曾令偉，劉昱廷，趙亞繪

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長(zhǎng)沙 410008

硫辛酸注射液是內(nèi)分泌科常用藥，其對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化抑制作用可有效降低葡萄糖轉(zhuǎn)化率，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)神經(jīng)組織脂質(zhì)氧化的抑制作用突出，因此被廣泛應(yīng)用于糖尿病周圍神經(jīng)病變引起的感覺(jué)異常，在控制血糖和并發(fā)癥方面具有突出效果[1-2]。硫辛酸的強(qiáng)效抗氧化作用不受基質(zhì)性質(zhì)影響，可在脂溶性和水溶性介質(zhì)中發(fā)揮同樣作用，且硫辛酸還原劑和其本身的抗氧化效果相近，還能促進(jìn)維生素族再生，提升細(xì)胞谷胱甘肽水平，對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)生積極影響，因此也被應(yīng)用于護(hù)膚美容行業(yè)和腫瘤治療[3-5]。臨床研究和動(dòng)物試驗(yàn)均證實(shí)了硫辛酸的解毒作用，可用于減輕金屬中毒對(duì)肝腎的毒性作用，有效保護(hù)機(jī)體重要臟器[6]。目前對(duì)于硫辛酸的研究越來(lái)越多，雖然硫辛酸注射液在臨床應(yīng)用劑量范圍內(nèi)處于用藥安全水平，但其亦可引起諸多不良反應(yīng)，比如過(guò)敏性紫癜、皮疹、靜脈炎、頭痛、抽搐、復(fù)視等[7-8]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，硫辛酸所致熱原反應(yīng)現(xiàn)象頻出，相比于其他注射劑藥品，硫辛酸注射液熱原反應(yīng)尤為嚴(yán)重，甚至危及生命[9]?；谏鲜鲇^點(diǎn)，本研究于2022年3—6 月在中南大學(xué)醫(yī)院藥學(xué)研究所選取新西蘭兔11 只作為藥物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行觀察，對(duì)硫辛酸熱原反應(yīng)的原因加以分析，為藥物生產(chǎn)和臨床用藥安全提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

①儀器：體溫測(cè)量設(shè)備為上海黃海藥檢儀器生產(chǎn)的熱原測(cè)溫儀，型號(hào)WRY-C，硫辛酸注射液加熱設(shè)備為上海博迅生產(chǎn)的現(xiàn)代電熱恒溫水浴鍋，型號(hào)SSW-600-2S，內(nèi)毒素試驗(yàn)檢查設(shè)備為湛江安度斯生物生產(chǎn)的恒溫儀，試管型號(hào)選用TAL-40D 型，離心設(shè)備為安徽中科中佳生產(chǎn)的低速離心機(jī)，型號(hào)SC-3012，溶血試驗(yàn)所使用的吸光度計(jì)算設(shè)備為梅特勒-托利多國(guó)際生產(chǎn)的UV7 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，以及由上海精科分析儀器公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)，型號(hào)754N。

②藥品與試劑：熱原反應(yīng)試驗(yàn)藥品分兩種，即硫辛酸注射液實(shí)驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品，均產(chǎn)自山西亞寶藥業(yè)，前者給藥劑量30 mg/kg，后者10 mg/kg。內(nèi)毒素標(biāo)本樣品出自中國(guó)食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號(hào)為150601-201783，內(nèi)毒素試驗(yàn)中鱟試劑產(chǎn)自湛江博康生物，生產(chǎn)批號(hào)為1708230，溶血試驗(yàn)中血漿游離血紅蛋白（hemoglobin, Hb）測(cè)定使用產(chǎn)自北京百奧萊博科技的游離Hb 檢測(cè)試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)為171205。所有藥品和試劑均符合實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)。

