余 磊 趙志燊

（1．貴陽學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2．貴州生態(tài)環(huán)境中優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品殘留農(nóng)藥降解關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室，貴州 貴陽 550005）

玉米作為主要的糧食作物以及重要的飼料原料，在不同生長發(fā)育階段，收割玉米莖稈和果穗進行切碎加工并貯藏發(fā)酵，可以制得青貯玉米飼料[1-3]。青貯玉米具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富的特點，是重要的飼料來源[4-7]。為了減緩飼料作物的病蟲害，在玉米、大豆等主要飼料原料的農(nóng)作物生產(chǎn)中使用農(nóng)藥，會對飼料的生產(chǎn)安全造成隱患。施用的農(nóng)藥不能完全消除，會隨著制成的飼料進入動物體內(nèi)，會在一定程度上對肉、蛋、奶的品質(zhì)造成影響，進而影響人類的健康[8]。因此，檢測青貯玉米飼料中的農(nóng)藥殘留十分必要[9]。

目前，國內(nèi)現(xiàn)有飼料中農(nóng)藥殘留檢測相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)《飼料中有機磷農(nóng)藥殘留量的測定 氣相色譜法》（GB/T 18969—2003）僅限于有機磷類農(nóng)藥殘留的測定。飼料樣品提取液經(jīng)Envi-18柱、Envi-Carb柱、Sep-PakNH2柱凈化后上機分析，該方法樣品前處理時間長，提取液經(jīng)3種不同凈化柱凈化時操作煩瑣，且凈化柱價格昂貴，會增加分析時間，提高價格成本。因此，需要一種更加簡便、準(zhǔn)確、適應(yīng)現(xiàn)代化檢測需求的新方法。本試驗采用改良的QuEchERS 技術(shù)前處理飼料樣品，以乙腈作為萃取溶劑，結(jié)合氣相色譜—三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS）檢測了飼料中20種農(nóng)藥殘留，為確保飼料質(zhì)量安全提供有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青貯玉米飼料為市售，共10 份，使用研磨儀粉碎，于2～4 ℃冷藏；敵敵畏、速滅磷、異丙威、禾草敵、硫磷嗪、滅線磷、治螟磷、久效磷、甲拌磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、五氯硝基苯、殺撲磷、三唑磷、特丁硫磷、毒死蜱、對硫磷、苯硫磷、伐滅磷標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98.0%，購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司；乙腈（色譜純）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）購自天津海昌試劑有限公司；丙酮、乙酸乙酯（色譜純）購自德國Dr. Ehrensorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QP-2020 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀購自日本島津公司；Fritsch 可變速高速旋轉(zhuǎn)粉碎機購自北京飛馳科學(xué)儀器有限公司；DMT-2500 多管旋渦混勻儀購自南京互川電子有限公司；LD5-2A臺式冷凍離心機購自常州杰博森儀器有限公司；ESJ220-4A 全自動電子分析天平購自沈陽龍騰電子有限公司；STRIKE 385旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；Smart2Pure 超純水儀購自上海宏宇儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

貯備液：分別稱取農(nóng)藥對照品10.000 mg（精確至0.001 mg）于1 000 mL 容量瓶中，使用乙酸乙酯定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.01 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

曲線工作液：分別吸取5、10、20、50、100 μL標(biāo)準(zhǔn)貯備液于1.0 mL 容量瓶中，使用陰性樣品提取液定容至刻度，即得0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 單因素試驗

以檢測農(nóng)藥的平均回收率為指標(biāo)，分別設(shè)置提取方法（超聲波萃取、QuEChERS 前處理、加速溶劑萃取）、提取溶劑（丙酮、乙酸乙酯、乙腈）和凈化劑［A 組為25 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）+35 mg十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）+20 mg 石墨化炭黑（GCB）+200 mg 無水MgSO4、B 組為50 mg PSA+75 mg C18+40 mg GCB+200 mg 無水MgSO4、C 組為80 mg PSA+110 mg C18+80 mg GCB+200 mg無水MgSO4）］為考察因素進行單因素試驗。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取提取方法（A）、提取溶劑（B）、凈化劑種類（C）進行3因素3水平的正交試驗[10]，正交試驗的因素水平設(shè)計見表1。超聲波萃取條件為稱取5.0 g樣品于100 mL具塞試管中，加入10 mL乙腈后于超聲提取儀中提取，提取溫度為35 ℃、功率150 W、提取時間為10 min；加速溶劑萃取條件為稱取5.0 g 樣品與2.0 g硅藻土混勻后于加速溶劑萃儀中提取，萃取壓力為10.34 MPa、溫度為80 ℃，使用10 mL 乙腈靜態(tài)萃取10 min。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計

