王 甜，黃顯朋，朱洪陽，吉文匯，2，付 偉，2，殷 實，2，蘭道亮，2

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041)

G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)，也稱為7 次跨越蛋白(7TM)，是最豐富的細(xì)胞膜受體之一，具有約800 個成員.GPCR 不僅能與同聚體互作，也能與異聚體相互作用[1]，介導(dǎo)了機體內(nèi)80%的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo).迄今為止，大約100 個GPCRs 未鑒定出其內(nèi)源配體，被稱為孤兒GPCR.G 蛋白偶聯(lián)受體50(GPR50)作為一種孤兒GPCR，被證明與褪黑素(melatonin，MT)受體MT1和MT2具有高度同源性[2]，因此也被稱為褪黑素相關(guān)受體.雖然不與褪黑素結(jié)合，但GPR50 可與MT1及MT2形成異二聚體，并通過影響MT1介導(dǎo)的相關(guān)信號通路而發(fā)揮作用[3].GPR50 受體具有七個疏水段和一個親水性羧基尾，其顯著特征是氨基末端和額外的細(xì)胞環(huán)中沒有N-連接的糖基化共有位點，同時具有一個含有三個多態(tài)性位點的C 端長鏈.GPR50 被證實在小鼠和兔等動物的多個器官和組織中表達(dá)，尤其在腦和生殖器官中表達(dá)量較高[4].GPR50 參與糖皮質(zhì)激素受體(GR)信號通路、瘦素(leptin)信號通路、NOGO-A 及RhoA/ROCK 信號通路等多條通路，其生理功能受到廣泛關(guān)注.據(jù)報道，GPR50 與雙相情感障礙、脂質(zhì)代謝、產(chǎn)熱、脂肪生成和神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)[5]，也被認(rèn)為是抑郁癥等精神疾病治療的重要靶點[6].在最新的研究中，Y.Chen[7]等人發(fā)現(xiàn)GPR50 具有促進(jìn)牦牛卵母細(xì)胞成熟的潛在作用，但GPR50 是否在哺乳動物卵母細(xì)胞成熟發(fā)揮作用還有待證明.

哺乳動物卵母細(xì)胞的成熟涉及多個細(xì)胞事件，包括生發(fā)泡破裂(GVBD)、染色體凝聚、紡錘體的形成和遷移[8].據(jù)報道，參與卵母細(xì)胞成熟的分子通路主要有Ca2＋信號通路[9]、MAPK 信號通路[10]、Sirt1 -Nrf2 -Cyclin B1 信號通路[11]、SUMO 通路[12]等，解析哺乳動物卵母細(xì)胞成熟的分子機制成為近年來研究的熱點.為研究GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過程中的分子機制，利用qPCR 及免疫熒光技術(shù)研究GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育過程中的動態(tài)表達(dá)規(guī)律及亞細(xì)胞定位，為研究GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞體外成熟中的作用奠定基礎(chǔ)，同時也為豐富哺乳動物卵母細(xì)胞成熟的分子機制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用小鼠(Mus musculus)均為6 ～8 周齡無特定病原體(SPF)級別的ICR 小鼠，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司.所用牦牛卵巢由成都青白江屠宰場提供，兔卵巢和雞卵巢由西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院蘭道亮課題組提供.

1.2 方法

1.2.1 小鼠卵母細(xì)胞的收集與培養(yǎng)

經(jīng)腹腔注射10 IU 孕馬血清促性腺激素(PMSG)44 ～48 h 后，用脫臼法處死小鼠并取卵巢置于37 ℃預(yù)熱的、含1%青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)中.在體式顯微鏡下用1 mL 注射器扎破卵泡，使小鼠卵巢內(nèi)容物流出.收集生發(fā)泡(GV)時期卵母細(xì)胞，將其置于預(yù)熱2 h 的成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng).成熟培養(yǎng)液用培養(yǎng)用油覆蓋，其配方為:M2 培養(yǎng)液、10 IU/mL 促卵泡激 素(FSH)、 10 IU/mL 黃 體 生 成 素(LH)、20 μg/mL雌二醇(E2)、10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗.分別在培養(yǎng)0、4、8、14 h 收集GV、GVBD、第一次減數(shù)分裂(MI)及第二次減數(shù)分裂(MII)期卵母細(xì)胞.裸卵清洗后直接用于后續(xù)實驗或保存至-80 ℃，卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物置于0.2%的透明質(zhì)酸酶中于37 ℃消化3 ～5 min，除去顆粒細(xì)胞后用于后續(xù)實驗或保存至-80 ℃.

