于海玲，胡宇磊，熊顯榮，楊璐瑜，張 賀

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，四川 成都 610041；3.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041)

隨著我國人民生活質(zhì)量的提高，人們對牛奶的需求也逐漸升高.牦牛奶作為高原農(nóng)牧民重要的生活原材料，農(nóng)牧民對奶品質(zhì)的要求也逐漸增加. 阿壩藏族羌族自治州是我國重要的高原牧區(qū)之一，本地區(qū)以及周圍相鄰地區(qū)的牦牛存欄量占全國牦牛存欄量三分之一，但本地區(qū)仍然存在畜群結(jié)構(gòu)不合理、畜種生產(chǎn)性能低等問題[1].為了提高生產(chǎn)性能，育種人員使用具有優(yōu)良性狀的平原牛與牦牛進行雜交，繁育出雜種一代的犏牛.研究表明，犏牛相對于牦牛具有明顯的雜種優(yōu)勢[2]，其泌乳性能顯著高于牦牛. 因此高產(chǎn)犏牛選育成為高原牧區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵.

乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)是長鏈脂肪酸合成所需酶之一.ACC 催化乙酰輔酶A(CoA)羧化生成丙二酰輔酶A[3]，然后利用多功能酶-脂肪酸合成酶，將Malonyl-CoA 用于長鏈脂肪酸的合成，這涉及到棕櫚酸合成的七種不同的酶反應(yīng).在此反應(yīng)中起到主要催化作用的是乙酰輔酶A 羧化酶. 該酶由位于牛第19號染色體上的ACACA基因負責編碼，在脂肪酸代謝過程中起至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[4]，其轉(zhuǎn)錄由四個啟動子PI、PIA、PII 和PIII 調(diào)控[5]. 啟動子PI(人)和PIA(嚙齒動物和反芻動物)負責神經(jīng)系統(tǒng)和白色脂肪組織中的基因表達. 作為管家基因，啟動子PII(哺乳動物)可在所有組織中被轉(zhuǎn)錄[6]. 啟動子PIII 的轉(zhuǎn)錄在人類和反芻動物中檢測到，它負責哺乳期間乳腺中的基因表達[7].Moioli B 等人研究發(fā)現(xiàn)ACACA基因是影響綿羊奶中脂肪含量的潛在候選基因[8]，F(xiàn)ederica Signorelli 通過對ACACA基因啟動子III 片段進行測序分析后發(fā)現(xiàn)了3 個SNPs 與山羊奶的脂肪含量有關(guān)[9]，Hirokazu 等人在日本黑牛和荷斯坦牛ACACA基因的研究中也通過序列比對分析證明了ACACA基因多態(tài)性會影響牛奶和牛肉中脂肪酸的組成[10]. 目前國內(nèi)對ACACA基因多態(tài)性與產(chǎn)奶性能的關(guān)系已在荷斯坦奶牛和羊上有了前期的研究，但在犏牛上還未見相關(guān)報道.脂酰輔酶A 去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶之一(endoplasmic reticulum，ER)，對通過本身合成或從飲食中提取的飽和脂肪酸生物合成單不飽和脂肪酸(MUFAs)發(fā)生催化，該酶由位于牛26 號染色體上的SCD基因編碼，顯示為SCD1亞型.SCD基因負責在碳鏈的第9 個和第10 個碳原子之間添加雙鍵[11]，大量證據(jù)表明其與奶牛乳脂和乳脂中脂肪酸的合成密切相關(guān)[12-14].因此，推測SCD基因可能在犏牛乳脂合成中起一定作用，可作為犏牛的泌乳性狀候選基因.