1.3.4 樣品的QuEChERS前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g 粉碎后的樣品，加入10 mL 乙腈溶劑旋渦振蕩提取30 min，加入4 g 氯化鈉，劇烈振蕩15 min，以5 000 r/min 的速度離心10 min。移取上清液2.0 mL 加入盛有50 mg PSA、75 mg C18、40 mg GCB、200 mg 無水硫酸鎂的離心管中，旋渦振蕩10 min，以8 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，供GC-MS/MS測定。

1.3.5 儀器條件

1.3.5.1 氣相色譜條件

毛細(xì)管柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），溶劑延遲時間3 min，進樣口溫度250 ℃，進樣方式為不分流進樣。柱溫程序為初始溫度為70 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升溫至160 ℃，以8 ℃/min 升溫至280 ℃，保留6 min。載氣為高純氦氣，純度≥99.999%。載氣控制方式恒線速度，線速度為47.6 cm/s。高壓進樣壓力250 kPa，柱流量1.05 mL/min，進樣量：1 μL。

1.3.5.2 質(zhì)譜條件

電離方式為電子轟擊源（electron impact, EI)，離子源溫度200 ℃。碰撞誘導(dǎo)解離氣為高純氬氣，純度≥99.999%。色譜質(zhì)譜接口溫度250 ℃，電離能量70 eV，檢測器電壓1.5 kV，采集方式多反應(yīng)監(jiān)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選取一種青貯玉米飼料樣品為基質(zhì)，準(zhǔn)確稱取5.0 g粉碎后的樣品于50 mL 離心管中，加入10 mg/L 的20 種農(nóng)藥混標(biāo)溶液10 μL，按照1.3.3 節(jié)方法對樣品前處理及上機分析。在質(zhì)荷比為40～500 amu 范圍內(nèi)進行全掃描，得到20 種農(nóng)藥的總離子流色譜圖，見圖1。根據(jù)全掃描數(shù)據(jù)確定各目標(biāo)化合物的母離子和保留時間，采用子離子掃描方式得到產(chǎn)物離子，優(yōu)化碰撞能量獲得響應(yīng)最高的子離子。

利用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描，選擇質(zhì)荷比較大、豐度較強的兩對特征離子作為定量和定性離子。為獲得最佳的質(zhì)譜條件確保各目標(biāo)化合物定性和定量的準(zhǔn)確性，對目標(biāo)化合物的母離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量等質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，獲得較理想的質(zhì)譜條件及分離效果。20 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)優(yōu)化后得到的質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

表2 20種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)優(yōu)化后得到的質(zhì)譜條件參數(shù)

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取方法對檢測農(nóng)藥平均回收率的影響（見圖2）

圖2 提取方法對回收率的影響

由圖2可知，超聲波萃取、QuEChERS萃取、加速溶劑萃取的平均回收率分別為85.34%、89.87%、84.43%。超聲波萃取與加速溶劑萃取能耗較高、溶劑用量較大，且對樣品萃取后農(nóng)藥平均回收率低于QuEChERS 萃取。因此，本試驗選擇QuEChERS萃取作為樣品的提取方法。

2.2.2 提取溶劑對檢測農(nóng)藥平均回收率的影響（見圖3）

圖3 提取溶劑對回收率的影響

由圖3 可知，丙酮、乙酸乙酯、乙腈作為樣品的萃取溶劑時，農(nóng)藥平均回收率分別為85.67%、83.12%、89.87%。因此，選擇乙腈作為樣品的萃取溶劑。

2.2.3 凈化劑對檢測農(nóng)藥平均回收率的影響（見圖4）

圖4 凈化劑對回收率的影響

由圖4 可知，選擇3 組凈化劑對樣品提取液進行凈化，A 組、B 組、C 組農(nóng)藥平均回收率分別為84.56%、89.54%、85.26%。因此，選擇農(nóng)藥平均回收率較高的B組作為凈化劑。

2.3 正交試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果（見表3、表4）

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

由表3、表4及F檢驗結(jié)果分析可知，提取溶劑（B）與凈化劑（C）對農(nóng)藥加標(biāo)平均回收率具有顯著影響（P＜0.05），而提取方法（A）對農(nóng)藥加標(biāo)平均回收率的作用不顯著（P＞0.05）。各因素對農(nóng)藥平均回收率的影響順序為C＞B＞A，即凈化劑＞提取溶劑＞提取方法。通過k值比較得到本試驗最佳因素組合為A2B3C2。驗證試驗測得20種農(nóng)藥的平均回收率為89.45%，高于表3中20種農(nóng)藥平均回收率的最大值85.71%。因此，該正交試驗的最佳條件確定為A2B3C2，即選擇QuEChERS 作為樣品提取方法、提取溶劑為乙腈、凈化劑為50 mg PSA+75 mg C18+40 mg GCB+200 mg無水MgSO4進行后續(xù)試驗。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性回歸方程、檢出限及定量限

