秦 欣 陳娟娟 杜 響 許萬(wàn)濤 駱其君

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

在傳統(tǒng)的紫菜養(yǎng)殖過程中，伴隨著品種退化、產(chǎn)量質(zhì)量下降、多發(fā)病害等問題。紫菜的優(yōu)良品種對(duì)其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起著重要作用，而培育新品種的基礎(chǔ)是種質(zhì)資源［1］。因此，加強(qiáng)紫菜優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的培育對(duì)壇紫菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。其中，輻射誘變能誘導(dǎo)新種質(zhì)和新材料、增加突變頻率、縮短育種周期、豐富突變類型，是品種改良的重要途徑［2-3］。

目前，關(guān)于作物的輻射敏感性［4-5］、輻射生物學(xué)效應(yīng)［6-7］和分子細(xì)胞生物學(xué)變異已有相關(guān)研究報(bào)道。輻射誘變育種已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)的創(chuàng)新。如陳競(jìng)天等［8］利用60Co-γ 射線輻射甜葉菊，獲得了綜合性狀優(yōu)良的耐鹽突變體材料。各類誘變育種技術(shù)已廣泛應(yīng)用于紫菜中，成為提高育種效率、獲得優(yōu)良紫菜種質(zhì)的主要手段。趙爽等［9］用紫外線（ultraviolet，UV）誘導(dǎo)圓紫菜（Pyropiasuborbiculata）野生型葉狀體，分離到了可穩(wěn)定遺傳的色素突變體。張倩等［10］研究發(fā)現(xiàn)紫外線對(duì)皺紫菜（Pyropiacrispata）葉狀體具有良好的誘變效果，成功分離出了四個(gè)皺紫菜的色素突變品系。Ding 等［11］利用60Co-γ 射線誘變條斑紫菜（Pyropiayezoensis），篩選出了耐高溫、光合色素含量高、孢子產(chǎn)量高的突變株ST-2。雙因子誘變可以擴(kuò)大突變的類型、增加突變譜，誘變處理的順序發(fā)生改變，獲得的基因類型也隨之改變，因此雙因子誘變往往更有利于篩選出有利突變?cè)逯辏?2］，雙因子誘變方式在微藻和農(nóng)作物中廣泛使用［13］，如謝鳳行等［14］采用甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）-紫外復(fù)合誘變技術(shù)選育出了蛋白含量高且生長(zhǎng)較快的小球藻（Chlorella sorokiniana）突變株H10，但目前壇紫菜的誘變方式主要聚焦于單因子誘變選育出具有良好生產(chǎn)性能的突變株、利用環(huán)境條件（如高溫）篩選出具有抗逆性的突變株，關(guān)于壇紫菜自由絲狀體有高突變率的誘變方法組合鮮見報(bào)道。

壇紫菜（Neoporphyrahaitanensis）浙東1 號(hào)為群體選育的品種（國(guó)家水產(chǎn)新品種證書編號(hào)：GS-01-013-2014），具有殼孢子放散量高、葉片厚、產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)［15］。本試驗(yàn)通過對(duì)壇紫菜浙東1號(hào)的自由絲狀體進(jìn)行3種單因子和2種雙因子誘變處理，比較不同誘變方式的效果，以期篩選出合適有效的誘變方法，為壇紫菜遺傳育種提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜浙東1號(hào)（ZD-1）自由絲狀體來源于浙江省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藻體顏色正常，形態(tài)良好。甲基磺酸乙酯（EMS）、五水合硫代硫酸鈉，購(gòu)自中國(guó)上海國(guó)藥化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eclipse Ti 倒置熒光顯微鏡，尼康儀器（上海）有限公司；手持?jǐn)嚢枇侠戆?，飛利浦家電（中國(guó)）投資有限公司；GXZ 型智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；WATER-PAM 葉綠素?zé)晒鈨x，德國(guó)Walz 公司；TUV PL-L36 W/4P 紫外線殺菌燈，上海賴氏電子科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 絲狀體的誘變

