接驗證。從UniProt 數(shù)據(jù)庫中檢索靶點的3D 結(jié)構(gòu)，選擇已被驗證且物種為“Human”的靶點，并以PDB 格式保存；使用Pymol 軟件中的GetBox 插件獲得靶點的活性位點，并對蛋白進(jìn)行去水、去配體、加氫等處理；聯(lián)合使用AutoDock Vina 及R 軟件進(jìn)行分子對接結(jié)合能計算，得到結(jié)合能最低的分子構(gòu)型。

2 結(jié)果

2.1 枳椇屬三萜類活性成分 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫檢索共獲得42 個三萜類成分，通過Discovery Studio 軟件計算各化合物的“類藥性”參數(shù)，篩選出符合Lipinski “類藥五法則”的枳椇屬三萜類活性成分4 個，結(jié)果見表1。

表1 枳椇屬三萜類活性成分的類藥性參數(shù)Table 1 Drug-likeness parameters of active components of Hovenia triterpenoids

2.2 枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點 通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫共預(yù)測得到4 個枳椇屬三萜類活性成分的285 個作用靶點。通過GeneCards、OMIM、TTD 和PharmGkb 數(shù)據(jù)庫檢索、篩選、去重得到5 916 個非小細(xì)胞肺癌的疾病相關(guān)靶點。通過韋恩分析（見圖1），得到非小細(xì)胞肺癌的疾病相關(guān)靶點與枳椇屬三萜類活性成分作用靶點的共同靶點（交集靶點）186 個，即枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點。

圖1 枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點Figure 1 Potential therapeutic targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer

2.3 潛在作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò) 通過STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行186 個交集靶點的PPI 分析，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape（V3.8.2）軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用CytoNCA（V2.1.6）插件工具通過2 次篩選，共獲得核心靶點12 個，見圖2。核心靶點包括STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2、 MAPK3、 MAPK1、 AKT1、 JAK1、 JAK2、EGFR、MAPK14 和IL2，上述靶點可能在枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌中起到關(guān)鍵作用。

圖2 枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的核心靶點篩選流程Figure 2 Screening flow chart of core potential targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer

2.4 GO 功能及KEGG 信號通路富集分析 結(jié)果見圖3。枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點涉及1 161 個BP 條目，主要包括磷脂酰肌醇3-激酶信號（phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、蛋白激酶活性的激活（activation of protein kinase activity）和磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)（phosphatidylinositol-mediated signaling）等；39 個CC條目，主要包括局部粘連（focal adhesion）、細(xì)胞-基質(zhì)連接（cell-substrate junction）、質(zhì)膜筏（plasma membrane raft）等；72 個MF 條目，主要包括磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）和MAP 激酶活性（MAP kinase activity）等；前20 條KEGG 信號通路主要包括EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抗性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、癌癥中PD-L1 表達(dá)及PD-1 檢查點途徑（PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer）、JAK-STAT 信號通路（JAKSTAT signaling pathway）等。

圖3 枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 3 GO and KEGG pathway enrichment analysis of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer

將篩選出的活性成分、核心靶點以及KEGG 通路（前20 條）通過Cytoscape（V3.8.2）軟件構(gòu)建“活性成分-核心靶點-潛在通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖4。該網(wǎng)絡(luò)由35 個節(jié)點（包括4 個關(guān)鍵成分、11 個核心靶點、20 條通路）和186 條邊構(gòu)成?；衔顲eanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin 和Saponin H 的度值分別為2、3、5、9，STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2等多個靶點均與Saponin H 相連，提示其可能是治療非小細(xì)胞肺癌的關(guān)鍵枳椇屬三萜類成分。

圖4 枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的“活性成分-核心靶點-潛在通路”網(wǎng)絡(luò)Figure 4 “Active components-core targets-potential pathways”network diagram of Hovenia triterpenoids in the treatment of nonsmall cell lung cancer

2.5 核心靶點在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及對患者生存率的影響 通過Ualcan 在線工具分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中515 例肺腺癌組織與59 例正常組織、503 例肺鱗癌組織與52 例正常組織中STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 的表達(dá)情況，結(jié)果見圖5。與正常肺組織相比，SRC 的表達(dá)水平在肺腺癌和肺鱗癌中均明顯升高（P＜0.05），STAT3 及GRB2 的表達(dá)水平則明顯降低（P＜0.05）；而PIK3CA 在肺腺癌中的表達(dá)水平相較于正常肺組織明顯降低（P＜0.05），在肺鱗癌中的表達(dá)水平則明顯升高（P＜0.05）。

圖5 核心靶點在正常組織與肺腺癌/肺鱗癌中的表達(dá)情況比較Figure 5 The core targets expression in normal lung tissue compared with LUAD or LUSC tissue

采用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫評估核心靶點STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 對肺癌患者5 年生存率的影響，生存分析結(jié)果見圖6。結(jié)果提示，SRC［HR=1.47（1.21-1.79），P＜0.05］低表達(dá)、PIK3CA［HR=0.86（0.75-0.99），P＜0.05］及GRB2［HR=0.51（0.43-0.61），P＜0.05］高表達(dá)的肺癌患者5 年生存率更高。