將標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點工作液經(jīng)適當(dāng)稀釋后加入5.0 g陰性飼料樣品中，按照1.3節(jié)步驟操作得到樣品提取液進行上機分析，以其產(chǎn)生的3倍信噪比（S/N=3）計算方法檢出限[11-13]，10倍信噪比（S/N=10）計算方法定量限[14-17]。各農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、方法檢出限以及方法定量限見表5。

表5 各農(nóng)藥的回歸方程及相關(guān)信息

由表5可知，在質(zhì)量濃度為0.05～1.00 mg/L范圍內(nèi)方法線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.996 4～0.999 9，方法檢出限為0.124～5.324 μg/kg，方法定量限為0.413～14.11 μg/kg，符合痕量分析要求。

2.4.2 精密度和加標(biāo)回收率試驗

選取其中一種飼料樣品（編號：S1）為基質(zhì)，加入20 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，其加標(biāo)水平為20、60、100 μg/kg，測定加標(biāo)回收率與精密度，各水平重復(fù)測定6 次，計算加標(biāo)平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法的精密度，20 種農(nóng)藥的精密度和加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表6。

表6 20種農(nóng)藥的精密度和加標(biāo)回收率試驗（n=6）

由表6 可知，各農(nóng)藥的加標(biāo)平均回收率為76.35%～104.56%，回收率試驗結(jié)果RSD為0.89%～11.45%（n=6），符合痕量分析要求。

2.5 實際樣品檢測

利用上述所建立的方法對市售10批次青貯玉米飼料進行農(nóng)藥殘留檢測分析，檢測結(jié)果見表7。

表7 飼料樣品的檢測結(jié)果 單位：mg/kg

由表7 可知，所測樣品均有不同程度農(nóng)藥檢出呈陽性，主要包括敵敵畏、久效磷、甲拌磷、馬拉硫磷、毒死蜱、對硫磷。所測樣品中敵敵畏、毒死蜱的檢出率最高均為50%，含量分別為0.019～0.044、0.037～0.078 mg/kg；久效磷與馬拉硫磷的檢出率均為40%，其含量值分別為0.018～0.051、0.012～0.037 mg/kg；甲拌磷與對硫磷的檢出率均為30%，其含量分別為0.045～0.125、0.019 9～0.095 0 mg/kg。

根據(jù)《國際食品飼料中農(nóng)藥殘留限量法規(guī)》的相關(guān)規(guī)定，擬定敵敵畏、久效磷、甲拌磷、馬拉硫磷、毒死蜱、對硫磷的最大殘留限量值（MRLs）分別為0.2、0.2、1.0、0.1、0.5、0.6 mg/kg，所檢測樣品中呈陽性的農(nóng)藥均未超過相應(yīng)規(guī)定限量值。

3 討論

農(nóng)產(chǎn)品樣品組織復(fù)雜，基質(zhì)成分與目標(biāo)物相差較大，并且存在農(nóng)藥的同系物、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物和軛合物的影響，從而增加了農(nóng)藥殘留分析的難度。農(nóng)藥殘留分析中需要盡可能地將目標(biāo)物溶入提取液中，通過凈化劑去除提取液中雜質(zhì)的干擾，減少雜質(zhì)色譜峰的影響，避免對色譜柱和檢測器的污染。因此，在農(nóng)藥殘留分析中，根據(jù)不同樣品的性質(zhì)選擇不同提取溶劑及凈化劑種類對分析結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。當(dāng)提取溶劑及凈化劑種類確定后，選擇不同提取方法均能滿足《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）及《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告2386 號）中相應(yīng)參數(shù)要求。李志等[18]選擇正己烷作為提取溶劑、PSA-C18(1∶1）作為凈化劑，探討超聲波萃取、QuEChERS 前處理、加速溶劑萃取等不同提取方法對刺梨中15 種有機氯農(nóng)藥的殘留分析。結(jié)果顯示，3 種提取方法的回收均滿足農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥痕量分析要求。高效的提取試劑和凈化材料可以適應(yīng)現(xiàn)代化檢測需求的新方法，在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究采用市售10 批次青貯玉米飼料為研究對象，采用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法對10批次青貯玉米飼料中的20種農(nóng)藥殘留進行定性、定量分析。該方法前處理操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高，各農(nóng)藥在質(zhì)量濃度為0.05～1.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2≥0.996 4，方法檢出限為0.124～5.324 μg/kg，方法定量限為0.413～14.110 μg/kg。20 種農(nóng)藥在20、60、100 μg/kg 的加標(biāo)濃度下，各農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率為76.35%～104.56%，回收率試驗結(jié)果RSD為0.89%～11.45%(n=6)。相比傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測方法，該方法具有消除基質(zhì)干擾、減少假陽性檢出率、提高分析檢測效率、降低分析成本的優(yōu)點，能夠為飼料質(zhì)量安全提供有效的檢測。