1.2.2 引物的設(shè)計和合成

在GenBank 下載小鼠(Mus musculus)的GPR50(NM_010340.2)、GAPDH(NM_008084.3)基因序列，用Primer Premier 5 設(shè)計引物，引物序列如表1 所示.6對引物均由上海生工生物工程有限公司合成.

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.3 總RNA 的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR

使用Omega E. Z. N. A ? MicroElute Total RNA Kit 提取各時期小鼠卵母細(xì)胞的總RNA，再利用Exon-Script RT SuperMix with dsDNase 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為Total RNA 13 μL、5 ×Reaction Mix*4 4 μL、Supreme Enzyme Mix 3 μL，反應(yīng)程序為25 ℃10 min，55 ℃15 min，85 ℃5 min.普通PCR 體系為2×Taq Advanced PCR Master Mix 12.5 μL、Forward Primer 0.5 μL、Reverse Primer 0.5 μL、ddH2O 9.5 μL、cDNA 2 uL，反應(yīng)程序為94 ℃3 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s、70 ℃30 s/kb (25 ～35 cycles)，70 ℃5 min.

1.2.4 qPCR 體系的建立及優(yōu)化

qPCR 的初始反應(yīng)體系為2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG 10 μL、10 μM Forward Primer 0.4 μL、10 μM Reverse Primer 0.4 μL、cDNA 2 μL、PCR-grade Water 7.2μL，反應(yīng)程序為50 ℃2 min、94 ℃10 min、95 ℃3 min、95 ℃5 s、60 ℃30 s(40 cycles).用不同的引物進(jìn)行普通PCR，選出最佳的引物；以最佳引物為基礎(chǔ)，在不同引物濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μM)進(jìn)行qPCR，找到最佳的引物濃度，以此優(yōu)化所建立的qPCR 反應(yīng)體系和程序.

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以小鼠GV 期卵母細(xì)胞的cDNA 為模板，將其以10 倍比稀釋并用100～10-45 個濃度以1.2.4 得到的方法進(jìn)行qPCR. 記錄各個濃度的Ct 值，以cDNA 濃度為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析模板濃度與Ct 值的線性關(guān)系.

1.2.6 敏感性的測定

以GV 期卵母細(xì)胞的cDNA 為模板，將100～10-56 個濃度的cDNA 分別進(jìn)行qPCR 和普通PCR. 比較兩種方法的最低檢測稀釋度，以評估所建立方法的敏感性.

1.2.7 特異性的測定

分別提取GV 期小鼠、牦牛、雞及兔卵母細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR 檢測各樣本的GPR50 表達(dá)情況，以評估該方法的特異性.

1.2.8 重復(fù)性的測定

以3 組GV 期小鼠卵母細(xì)胞的cDNA 為模板進(jìn)行qPCR，分別進(jìn)行3 次組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)，記錄樣品對應(yīng)的Ct 值.組內(nèi)重復(fù)性是指各個樣品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，組間重復(fù)是指3 個樣品間的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù). 通過對組內(nèi)重復(fù)性和組間重復(fù)性的分析，評估該方法的重復(fù)性.

1.2.9 qPCR 檢測GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞的動態(tài)表達(dá)

利用1.2.3 的方法提取小鼠各時期卵母細(xì)胞的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用優(yōu)化后的qPCR方法，測定GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂4 個階段的動態(tài)表達(dá).

1.2.10 GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞的免疫熒光染色

將各時期卵母細(xì)胞置于固定液中固定30 min，清洗3 次后在透膜液中透膜20 min；用含1%牛血清蛋白(BSA)的PBS 中清洗3 次后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至封閉液中封閉15 min；清洗后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至GPR50 Polyclonal antibody(1∶250)中，4 ℃孵育過夜；洗滌卵母細(xì)胞3 次，將其轉(zhuǎn)移至CoraLite488 - conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H ＋L)(1∶500)中，在室溫下孵育1 h.清洗卵母細(xì)胞，并將其置于DAPI 溶液中染核；2 min 后清洗卵母細(xì)胞，并用抗熒光淬滅劑封片，整個過程在避光條件下進(jìn)行.