1.3.1.160Co-γ 射線單因子誘變 于浙江輻照中心（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所）進(jìn)行60Co-γ 射線輻射處理，輻射后的絲狀體參照文獻(xiàn)［16］的方法培養(yǎng)。用手持?jǐn)嚢枇侠戆魧⒔z狀體打碎，并用60 目篩絹過濾，得到長(zhǎng)度為100～300 μm 的藻絲，在黑暗條件下恢復(fù)1 d，對(duì)材料進(jìn)行前處理。用0、50、125、400、1 000、1 600 Gy劑量的60Co-γ射線進(jìn)行誘變，誘變時(shí)間為30 min，處理后的藻絲使用滅菌海水清洗3次，再轉(zhuǎn)入滅菌海水培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照強(qiáng)度18 μmol·m-2·s-1，光周期為光照∶黑暗=12 h∶12 h，培養(yǎng)時(shí)間為2個(gè)月，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.3.1.2 UV單因子誘變 將絲狀體放入開蓋的培養(yǎng)皿中，置于36 W 紫外燈垂直距離為35 cm 處，照射30、60、180、360 min，以不做UV 處理的絲狀體作為對(duì)照，誘變后的藻絲處理與培養(yǎng)同1.3.1.1。

1.3.1.3 EMS 單因子誘變 前期通過預(yù)試驗(yàn)，確定2 h 為EMS 誘變效果較好的處理時(shí)間。將藻絲用0.1、0.2、0.4 mol·L-1的EMS 在4 ℃黑暗條件下浸泡2 h，以黑暗條件下浸泡在自然海水中的絲狀體作為對(duì)照，誘變后的藻絲處理與培養(yǎng)同1.3.1.1。

1.3.1.460Co-γ-UV 雙因子誘變 將60Co-γ 射線輻射組絲狀體預(yù)培養(yǎng)2 個(gè)月，對(duì)材料進(jìn)行前處理后進(jìn)行UV誘變，UV誘變方法同1.3.1.2。

1.3.1.560Co-γ-EMS 雙因子誘變 將60Co-γ 射線輻射組絲狀體預(yù)培養(yǎng)2 個(gè)月，對(duì)材料進(jìn)行前處理后進(jìn)行EMS誘變，EMS誘變方法同1.3.1.3。

1.3.2 形態(tài)觀察 取經(jīng)過誘變處理的絲狀體，用0.1%埃文斯藍(lán)染色液避光染色15 min，進(jìn)行漂洗，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。將出現(xiàn)色澤變異和具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)（長(zhǎng)度大于500 μm）的藻絲確定為突變?cè)褰z。

1.3.3 致死率和突變率的計(jì)算 以致死率達(dá)到50%（半致死率）作為誘變絲狀體的適宜條件［17-18］，致死率和突變率的計(jì)算公式如下：

絲狀體致死率=已染色自由絲狀體數(shù)目/被鏡檢的自由絲狀體總數(shù)×100%；

突變率=突變?cè)褰z數(shù)量/（非突變型藻絲存活數(shù)量+突變型藻絲存活數(shù)量）×100%。

1.3.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 取誘變處理組的絲狀體，用吸水紙吸取多余水分后置于培養(yǎng)皿中，用葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ，PSⅡ）的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（maximal photochemical quantum yield of PSⅡ，F(xiàn)v/Fm），測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［19］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，Origin 2018軟件繪圖，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ射線單因子誘變

2.1.160Co-γ射線對(duì)形態(tài)的影響 與未輻射組（圖1-a）相比，50 Gy（圖1-b）、125 Gy（圖1-c）、400 Gy（圖1-d）、1 000 Gy（圖1-e）輻射組營(yíng)養(yǎng)藻絲的色素片彌散，分枝頂端的細(xì)胞體積開始變大，呈紡錘形或其他不規(guī)則形狀，色素體由片狀變?yōu)閺浬睿^而呈顆粒狀。說明50、125、400、1 000 Gy 的輻射劑量促進(jìn)了這些藻絲的發(fā)育和成熟，1 600 Gy（圖1-f）輻射組可見較成熟的孢子囊枝，說明1 600 Gy 的輻射劑量促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)藻絲轉(zhuǎn)向孢子囊枝的生長(zhǎng)。由此可見，60Co-γ 射線輻射處理可以促進(jìn)自由絲狀體的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖1 自由絲狀體輻射誘變后的形態(tài)Fig.1 Morphology after free-living conchocelis radiation mutagenesis