圖6 核心靶點對肺癌患者5 年生存率的影響Figure 6 Effect of core targets expression on the 5-year overall survival of lung cancer patients

2.6 分子對接結(jié)果 結(jié)果見表2。將4 個活性成分與核心靶點STAT3、SRC、PIK3CA 和GRB2 分別進(jìn)行分子對接，預(yù)測其結(jié)合能力。一般來說，結(jié)合能低于-4.25 kcal·mol-1表明小分子對蛋白質(zhì)具有特異性結(jié)合活性，低于-5.0 kcal·mol-1表明結(jié)合活性較好，低于-7.0 kcal·mol-1說明有強結(jié)合活性[16]。結(jié)果顯示，4 個活性成分與4 個度值最高的核心靶點結(jié)合能均小于-4.25 kcal·mol-1，表明結(jié)合能力良好，其中Jujubogenin、Saponin H 與PIK3CA 的結(jié)合能最低（-8.7 kcal·mol-1），存在極強結(jié)合能力。

表2 枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of active components-core targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer

3 討論

本研究以多個數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)篩選出Ceanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin 和Saponin H 等化合物，可能是枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的活性物質(zhì)。其中， Ceanothetric acid 具有抗微生物活性[17]；Jujubogenin（酸棗仁皂苷元）是酸棗仁皂苷A、B、B1的皂苷元[18]。研究[19]表明，酸棗仁皂苷A 可以通過激活Fat4-HIPPO-YAP 通路，誘導(dǎo)A549 細(xì)胞衰老和凋亡，并且能抑制肺癌細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮治療非小細(xì)胞肺癌的作用。

通過對潛在作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行2 次篩選，獲得STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 等12 個核心靶點。STAT3 是一種促進(jìn)細(xì)胞增殖與存活的原癌蛋白，可被不同細(xì)胞因子激活[20]。正常組織中STAT3為非活化狀態(tài)，而在腫瘤細(xì)胞中被異常激活而過度表達(dá)[21]，活化的STAT3 會影響細(xì)胞的增殖、存活、凋亡和血管生成等生理病理過程[22]。研究[23]表明，槐花-金銀花配伍能通過抑制STAT3 信號通路，進(jìn)而抑制免疫抑制細(xì)胞因子的激活，增強免疫反應(yīng)，顯著抑制黑色素瘤小鼠的腫瘤生長。SRC 是第一個被發(fā)現(xiàn)的原癌基因，在許多細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)[24]，抑制SRC 可以下調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中MMP-2/9 的表達(dá)[25]，而MMP-2/9 的過度表達(dá)與肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[26]。PIK3CA 在非小細(xì)胞肺癌患者中的突變率為14.1%，且PIK3CA 突變可激活腫瘤細(xì)胞中的Akt 信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移[27]。GRB2 是酪氨酸激酶受體信號通路中的重要樞紐蛋白，可介導(dǎo)多條信號通路的激活，干擾細(xì)胞中GRB2的表達(dá)能顯著抑制A549 細(xì)胞的增殖[28]，且GRB2 還可通過激活A(yù)kt 信號通路和上調(diào)MMP-2/9 的活性來促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的遷移[29]。

KEGG 通路分析結(jié)果顯示，枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點主要涉及EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、癌癥中PD-L1 表達(dá)及PD-1檢查點途徑、JAK-STAT 信號通路等相關(guān)通路。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）廣泛應(yīng)用于含有EGFR 激活突變的非小細(xì)胞肺癌患者的治療，但是大多數(shù)患者易產(chǎn)生耐藥性[30]，因而調(diào)控EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路，有利于非小細(xì)胞肺癌患者的治療。JAK-STAT 是EGFR-TKIs 作用后觸發(fā)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其通過刺激有絲分裂導(dǎo)致細(xì)胞增殖和抑制凋亡[31]。PD-1/PD-L1是一種重要的免疫抑制分子，以PD-1/PD-L1 抑制劑為代表的免疫檢查點抑制劑（ICIs）的應(yīng)用能夠有效延長肺癌患者的生存期，相較于化療患者，經(jīng)ICIs治療的非小細(xì)胞肺癌晚期患者的5 年生存率提高5 倍以上[32]。

綜上所述，枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用機制可能是通過Ceanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin、Saponin H 4 種關(guān)鍵活性成分，作用于STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 等核心靶點，通過EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、癌癥中PD-L1 表達(dá)及PD-1 檢查點途徑，以及JAK-STAT信號通路等抵抗EGFR-TIKs 耐藥性及調(diào)節(jié)免疫功能的相關(guān)信號通路實現(xiàn)的。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的計算推測，相關(guān)結(jié)果仍需進(jìn)一步的生物學(xué)驗證。本研究初步探討了枳椇屬三萜類成分治療非小細(xì)胞肺癌的分子機制，可為其臨床應(yīng)用及非小細(xì)胞肺癌的新藥研發(fā)提供參考。