③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇由濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心供給的11 只新西蘭兔，生產(chǎn)許可證為SCXK（魯20150001），雌雄兔子比例為6∶5，實(shí)驗(yàn)兔子體質(zhì)量2.3～2.6 kg，平均（2.47±1.05）kg，屬普通級(jí)。于中南大學(xué)醫(yī)院藥學(xué)研究所開(kāi)展研究，實(shí)驗(yàn)環(huán)境中白天和晚上交替時(shí)間12 h/12 h，動(dòng)物飼養(yǎng)溫度控制在22～26℃，最高溫與最低溫差值不超過(guò)5℃，空氣濕度保持在50%～70%。研究已獲本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

①熱原試驗(yàn)：熱原試驗(yàn)原理依據(jù)熱原檢查法，參考《中國(guó)藥典》2020年版[9]。隨機(jī)選出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的6 只新西蘭兔進(jìn)行觀察，設(shè)計(jì)硫辛酸藥物毒理試驗(yàn)，同時(shí)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組，即硫辛酸注射液實(shí)驗(yàn)樣品（觀察組3 只）和硫辛酸注射液對(duì)照樣品（對(duì)照組3 只）[10]，觀察組體質(zhì)量（2.57±0.11）kg，雌兔2 只，雄兔1 只，對(duì)照組體質(zhì)量（2.42±0.09）kg，雌兔2只，雄兔1 只，兩組指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。具體試驗(yàn)操作為先使用測(cè)溫儀測(cè)量并記錄兔子正常體溫，于10 min 后使用注射器抽取加熱到37.5℃左右的硫辛酸藥物，隨即由耳靜脈緩慢注射入兔子體內(nèi)，劑量控制在30 mg/kg（對(duì)照組為10 mg/kg）、1 mL/kg；緊接著是測(cè)溫環(huán)節(jié)，測(cè)溫間隔時(shí)間為0.5 h，3 h 內(nèi)共測(cè)量6 次，對(duì)比于正常體溫值，計(jì)算升高溫度，用℃表示，計(jì)算方法為用最高一次的體溫值減去正常值；熱原反應(yīng)陽(yáng)性判斷依據(jù)為，初檢的3 只新西蘭兔子體溫升高溫度總計(jì)≥1.3℃，或任意1 只兔子體溫升高溫度≥0.6℃，可判斷初檢陽(yáng)性，隨之進(jìn)入復(fù)檢環(huán)節(jié)，另外取5 只兔子進(jìn)行復(fù)檢，操作與初檢方法一致。

②內(nèi)毒素檢查：內(nèi)毒素檢查方法依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版進(jìn)行。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)要求標(biāo)準(zhǔn)[9]：對(duì)照組標(biāo)本樣品為≤0.4 EU/mg，觀察組標(biāo)本樣品為≤0.25 EU/mg（即內(nèi)毒素限值）。具體操作如下，先以最大稀釋倍數(shù)（CL/λ）將供試品稀釋得到2 支供試品管和2 支陽(yáng)性對(duì)照（將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品使用該濃度的供試品稀釋液制成2λ 濃度），內(nèi)毒素陰性對(duì)照管和陽(yáng)性對(duì)照管的制備需另外各取2 支，前者加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，后者加入2λ 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液，將制備完成的試管放入提前設(shè)定好的恒溫儀處理，1 h 后取出，記錄結(jié)果變化，判斷陽(yáng)性和陰性情況。

③體外溶血試驗(yàn)：體外溶血試驗(yàn)在動(dòng)物紅細(xì)胞懸液基礎(chǔ)上進(jìn)行，制備濃度為2%，具體操依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版進(jìn)行，加入供試液、新西蘭兔紅細(xì)胞懸液和0.9%氯化鈉注射液，硫辛酸注射液為30 mg/mL 的濃度，陽(yáng)性對(duì)照使用滅菌純凈水，陰性對(duì)照使用0.9%氯化鈉注射液[9]。參照藥典計(jì)算溶血率，a 是供試品各管的上清液吸收度，b 是滅菌純凈水上清液吸收度，c 是0.9%氯化鈉注射液對(duì)照管上清液吸收度，具體計(jì)算方法為先調(diào)零處理，使用0.9%氯化鈉注射液在分光光度計(jì)作用下操作，波長(zhǎng)在545 nm 時(shí)使用分光光度計(jì)測(cè)定吸收度，溶血率=（a-c）/（b-c）×100%。