2.1.260Co-γ射線對(duì)致死率和突變率的影響 由圖2可知，ZD-1 在不同劑量的60Co-γ 射線輻射下，都出現(xiàn)了突變的藻絲，在最低劑量50 Gy處理下，ZD-1的致死率為17.2%，突變率為0.002%，隨著輻射劑量的增加，壇紫菜自由絲狀體ZD-1 的突變率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，致死率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在1 000 Gy 時(shí)，突變率到達(dá)峰值，為0.024%，致死率為49.3%，接近半致死率。綜合致死率和突變率的結(jié)果，初步判定采用1 000 Gy 劑量60Co-γ 射線進(jìn)行誘變處理是最有利于篩選出突變體的輻射劑量。

圖2 60Co-γ射線誘變對(duì)壇紫菜ZD-1致死率及突變率的影響Fig.2 Effect of 60Co-γ ray mutagenesis on the lethality and mutation rate of N. haitanensis ZD-1

2.1.360Co-γ 射線對(duì)Fv/Fm的影響 由圖3可知，隨著輻射劑量的增加，ZD-1 的Fv/Fm呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢(shì)。與未輻射組相比，當(dāng)輻射劑量達(dá)到50 Gy時(shí)，ZD-1 的Fv/Fm極顯著升高（P<0.01），當(dāng)輻射劑量達(dá)到1 000 Gy 時(shí)，F(xiàn)v/Fm顯著降低（P<0.05），當(dāng)輻射劑量達(dá)到1 600 Gy 時(shí)，該值下降至最低，為0.13 左右。由此可見，1 600 Gy 的60Co-γ 射線輻射劑量削弱了壇紫菜自由絲狀體的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，綜合致死率的指標(biāo)，判定60Co-γ射線的適宜誘變劑量為1 000 Gy。

圖3 60Co-γ射線誘變對(duì)壇紫菜ZD-1 Fv/Fm的影響Fig.3 Effect of 60Co-γ ray mutagenesis on Fv/Fm of N. haitanensis ZD-1

2.2 UV單因子誘變

2.2.1 UV 對(duì)致死率和突變率的影響 如圖4 所示，隨著UV照射時(shí)間的延長(zhǎng)，ZD-1的致死率緩慢增加，突變率持續(xù)上升后下降。在30 min時(shí)，ZD-1的致死率為18.7%，突變率為0.008%；在180 min時(shí)，致死率和突變率分別增加至51.7%、0.025%，突變率達(dá)到峰值，致死率接近50%；在360 min時(shí)，突變率下降至0.012%，致死率持續(xù)上升至70.0%。綜合上述結(jié)果，初步判定紫外照射時(shí)間180 min是最有利于篩選出突變體的處理時(shí)間。

圖4 UV誘變對(duì)壇紫菜ZD-1致死率及突變率的影響Fig.4 Effect of UV mutagenesis on the lethality and mutation rate of N.haitanensis ZD-1

2.2.2 UV 對(duì)Fv/Fm的影響 如圖5 所示，隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，未輻射組ZD-1 的Fv/Fm持續(xù)下降，與對(duì)照組相比，紫外照射30 min 時(shí)，ZD-1 的Fv/Fm顯著降低至0.377，照射時(shí)間延長(zhǎng)至60 min 時(shí)，ZD-1 的Fv/Fm極顯著降低至0.288。照射時(shí)間達(dá)到360 min時(shí)，ZD-1的Fv/Fm降低至最小值0.218，由此可見，長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射減弱了ZD-1的光合作用。綜合致死率指標(biāo)，判定適宜的UV誘變時(shí)長(zhǎng)為180 min。

圖5 UV及60Co-γ射線-UV雙因子誘變對(duì)壇紫菜ZD-1 Fv/Fm的影響Fig.5 Effect of UV and 60Co-γ-ray and UV two-factor mutagenesis on Fv/Fm of N. haitanensis ZD-1