目前已有對牦?；騍NPs 的部分研究[15-17]，但是犏?；蚨鄳B(tài)性的研究還鮮有報道. 鑒于此，本研究對ACACA基因和SCD1 基因上的2 個顯著SNPs 位點在犏牛群體中進行驗證，使用PCR 結(jié)合DNA 測序技術(shù)對g.1488 C ＞G 和g.239 A ＞T 位點進行基因型分析與檢測，研究其基因多態(tài)性及其與犏牛產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)性，為進一步開展高產(chǎn)犏牛培育工作提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究樣本采集及數(shù)據(jù)收集于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣. 試驗選取了月齡相近，胎次均為2 胎，且均為產(chǎn)犢后三個月左右的母犏牛，共計384頭，試驗牛飼養(yǎng)環(huán)境相同，營養(yǎng)水平和管理方式一致.取樣及數(shù)據(jù)收集時間為2020 年5 ～10 月. 每隔10 d早晚共測定兩次樣本牛產(chǎn)奶量并進行記錄，每個樣本取25 mL 奶樣，寄送至新希望有限公司洪雅陽平分公司，使用乳成分分析儀對各個樣本的乳成分理化指標(DHI)進行分析.在測定產(chǎn)奶量的同時采用頸部靜脈采血10 mL，使用抗凝采血管，將其放入4 ℃冰盒內(nèi)，從紅原帶回實驗室后轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱凍存.

1.2 DNA 提取與檢測

使用購自南京諾維贊生物科技股份有限公司的DNA 提取試劑盒(DC111)提取犏?；蚪MDNA，將提取后的DNA 樣品放入-20 ℃?zhèn)溆? 制備2%的瓊脂糖凝膠，按照5 μL DNA 樣品、1 μL 的6 ×Loading Buffer 緩沖液的比例充分混勻，吸取混合液加入到瓊脂糖凝膠點樣孔中. 設(shè)置電壓為100 V、電泳時間為40 min，電泳完成后將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶.

1.3 引物設(shè)計及PCR 擴增

根據(jù)GenBank 上公布的牦牛ACACA、SCD1 基因序列(GenBank no.NW_005392972.1、GenBank no.NC_037353.1)，使用primer5.0 軟件設(shè)計引物見表1，并由上海生工生物工程股份有限公司合成.

表1 引物序列信息Table 1 Sequence information of primers

PCR 反應(yīng)體系25 μL:2 × Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，基因組DNA 2.0 μL；ddH2O 8.5 μL.PCR 擴增程序:95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s；退火溫度分別為59 ℃和55 ℃；72 ℃延伸15 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，置于4 ℃保存. 擴增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)檢測特異性.

1.4 候選基因的多態(tài)性位點檢測

通過直接測序法對SNP 位點進行檢測與基因分型，對PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，條帶清晰，交由上海生工生物工程公司進行DNA 單向測序. 使用Chromas 軟件對測序峰值圖進行分析，對基因型進行判定，計數(shù)統(tǒng)計，用于后續(xù)的試驗分析.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2019 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計整理，通過不同基因型頻率和等位基因頻率計算多態(tài)信息含量(PIC)，公式如下:

其中，Pi和Pj分別為第i 與第j 個等位基因在群體中的頻率，n為等位基因數(shù).通過SPSS 19.0 軟件的一般模型分析基因型對犏牛產(chǎn)奶性狀的影響，公式:

其中，Yij為產(chǎn)奶量或乳成分的實際測量值；μ為群體內(nèi)某一性狀均值；Gi為總體效應(yīng)；Pi為胎次效應(yīng)；e為隨機殘差效應(yīng). 數(shù)值以“平均數(shù)±標準差”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 檢測

采用核酸濃度檢測儀對提取的犏牛血液基因組DNA 進行純度檢測，濃度均在100 ng/μL 以上，DNA的OD 值均在1.8 ～1.9 之間，證明DNA 樣品純度合格.使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，表示DNA 沒有被降解或者含有蛋白質(zhì)污染，符合試驗要求(圖1).

圖1 DNA 完整性電泳檢測Fig.1 DNA integrity detection by electrophoresis M:DL2000 DNA marker 條帶 M:DL2000 DNA marker

2.2 PCR 擴增產(chǎn)物檢測

通過設(shè)置溫度梯度優(yōu)化了ACACA與SCD1 引物的最適退火溫度，分別為55 ℃和59 ℃.分別對ACACA和SCD1 在最適退火溫度條件下進行PCR 產(chǎn)物擴增.可以得到清晰且單一的目的條帶，特異性較好，產(chǎn)物長度分別為345 bp 和465 bp 左右，可用于后續(xù)的測序分析(圖2).