1.2.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

使用Excel 2016 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸分析和平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分析，使用Light Cycler 96軟件和2-ΔΔCt法進(jìn)行qPCR 數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism 9 進(jìn)行單因素方差分析. 所有試驗均進(jìn)行3 次重復(fù)以保證數(shù)據(jù)的可靠性.

2 結(jié)果

2.1 小鼠卵母細(xì)胞的收集和培養(yǎng)

在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)0、4、8、14 h，分別得到GV、GVBD、MI 及MII 時期卵母細(xì)胞(圖1).

圖1 不同時期的小鼠卵母細(xì)胞(200 ×)Fig.1 Mouse oocytes at different stages(200 ×)

2.2 qPCR 體系的建立及優(yōu)化

2.2.1 最優(yōu)引物的篩選

用不同的引物進(jìn)行普通PCR，得到6 個不同的條帶(圖2).由圖2 可知，各條帶的長度與引物對應(yīng)的擴增長度一致，表明成功擴增出目的基因和管家基因.另外，不同條帶的亮度表明GAPDH 和GPR50 最優(yōu)引物均為第2 對.

圖2 各引物PCR 結(jié)果Fig.2 PCR with each primer

2.2.2 qPCR 最優(yōu)濃度的篩選

以GV 期小鼠卵母細(xì)胞cDNA 為模板，在0.1、0.2、0. 3、0. 4、0. 5 μM 五個濃度下進(jìn)行qPCR. 其中，GPR50 和GAPDH 引物終濃度為0.3 μM 時Ct 值最小(表2)，且擴增曲線出峰最早、信號最強(圖3、圖4)，因此將0.3 μM 作為所建立熒光定量PCR 方法最佳的引物終濃度.

圖3 GPR50 在不同引物終濃度條件下的擴增曲線Fig.3 Amplification curves of GPR50 using different primer concentrations

圖4 GAPDH 在不同引物終濃度條件下的擴增曲線Fig.4 Amplification curves of GAPDH using different primer concentrations

表2 不同PCR 引物終濃度的Ct 值Table2 Ct values of different PCR primer concentrations

經(jīng)優(yōu)化后的qPCR 體系為20 μL，其中2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG 10 μL、10 μM Forward Primer 0.6 μL、10 μM Reverse Primer 0. 6 μL、cDNA 2 μL、PCR - grade Water 6.8 μL，反應(yīng)程序為50 ℃2 min、94 ℃10 min、95 ℃3 min、95 ℃5 s、60 ℃30 s(45 cycles).

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將5 個稀釋度的GV 期卵母細(xì)胞cDNA 模板進(jìn)行qPCR，得到的擴增曲線和溶解曲線如圖(圖5).生成的溶解曲線單一，溶解溫度均為88 ℃～89 ℃. 以模板濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y＝-0.856x＋28.374，其相關(guān)系數(shù)r2＝0.988，截距為28.374(圖6)，說明模板濃度和Ct 值具有良好的線性關(guān)系，該方法符合預(yù)期.

圖5 溶解曲線和擴增曲線Fig.5 Melting and amplification curves

圖6 qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve for qPCR

2.4 敏感性的測定

將6 個濃度稀釋度的GV 期卵母細(xì)胞cDNA 分別進(jìn)行qPCR 和普通PCR，發(fā)現(xiàn)qPCR 的最大檢測稀釋度為10-4(圖7)，而普通PCR 的最大檢測稀釋度為100(圖8)，表明所建立qPCR 方法的敏感性優(yōu)于普通PCR 敏感性.