2.3 EMS單因子誘變

2.3.1 EMS 對(duì)致死率和突變率的影響 如圖6 所示，在不同濃度EMS 處理2 h 的誘變條件下，ZD-1 都出現(xiàn)了突變的藻絲，在最低濃度0.1 mol·L-1的處理下，ZD-1 的致死率為4.9%，突變率為0.005%，隨著濃度的增加，ZD-1的突變率先上升后下降，致死率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在0.4 mol·L-1誘變處理下，致死率達(dá)到峰值，為99.2%，接近全部死亡，因此該濃度不適合作為誘變條件。在0.2 mol·L-1誘變處理下，致死率為46.8%，接近半致死率，突變率由0.1 mol·L-1條件下的0.005%增加至0.032%，初步判定采用0.2 mol·L-1EMS進(jìn)行誘變是篩選出突變體的有利條件。

圖6 EMS誘變對(duì)壇紫菜ZD-1致死率及突變率的影響Fig.6 Effect of EMS mutagenesis on the lethality andmutation rate of N.haitanensis ZD-1

2.3.2 EMS 對(duì)Fv/Fm的影響 由圖7 可知，隨著EMS濃度的增加，未輻射組ZD-1 的Fv/Fm逐漸下降。當(dāng)EMS 的濃度為0.1 mol·L-1時(shí)，ZD-1 的Fv/Fm降低至0.380，與對(duì)照組相比具有極顯著差異，當(dāng)EMS 的濃度增加至0.2 mol·L-1時(shí)，ZD-1 的Fv/Fm僅為0.004。由此可見，0.2 和0.4 mol·L-1的處理濃度對(duì)ZD-1 造成了劇烈的損傷，此濃度不適宜作為誘變篩選的條件。綜合致死率指標(biāo)，最終判定使用EMS 濃度為0.1 mol·L-1、處理時(shí)間為2 h是篩選出突變體的有利條件。

圖7 EMS及60Co-γ射線-EMS雙因子誘變對(duì)壇紫菜ZD-1 Fv/Fm的影響Fig.7 Effect of EMS and 60Co-γ-ray and EMS two-factor mutagenesis on Fv/Fm of N. haitanensis ZD-1

2.4 60Co-γ射線-UV雙因子誘變

2.4.160Co-γ 射線-UV 雙因子誘變對(duì)致死率和突變率的影響 將輻射劑量為1 000 Gy 的ZD-1 預(yù)培養(yǎng)2 個(gè)月，作為雙因子誘變的初始藻絲，下一步進(jìn)行UV照射，由圖8-a 可知，與單因子UV 誘變相似，60Co-γ 射線-UV 雙因子誘變條件下的ZD-1 突變率隨紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減小，UV輻射180 min時(shí)，致死率為52%，接近半致死率，突變率比單因子UV在180 min處理下增加至0.082%，表明與單因子誘變相比，雙因子誘變?cè)黾恿送蛔兊母怕剩醪脚卸║V 輻射180 min為60Co-γ 射線-UV 雙因子誘變中UV 的適宜誘變時(shí)長(zhǎng)。

圖8 雙因子誘變對(duì)壇紫菜ZD-1致死率及突變率的影響Fig.8 Effect of double factor mutagenesis on the lethality and mutation rate of N. haitanensis ZD-1

2.4.260Co-γ 射線-UV 雙因子誘變對(duì)Fv/Fm的影響60Co-γ 射線和UV 雙因子誘變中，與單因子UV 誘變相似，隨著UV 輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，ZD-1-1 000 Gy 組Fv/Fm呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖5）。UV 輻射30 min 時(shí)，ZD-1-1 000 Gy 組的Fv/Fm顯著高于對(duì)照組（P<0.01），為0.351，UV 輻射時(shí)間為60 min 時(shí)，F(xiàn)v/Fm比對(duì)照組高0.016，但無(wú)顯著差異，隨著UV 輻射時(shí)間的增加，F(xiàn)v/Fm持續(xù)下降，UV 輻射180 min 時(shí)，F(xiàn)v/Fm低于對(duì)照組但無(wú)顯著差異，在360 min 時(shí)極顯著低于對(duì)照組，為0.198，表明持續(xù)的UV 輻射會(huì)削弱植物的光合作用。綜合致死率指標(biāo)，判定UV 輻射180 min 為60Co-γ 射線-UV 雙因子誘變中UV的適宜誘變時(shí)長(zhǎng)。