圖2 候選基因的PCR 產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 PCR product electrophorogram M:DL2000 DNA marker 條帶 M:DL2000 DNA marker

2.3 SNPs 的篩選及分型

通過測序?qū)Ρ燃胺治霭l(fā)現(xiàn)在ACACA擴增片段的第137 bp 處即ACACA基因的5'UTR 調(diào)控區(qū)域1488 bp處發(fā)生了C/G 堿基替換(圖3)，顯示有兩個等位基因(C 和G)，三種基因型(CC、GC、GG). 將該位點命名為g.1488C ＞G.

圖3 ACACA 基因g.1488 C ＞G 多態(tài)性序列Fig.3 Sequence of g.1488 C ＞G polymorphism of ACACA gene

通過對比分析發(fā)現(xiàn)，位于SCD1 擴增片段的239 bp 處發(fā)現(xiàn)一個SNP 位點，即位于SCD1 基因的第5 外顯子區(qū)域內(nèi)發(fā)生了A/T 堿基突變(圖4)，導致239 位點編碼的氨基酸由丙氨酸(Ala)突變?yōu)槔i氨酸(Val).SCD1 檢測的基因區(qū)域內(nèi)有兩個等位基因(A 和T)，三種基因型(AA、AT、TT)，將該位點命名為g.239 A＞T.

圖4 SCD1 基因g.239 A ＞T 多態(tài)性序列Fig.4 Sequence of g.239 A ＞T polymorphism of SCD 1 gene

2.4 遺傳多樣性指標分析

根據(jù)SNP 結(jié)果對ACACA基因g.1488C ＞G 位點和SCD1 基因g.239A ＞T 位點進行遺傳多態(tài)性參數(shù)的統(tǒng)計與分析，結(jié)果見表2.2 個SNPs 在犏牛群體中均存在三種基因型，且均處于Hardy -Weinberg 平衡(P＞0.05). g.1488C ＞G 的優(yōu)勢基因型為CC 基因型，g.239A ＞T 的優(yōu)勢基因型為AA 基因型. 從多態(tài)信息含量上看，g.1488C ＞G 和g.239A ＞T 的PIC分別為0.35 和0.36，均在0.25 ～0.5 的范圍內(nèi)，均為中度多態(tài).表明SNP 位點遺傳變異較高，遺傳潛力較強.

2.5 SNP 位點與泌乳性能的關(guān)聯(lián)分析

將犏牛的泌乳性能(日產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率)與ACACA基因突變位點的基因型進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表3. 位于g.1488C ＞G 位點上的3 個基因型的乳脂率有顯著差異(P＜0.05)，GG 型的乳蛋白率顯著低于CC 型和CG 型(P＜0.05).其中CG 基因型的乳脂率和乳蛋白率最高.但三個基因型間的日產(chǎn)奶量無顯著差異(P＞0.05).

表3 ACACA SNP 位點與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 3 The LSM and SE of lactation traits between the ACACA SNP genotypes

將犏牛的泌乳性能與SCD1 基因突變位點上的基因型進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表4.在g.239 A ＞T 位點上TA 基因型的乳脂率顯著高于其他基因型(P＜0.05)，但日產(chǎn)奶量和乳蛋白率無顯著差異(P＞0.05).

表4 SCD1SNP 位點與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 4 The LSM and SE of lactation traits between the SCD1 SNP genotypes