圖7 溶解曲線和擴增曲線Fig.7 Melting and amplification curves

圖8 普通PCR 靈敏度的測定Fig.8 General PCR sensitivity determination

2.5 特異性的測定

將兔卵母細(xì)胞、雞卵母細(xì)胞、牦牛卵母細(xì)胞及小鼠卵母細(xì)胞的cDNA 以最優(yōu)濃度的引物進(jìn)行qPCR，發(fā)現(xiàn)只有小鼠卵母細(xì)胞的cDNA 有熒光信號(圖9)，除小鼠卵母細(xì)胞以外的模板還出現(xiàn)非特異性擴增(圖10)，證明所建立的方法特異性良好.

圖9 不同模板qPCR 的擴增曲線Fig.9 Amplification curves of qPCR with different templates

圖10 不同模板qPCR 的溶解曲線Fig.10 Melting curves of qPCR with different templates

2.6 重復(fù)性的測定

選擇3 個不同的GV 期卵母細(xì)胞cDNA 進(jìn)行3 次組間和組內(nèi)重復(fù)性實驗，發(fā)現(xiàn)擴增曲線和溶解曲線重合度較高(圖11)，同時該qPCR 方法組內(nèi)變異系數(shù)在0.69% ～0.82%，組間變異系數(shù)在0.10% ～0.40%(表3)，均小于1%，證明所建立的qPCR 方法重復(fù)性良好.

圖11 擴增曲線和溶解曲線Fig.11 Amplification and melting curves

表3 重復(fù)性的測定Table 3 Repeatability determination

2.7 GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞成熟過程中的動態(tài)表達(dá)

利用qPCR 技術(shù)檢測GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞中表達(dá)情況的結(jié)果表明，GPR50 在不同時期卵母細(xì)胞中均有表達(dá). 生發(fā)泡破裂后，GPR50 表達(dá)顯著增多，GVBD 期的表達(dá)量顯著高于GV 期(P＜0. 05)；而GVBD 期發(fā)生后，GPR50 的表達(dá)量緩慢升高；卵母細(xì)胞減數(shù)分裂到達(dá)MI 后，GPR50 的表達(dá)量極顯著升高，在MII 期表達(dá)量最高，顯著高于GV、GVBD 及MI 期(P＜0.01)的表達(dá)量(圖12).

圖12 GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育過程中的動態(tài)表達(dá)Fig.12 Dynamic expression of GPR50 during mouse oocyte development

2.8 GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞成熟過程中的亞細(xì)胞定位

免疫熒光結(jié)果表明，GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)，且隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，表達(dá)量不斷升高，到MII 期表達(dá)量最高(圖13)，與qPCR 結(jié)果保持一致.在MII 期時，GPR50 大量分布在細(xì)胞膜.

圖13 GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞GV(0 h)、GVBD(4 h)、MI(8 h)及MII(14 h)期的亞細(xì)胞定位Fig.13 Subcellular localization of GPR50 in mouse oocytes at GV (0 h)，GVBD (4 h)，MI (8 h) and MII (14 h) stages

3 討論

由于RNA 易降解、小鼠卵母細(xì)胞RNA 含量低及樣品收集困難等原因，利用qPCR 技術(shù)在卵母細(xì)胞或胚胎中進(jìn)行基因表達(dá)檢測具有一定困難.針對小鼠卵母細(xì)胞、胚胎等微量樣品的基因表達(dá)測定，建立一種高效、穩(wěn)定且靈敏度高的qPCR 體系尤為重要. 引物的設(shè)計是影響qPCR 質(zhì)量的最關(guān)鍵因素之一，準(zhǔn)確可靠的定量取決于使用有效的引物[13]. 本研究針對GPR50 和管家基因設(shè)計了多條引物，為qPCR 準(zhǔn)確性奠定了基礎(chǔ).同時，對于微量mRNA 的定量，最優(yōu)的敏感性和重復(fù)性分析是建立在最優(yōu)引物濃度的基礎(chǔ)上.本研究以Ct 值最低和熒光信號最強為標(biāo)準(zhǔn)，篩選的最優(yōu)引物終濃度為0. 3 μM，其選擇標(biāo)準(zhǔn)與M. R.Green[14]等人一致. 根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，本研究模板濃度和Ct 值具有良好的線性關(guān)系. 本研究建立的qPCR 方法敏感性優(yōu)于普通PCR 的敏感性，符合之前的研究結(jié)果[15-17].在對特異性的結(jié)果進(jìn)行評估時，發(fā)現(xiàn)將兔卵母細(xì)胞、雞卵母細(xì)胞及牦牛卵母細(xì)胞進(jìn)行qPCR 時均無法產(chǎn)生信號，證明該qPCR 方法特異性良好.而對重復(fù)性進(jìn)行評估時，組間變異系數(shù)和組內(nèi)變異系數(shù)均小于1%，證明所建立的qPCR 方法重復(fù)性較高，可用于后續(xù)試驗.