④體內(nèi)溶血試驗(yàn)：體內(nèi)溶血試驗(yàn)通過(guò)靜脈給藥，首先給藥前2 h 采集耳中動(dòng)脈血2 mL 置于抗凝管，緊接著對(duì)6只試驗(yàn)兔子以1 mL/kg容積、30 mg/mL濃度以及30 mg/kg 的劑量進(jìn)行耳靜脈注射給藥，僅注射1 次，隨后于2 h 同樣采集耳中動(dòng)脈血。使用低速離心機(jī)分別測(cè)定給藥前后血漿中游離Hb 水平，對(duì)比前后變化，判斷體內(nèi)溶血試驗(yàn)陽(yáng)性情況。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組兔子體內(nèi)溫度值，統(tǒng)計(jì)較正常體溫升高的水平，判斷兩組熱原反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果，觀察細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果，判斷致熱原是否為內(nèi)毒素，觀察分光光度計(jì)吸收度數(shù)值，計(jì)算體外溶血率，判斷體外溶血反應(yīng)是否導(dǎo)致熱原反應(yīng)，觀察兔子體內(nèi)血漿游離Hb 水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，LSD 檢驗(yàn)用于方差齊的數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)用于方差不齊的數(shù)據(jù)，通過(guò)單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱原檢查結(jié)果

觀察組初檢和復(fù)檢結(jié)果中，每只兔子體溫升高均＞0.6℃，溫度升高總和分別為2.3℃、3.7℃，熱原反應(yīng)結(jié)果均為陽(yáng)性，硫辛酸注射液劑量為30 mg/kg，而對(duì)照組每只兔子體溫升高均＜0.6℃，溫度升高總和為0.9℃，熱原反應(yīng)結(jié)果為陰性。見(jiàn)表1、表2。

表1 初檢硫辛酸注射液熱原檢查情況（℃）

表2 復(fù)檢硫辛酸注射液熱原檢查情況（℃）

2.2 內(nèi)毒素檢查結(jié)果

內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果中兩組均顯示陰性，與熱原反應(yīng)無(wú)必要聯(lián)系，內(nèi)毒素含量在規(guī)定范圍內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表3。

表3 硫辛酸注射液內(nèi)毒素檢查結(jié)果

2.3 體外溶血試驗(yàn)結(jié)果

體外溶血試驗(yàn)中觀察組溶血率超過(guò)5%，硫辛酸注射液濃度＜30 mg/mL，加樣0.3 mL 后即出現(xiàn)了明顯溶血反應(yīng)，觀察組為陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)照組溶血率顯然不足5%，為陰性結(jié)果。見(jiàn)表4。

表4 硫辛酸注射液體外溶血試驗(yàn)結(jié)果

2.4 體內(nèi)溶血試驗(yàn)結(jié)果

體內(nèi)溶血試驗(yàn)中觀察組兔子注射硫辛酸后血漿游離Hb 水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且觀察組較注射前Hb 水平提升明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而對(duì)照組注射后Hb 水平較注射前升高不明顯，差異物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.179）。見(jiàn)表5。

表5 硫辛酸注射液體內(nèi)溶血試驗(yàn)結(jié)果(±s)

表5 硫辛酸注射液體內(nèi)溶血試驗(yàn)結(jié)果(±s)

組別觀察組（n=3）對(duì)照組（n=3）t 值P 值注射劑量（mg/kg）3030注射前（g/L）46.15±9.1747.21±4.69-0.1780.867注射后（g/L）128.54±11.7651.36±8.239.3130.001 t 值55.0982.031 P 值＜0.0010.179