2.5 60Co-γ射線-EMS雙因子誘變

2.5.160Co-γ射線-EMS雙因子誘變對(duì)致死率和突變率的影響 對(duì)雙因子誘變的初始藻絲進(jìn)行下一步EMS誘變處理，由圖8-b可知，ZD-1的突變率在0.1 mol·L-1的誘變濃度下最大，為0.06%，較單因子EMS 誘變明顯增加，同時(shí)，該濃度下的致死率為52.7%，接近半致死率。在0.2 mol·L-1的誘變濃度下，ZD-1的致死率較單因子EMS 誘變?cè)黾又?6.9%，突變率較單因子EMS誘變?cè)黾又?.048%，表明60Co-γ射線和EMS雙因子誘變對(duì)ZD-1造成的損傷高于單因子EMS誘變，誘變的效果優(yōu)于單因子EMS誘變，初步判定0.1和0.2 mol·L-1都可作為60Co-γ 射線-EMS 雙因子誘變中EMS 的適宜誘變濃度。

2.5.260Co-γ 射線-EMS 雙因子誘變對(duì)Fv/Fm的影響60Co-γ 射線和EMS 雙因子誘變中，隨著EMS 濃度的增加，ZD-1 的Fv/Fm總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖7）。當(dāng)EMS的濃度為0.1 mol·L-1時(shí)，ZD-1-1 000 Gy組的Fv/Fm下降幅度為21%，高于單因子EMS 誘變。當(dāng)EMS 的濃度為0.2 mol·L-1時(shí)，ZD-1-1 000 Gy 組的Fv/Fm下降幅度為73%，F(xiàn)v/Fm達(dá)到最低值，為0.039，極顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明0.2 mol·L-1的EMS強(qiáng)烈抑制了ZD-1的光合作用。綜合致死率指標(biāo)，判定0.1 mol·L-1的EMS為60Co-γ 射線-EMS 雙因子誘變中EMS 的適宜誘變濃度。

2.6 壇紫菜突變絲狀體的生長(zhǎng)狀況

壇紫菜絲狀體經(jīng)單因子和雙因子誘變后，繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)出現(xiàn)的不同突變特性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，有的絲狀體色素突變特性消失，顏色恢復(fù)至野生色，有的絲狀體出現(xiàn)新的色素突變特性，有的具有色素突變特性的絲狀體生長(zhǎng)停滯，藻絲逐漸變白，最后死亡，突變率有所降低，詳見表1。表明在此培養(yǎng)條件下，有突變特性的藻絲不能達(dá)到最佳生長(zhǎng)發(fā)育水平，突變表型有所減少。

表1 不同誘變方式處理壇紫菜ZD-1的誘變結(jié)果Table 1 Mutagenesis results of N. haitanensis ZD-1 treated with different mutagenesis methods/%

本研究中，60Co-γ 射線、UV、EMS 在其最佳誘變處理?xiàng)l件下達(dá)到了最高突變率，分別為0.024%、0.025%、0.032%，表明ZD-1 在單因子EMS 誘變下可以得到較多的突變體。60Co-γ 射線-UV 和60Co-γ 射線-EMS 在其最佳誘變處理?xiàng)l件下達(dá)到了最高突變率，分別為0.082%、0.048%，綜合考慮5種誘變方法的突變率，表明ZD-1 在60Co-γ 射線-UV 雙因子誘變下可以得到較多的突變體，提高突變的概率。