據(jù)報道，GPR50 在哺乳動物各組織中廣泛表達(dá)，尤其在腦組織、生殖器官及胎盤中表達(dá)量最高[18].Grünewald E[19]等人發(fā)現(xiàn)，GPR50 在小鼠胚胎第13 d(E13)開始表達(dá)，到第18 d(E18)達(dá)到峰值.而在胚胎第13 d(E13)時，原始生殖細(xì)胞正處于增殖階段，隨后形成卵原細(xì)胞，之后形成原始卵泡[20].因此，GPR50在卵泡的發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的作用.顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞可進(jìn)行cGMP 交換[21]，cGMP 進(jìn)入卵母細(xì)胞后可通過影響cAMP 進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育[22]，該過程為原始卵泡的形成奠定了基礎(chǔ). GPR50作為膜蛋白受體，可能間接參與了cGMP 的擴散過程，同時與調(diào)控cGMP 的CNP -NPR2 信號通路[23]具有潛在的聯(lián)系. 而目前還沒有學(xué)者對GPR50 與卵泡發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行研究，具體的分子機制和信號通路還有待挖掘.根據(jù)姚穎[24]等人的研究，GPR50 基因在牦牛卵母細(xì)胞GV 期就有表達(dá)，并在成熟過程中逐漸升高，在MII 期達(dá)到頂峰，且極顯著高于GV 與GVBD 期(P＜0.01). 本研究通過收集GV、GVBD、MI、MII 期的小鼠卵母細(xì)胞，利用qPCR 技術(shù)測定GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)情況. 結(jié)果表明，GPR50在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂各階段均有表達(dá)，其表達(dá)量隨卵母細(xì)胞的發(fā)育逐漸升高且于MII 期時達(dá)到頂峰，其表達(dá)規(guī)律與姚穎[24]等人的研究結(jié)果保持一致. 但不同的是，GV 到GVBD 進(jìn)程中GPR50 表達(dá)量顯著增高，GVBD 到MI 進(jìn)程中GPR50 表達(dá)量緩慢升高，MI到MII 進(jìn)程中表達(dá)量顯著升高，這可能是小鼠和牦牛物種差異導(dǎo)致的結(jié)果.

本研究對GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育過程的亞細(xì)胞定位研究得知，GPR50 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜廣泛表達(dá)，且隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，GPR50 表達(dá)量逐漸升高，在成熟卵母細(xì)胞中廣泛分布在細(xì)胞膜區(qū)域. 姚穎[24]等人發(fā)現(xiàn)，GPR50 在牦牛卵母細(xì)胞中的分布主要集中于細(xì)胞膜，且隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育逐漸向細(xì)胞質(zhì)彌散分布，而在小鼠卵母細(xì)胞中，GPR50 廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，這可能是小鼠和牦牛物種差異導(dǎo)致的結(jié)果.同時，GPR50 在CA1 -3 錐體細(xì)胞、齒狀回的顆粒細(xì)胞及神經(jīng)元相關(guān)細(xì)胞的分布主要集中于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)[19，25]，與GPR50 在卵母細(xì)胞的亞細(xì)胞定位一致，這表明GPR50 作為膜受體蛋白在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中具有重要的作用.

4 結(jié)論

本研究基于GPR50 基因和小鼠卵母細(xì)胞建立了一種準(zhǔn)確高效的實時熒光定量PCR 方法，該方法重復(fù)性高、特異性強、靈敏度高，可用于GPR50 在小鼠各時期卵母細(xì)胞相對表達(dá)量的測定；隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞的表達(dá)量逐漸增高，到MII 期到達(dá)頂峰；GPR50 主要分布于小鼠卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜. 本研究結(jié)果為解析GPR50 在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的分子機制提供依據(jù).