3 討論

在對遺傳多態(tài)性分析過程中，人們通常把等位基因數(shù)、基因型頻率、遺傳雜合度、純合度以及多態(tài)信息含量作為衡量某個群體遺傳變異程度大小的標準，即以上指標數(shù)值越大，遺傳變異的程度就越高，選擇潛力就越強[18].前人的研究主要集中在5'UTR 以及編碼區(qū)[19-20].本研究發(fā)現(xiàn)，犏牛ACACA基因在5'UTR 區(qū)域存在一個SNPs 位點，在SCD1 基因的第5 外顯子內(nèi)存在一個突變位點.這兩個位點的多態(tài)信息含量均為0.25 ＜PIC＜0. 5 具有中度多態(tài)信息性，且都處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，這說明犏牛群體在這兩個位點的基因多態(tài)性相對較高，遺傳突變的程度相對較大，可以獲取更多的遺傳研究進展. 因此可以利用這兩個位點所表現(xiàn)的多態(tài)性在犏牛群體中進行篩選.在使用傳統(tǒng)育種方法來對這些優(yōu)良性狀選育時，技術(shù)周期長且工作量大，同時很難擺脫環(huán)境因素影響. 近年來隨著分子遺傳飛速發(fā)展，使得育種人員可以直接從分子方面直接研究基因?qū)π誀畹挠绊慬21-22].

目前對ACACA基因多態(tài)性與泌乳性能的研究，已經(jīng)揭示了乳脂率和乳蛋白率在ACACA基因作用下存在一定的顯著差異. 因此ACACA基因?qū)θ橹示哂幸欢ǖ挠绊?，但ACACA基因多態(tài)性對乳蛋白率的影響的作用機理還需進一步研究. 本試驗在犏牛ACACA基因的5'UTR 調(diào)控區(qū)域處檢測到1 個SNP 位點即(g.1488C ＞G)，通過分析該位點與泌乳性能的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明CC、CG、GG 3 種基因型之間在乳脂率以及乳蛋白率上有顯著差異.其中CG 基因型乳脂率要明顯優(yōu)于CC 基因型和GG 基因型，GG 基因型的乳蛋白率顯著高于CC 基因型和CG 基因型. 通過關(guān)聯(lián)性分析該基因位點與犏牛的泌乳性能密切相關(guān).本試驗結(jié)果與Artegoitia 等結(jié)果一致，均顯示在乳脂率上CG 基因型要明顯優(yōu)于其他基因型，但在乳蛋白率上Artegoitia 的研究結(jié)果表明三種基因型并沒有存在顯著差異，與本試驗存在一定分歧[23].K?sek 對ACACA基因多態(tài)性的研究表明，g.1488C ＞G 位點對奶牛產(chǎn)奶量有影響[24]，然而，在本試驗中顯示該位點與犏牛產(chǎn)奶量無顯著相關(guān)性.本試驗與上述兩個研究中部分結(jié)果不吻合，可能是由于試驗牛群的差異所致.

SCD1 基因已被證明與脂肪的合成有關(guān)[25-26].李澤等人發(fā)現(xiàn)SCD1 基因的過表達顯著增加了與脂肪酸和三酰甘油合成的相關(guān)基因的表達，導致水牛乳腺上皮細胞中脂肪酸和不飽和脂肪酸含量增加[27]. 本試驗在犏牛的SCD1 基因上檢測到1 個SNP 位點g.239A ＞T，g.239A ＞T 位點上的TA 基因型在乳脂率方面明顯優(yōu)于其他兩個基因型(P＜0. 05)，這與K?sek 研究結(jié)果一致[24]. g. 239A ＞T 位于外顯子區(qū)域，在此位點發(fā)生了錯譯突變，原來編碼的氨基酸由丙氨酸替換為纈氨酸，氨基酸的改變可能導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，因此導致該位點不同基因型在乳脂率上出現(xiàn)一定的顯著差異.目前SCD1 基因在犏牛上的研究鮮有報道，因此該基因可作為犏牛產(chǎn)奶性狀的候選基因.

4 結(jié)論

本研究篩選了犏牛ACACA基因和SCD1 基因的SNPs 位點，分析發(fā)現(xiàn)ACACA基因g.1488C ＞G 位點的CG 基因型和SCD1 基因上g.239A ＞T 位點的TA基因型與乳脂率關(guān)聯(lián)性較高，ACACA基因g.1488C ＞G 位點的GG 基因型在乳蛋白率上存在關(guān)聯(lián)性.因此ACACA基因與SCD1 基因可作為后續(xù)犏牛產(chǎn)奶性狀輔助選擇的候選分子標記.