2.7 誘變條件與致死率和光合參數(shù)的相關(guān)性分析

由表2 可知，不同誘變條件與致死率和光合參數(shù)之間存在不同程度的相關(guān)性。致死率與60Co-γ射線誘變劑量-EMS 濃度呈正相關(guān)，與EMS 濃度、UV 照射時(shí)間呈顯著正相關(guān)，與60Co-γ射線誘變劑量、60Co-γ射線誘變劑量-UV照射時(shí)間呈極顯著正相關(guān)。光合參數(shù)與EMS濃度、UV 照射時(shí)間、60Co-γ射線誘變劑量-EMS濃度呈負(fù)相關(guān)，與60Co-γ 射線誘變劑量-UV 照射時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)，與60Co-γ射線誘變劑量呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表2 不同誘變條件處理與致死率和光合參數(shù)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of different mutagenesis conditions with lethality and photosynthetic parameters

60Co-γ 射線誘變劑量-EMS 濃度雙因子誘變與致死率的相關(guān)系數(shù)為0.987，高于EMS濃度單因子誘變與致死率的相關(guān)系數(shù)（0.980），60Co-γ射線誘變劑量-EMS濃度雙因子誘變與光合參數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.950，高于EMS 濃度單因子誘變與光合參數(shù)的相關(guān)系數(shù)（0.872）；60Co-γ射線誘變劑量-UV 照射時(shí)間雙因子誘變與致死率的相關(guān)系數(shù)為0.991，高于UV 照射時(shí)間單因子誘變與致死率的相關(guān)系數(shù)（0.949），60Co-γ射線誘變劑量-UV輻射時(shí)間雙因子誘變與光合參數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.924，高于UV 單因子誘變與光合參數(shù)的相關(guān)系數(shù)（0.830）?？梢?，雙因子誘變與光合參數(shù)和致死率的相關(guān)系數(shù)均大于單因子誘變，表明對(duì)絲狀體光合作用及存活率影響較大的誘變方式為雙因子誘變，致死率和光合參數(shù)可以作為衡量不同誘變效果的參考指標(biāo)。

3 討論

60Co-γ 射線具有很強(qiáng)的穿透能力，能夠影響細(xì)胞體內(nèi)的各種生理生化反應(yīng)，改變?nèi)~綠體類囊體的基本結(jié)構(gòu)，并調(diào)控抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)次生代謝物質(zhì)的累積，從而達(dá)到變異效果［20-22］。射線誘變?cè)谝欢▌┝肯驴梢源龠M(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育，本研究發(fā)現(xiàn)，ZD-1 經(jīng)不同劑量60Co-γ射線輻射后，出現(xiàn)了不定型細(xì)胞和孢子囊枝，說明射線輻射促進(jìn)絲狀體由營(yíng)養(yǎng)藻絲向孢子囊枝的轉(zhuǎn)化，可能是藻絲在不利條件下，傾向于生長(zhǎng)繁殖，而非營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，這樣的選擇有利于藻絲在逆境環(huán)境下繁殖后代，在生產(chǎn)實(shí)踐中可以縮短育苗的時(shí)間，具有良好的栽培性狀。這與陳昌生等［23］發(fā)現(xiàn)60Co-γ 射線輻射對(duì)壇紫菜自由絲狀體形成的孢子囊枝數(shù)量有顯著增加的結(jié)果相符。所有誘變處理組絲狀體的致死率均較對(duì)照有所上升，推測(cè)過高的輻射劑量擾亂了生物體的正常代謝［24-25］。

60Co-γ射線輻射會(huì)直接或間接地影響植物體內(nèi)葉綠素含量，從而在不同程度上影響植物的光合作用［26］。Fv/Fm反映了植物的潛在最大光能轉(zhuǎn)換效率，可衡量植物是否處在健康的生理狀態(tài)。本研究中，ZD-1Fv/Fm在低劑量（50 Gy）輻射下增加，這與許超麗等［27］發(fā)現(xiàn)40 Gy 的低劑量X 射線輻射能夠提高水稻光合作用的結(jié)果一致，推測(cè)藻體內(nèi)多種抗氧化物酶系統(tǒng)在抵御逆境下產(chǎn)生的多種活性氧主要用于維持細(xì)胞的正常生理功能和光合作用的代謝；而1 600 Gy 輻射下光合速率下降，推測(cè)是由于輻射劑量超過了藻體抵御逆境的最大能力。