3 討論

致熱原是引起臨床用藥出現(xiàn)熱原反應(yīng)的主要原因，熱原反應(yīng)也是常見(jiàn)不良反應(yīng)，持續(xù)高熱可能誘發(fā)休克，危及患者生命，因此用藥說(shuō)明應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行，降低熱原反應(yīng)發(fā)生率[10]。常見(jiàn)致熱原分為內(nèi)源性和外源性兩種，細(xì)菌內(nèi)毒素屬外源性，在臨床最多見(jiàn)，而內(nèi)源性機(jī)制復(fù)雜，但與機(jī)體中樞的調(diào)節(jié)和溶血反應(yīng)具有一定聯(lián)系，但具體結(jié)果尚待研究。有關(guān)研究采用4 種中藥制劑以檢查家兔熱原反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果提示，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可為熱原檢查提供一定依據(jù)[11]。有關(guān)研究指出，鱟試劑熱原檢查法易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，且靈敏度受多因素影響，建議兔法與內(nèi)毒素法聯(lián)合檢測(cè)，以降低干擾因素，提高準(zhǔn)確性[12]。兔試驗(yàn)和鱟試劑法常被作為熱原檢查的通用方法，在熱原反應(yīng)的藥品質(zhì)量檢查中具有重要意義[13-14]。而上述試驗(yàn)中使用鱟試劑檢查內(nèi)毒素是否為熱原反應(yīng)的主要因素，結(jié)果提示陰性，而兔試驗(yàn)結(jié)果顯示硫辛酸注射液熱原反應(yīng)陽(yáng)性，兩項(xiàng)研究結(jié)論不同的原因可能在于注射制劑的差異，具體原因有待進(jìn)一步探討。本研究結(jié)論表明致熱原與外源性細(xì)菌內(nèi)毒素聯(lián)系不大，后續(xù)可進(jìn)行深入研究，分析具體原因。溶血試驗(yàn)的設(shè)計(jì)邏輯源于紅細(xì)胞破裂可致免疫因子這類內(nèi)源性致熱原釋放，最終引起體溫變化，依據(jù)此種思路設(shè)計(jì)溶血試驗(yàn)[15]。田恩圣等[8]通過(guò)對(duì)體外溶血試驗(yàn)的實(shí)踐，證明了硫辛酸注射液濃度30 mg/mL 情況下可引起溶血反應(yīng)，而體內(nèi)溶血試驗(yàn)結(jié)果提示注射30 mg/mL 硫辛酸后2 h 新西蘭兔血漿中游離Hb 為（125.9±31.5）g/L，較注射前（45.2±11.8）g/L 提升明顯（P＜0.01），證明了體內(nèi)溶血反應(yīng)陽(yáng)性。在上述研究中，體外溶血試驗(yàn)陽(yáng)性，判斷一定濃度的硫辛酸可致溶血，而體內(nèi)溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示觀察組兔子血漿游離Hb 水平為（128.54±11.76）g/L，較對(duì)照組（51.36±8.23）g/L 明顯升高（P＜0.05），且較給藥前提升明顯（P＜0.05），而對(duì)照組Hb 水平較給藥前相比變化不大（P＞0.05），進(jìn)一步表明體內(nèi)溶血反應(yīng)的發(fā)生可誘導(dǎo)新西蘭兔體內(nèi)細(xì)胞因子、激素、免疫介質(zhì)等內(nèi)源性致熱原入血，紅細(xì)胞的破壞和相關(guān)炎性因子干擾了體溫調(diào)節(jié)中樞，從而引起體溫升高現(xiàn)象[16-17]。

綜上所述，硫辛酸注射液熱原反應(yīng)與細(xì)菌內(nèi)毒素關(guān)系不大，而實(shí)驗(yàn)樣品在30 mg/kg 注射劑量條件下可致熱原反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，過(guò)程中實(shí)驗(yàn)兔子體內(nèi)外發(fā)生了溶血反應(yīng)，可能與熱原反應(yīng)存在內(nèi)在聯(lián)系，需引起高度重視。