EMS 作為化學(xué)誘變劑，能誘發(fā)更多基因位點(diǎn)的變異，不同植物對(duì)EMS的敏感性存在差異［28］。馬穎超［29］通過設(shè)置不同EMS 濃度和時(shí)間組合的結(jié)果顯示，條斑紫菜絲狀體在0.2 mol·L-1濃度下處理1 h 時(shí)致死率超過50%，而本研究中壇紫菜絲狀體在0.2 mol·L-1濃度下處理2 h時(shí)接近半致死率，表明誘變的效果與誘變材料和誘變條件有關(guān)。

UV照射能夠造成染色體的斷裂隨機(jī)分布，使生物體出現(xiàn)較多的染色體結(jié)構(gòu)變異［30］。隨著紫外輻射強(qiáng)度的增加，藻體內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生多種活性氧，對(duì)藻體的光合器官造成損傷，降低光合參數(shù)［31］。本研究中，短時(shí)間的UV 照射條件下，21 d 后出現(xiàn)了生長(zhǎng)較快的藻絲，這與前人利用紫外線聯(lián)合60Co-γ射線選育出產(chǎn)量高的突變株的研究結(jié)果一致［32］。推測(cè)是由于低強(qiáng)度的UV 輻射能夠促進(jìn)藻體的固碳作用［33-34］，使得藻體的生長(zhǎng)加快，理論上可以選育出生長(zhǎng)較快的藻絲，有利于生產(chǎn)實(shí)踐。因此，有待對(duì)藻絲進(jìn)行下一步的培養(yǎng)，觀察研究生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)是否有可遺傳性。

為提高誘變育種的效果，常采用多種誘變方式組合，最典型的是先進(jìn)行物理誘變，破壞生物膜的完整性，增大其滲透性，增大生物對(duì)化學(xué)誘變劑的吸收能力后，再進(jìn)行化學(xué)誘變。理論上物理和化學(xué)誘變方式相結(jié)合能發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，更快地獲得有益的突變體［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，雙因子誘變的Fv/Fm顯著高于單因子誘變，推測(cè)60Co-γ 射線輻射在一定程度上增加了ZD-1 的抗輻射能力，在UV 低時(shí)長(zhǎng)誘變條件下有了一定的耐受力。雙因子誘變的最大突變率高于單因子誘變，表明雙因子誘變的效果優(yōu)于單因子誘變。這與胡建華等［36］的研究結(jié)果一致，即：利用二次重離子誘變選育出的枯草芽孢桿菌核黃素產(chǎn)量比一次誘變提高77.7%。本試驗(yàn)采用3 種單因子和2 種雙因子誘變方法，得出在輻射劑量為1 000 Gy60Co-γ射線和UV照射180 min雙因子誘變方式下的誘變率最大，為0.082%，表明雙因子誘變可以極大豐富突變的概率，創(chuàng)造多種突變特性，有利于種質(zhì)的培育，是一種高效的誘變方法。

由于突變特性的表型受環(huán)境影響較大，在后續(xù)的培養(yǎng)條件中易消退。為避免上述情況，一方面需要擴(kuò)大誘變的數(shù)量，盡可能獲得更多有突變特性的絲狀體，一方面需要設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度和光照，初步探究最適生長(zhǎng)條件，保留絲狀體的突變特性，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和研究。此外，由于同一生物的不同生長(zhǎng)階段對(duì)誘變的敏感性不同，因此本研究具有一定的局限性，有必要對(duì)絲狀體的不同生長(zhǎng)階段進(jìn)行研究，從而獲得更加全面、高效、多樣的誘變方法。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，輻射劑量為1 000 Gy 的60Co-γ射線和UV 照射180 min 的雙因子誘變方式可得到較多的突變體，突變率為0.082%，致死率為52%，有良好的突變效應(yīng)。誘變對(duì)ZD-1 造成了損傷，F(xiàn)v/Fm下降至0.270。突變具有一定的非定向性，因此突變后的絲狀體具有不穩(wěn)定性，在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，突變率有所下降，適應(yīng)生長(zhǎng)的穩(wěn)定的突變特性將會(huì)被保留下來。