顏元 劉傲 楊成 劉麗娜 王磊 黃靜

(貴州醫(yī)科大學藥學院,貴州 貴陽 550025)

羧甲司坦是一種粘液溶解劑,主要作用于支氣管腺體的分泌,增加低粘度的唾液粘蛋白分泌,減少高粘度的巖藻粘蛋白的產(chǎn)生,從而降低痰液的粘稠性,同時可增加黏膜纖毛的轉(zhuǎn)運,從而致使痰液易排出[1-2],目前廣泛用于以痰粘液分泌過多為特征的呼吸系統(tǒng)疾病[3],此外羧甲司坦可通過降低Muc5ac和Muc5b的分泌,恢復Muc5b蛋白水平,從而改善患者肺功能,減輕炎癥反應[4]。但由于羧甲司坦半衰期較短,當前市售的劑型(包括普通片劑、顆粒劑、溶液劑及泡騰劑)均需要一天多次給藥,極大降低了患者(尤其是老年患者)的依從性和順應性,因此將羧甲司坦制成緩釋劑型不僅能減少患者服藥次數(shù),提高患者順應性,服用方便,同時也能使其在體內(nèi)緩慢平穩(wěn)的釋放,保持血藥濃度平穩(wěn),避免出現(xiàn)峰谷現(xiàn)象,降低毒副作用及程度,從而提高患者臨床用藥的安全性。課題組前期已對羧甲司坦緩釋片進行研究,結果表明其具有一定的緩釋作用[5-6],基于此,課題組現(xiàn)階段正在進行羧甲司坦微囊的研究,以期進一步提高羧甲司坦的緩釋作用,在此基礎上本研究以羧甲司坦微囊作為研究對象,采用紫外分光光度法和高效液相色譜法兩種方法對其進行含量測定研究,建立合理、準確的含量測定方法測定羧甲司坦微囊中羧甲司坦的含量,為后續(xù)羧甲司坦微囊的處方及制備工藝篩選提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1實驗儀器 電熱恒溫水浴鍋(山東博科再生醫(yī)學有限公司,型號:DK-8D),高效液相色譜儀(島津儀器蘇州有限公司,型號:SIL-I6),紫外可見分光光度計(島津儀器(蘇州)有限公司),型號:UV-2700)),電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,感量:0.01 mg]。

1.2試藥 羧甲司坦標準物質(zhì)(上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司,批號:12202865222),磷酸二氫鈉(國藥集團化學試劑有限公,批號:20200616),磷酸氫二鈉(國藥集團化學試劑有限公,批號:10000318),茚三酮(湖北健楚生物醫(yī)藥有限公司,批號:301302012),甲醇(Merck KGaA,批號:20210818),羧甲司坦微囊(自制)。

2 方法與結果

2.1溶液的配制

2.1.1pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液配制 分別精密稱定磷酸氫二鈉2.70 g、氯化鈉1.70 g、磷酸二氫鈉1.74 g,加適量水溶解后,稀釋至400 mL。

2.1.2紫外分光光度法對照品溶液的制備 精密稱定羧甲司坦對照品0.1 g溶于20 mL pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液中,搖勻。精密量取4 mL于50 mL容量瓶中,加入pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度。

2.1.3高效液相色譜法對照品溶液的制備 精密稱定羧甲司坦對照品0.1 g于100 mL容量瓶中,加入pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液水浴加熱溶解并稀釋至刻度。

2.1.4高效液相色譜法供試品溶液的制備 精密稱定羧甲司坦微囊0.1 g溶于100 mL pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液中,過濾;精密量取濾液0.3 mL于25 mL容量瓶中,加pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度。

2.1.5空白樣品溶液 按處方比例精密稱定各輔料適量,混勻,放入50 mL容量瓶中,加入pH 6.6磷酸鹽緩沖水浴加熱液溶解并稀釋至刻度。

2.1.6茚三酮溶液配制 精密稱定茚三酮1.0 g放入50 mL量瓶,加適量乙醇溶解,加水稀釋至刻度,即得2%的茚三酮溶液。

2.2紫外-可見分光光度法的建立

2.2.1專屬性的考察 精密量取“2.1.2”項下對照品溶液2 mL至25 mL容量瓶中,加入2%茚三酮溶液1 mL,加入pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液定容,搖勻;水浴加熱20 min,置于冰水浴中迅速冷卻。精密量取“2.1.5”項下空白樣品溶液2 mL至25 mL容量瓶中,加入pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液定容,搖勻。以溶劑為空白對照,以紫外分光光度法在200～800 nm之間進行全波長掃描,比較羧甲司坦與輔料的最大吸收峰重疊程度。由圖1可知,羧甲司坦與茚三酮絡合物最大吸收峰在567 nm波長處,輔料在此處幾乎無吸收,輔料對測定無干擾,因此選擇567 nm作為測定波長。

圖1 羧甲司坦對照品及輔料UV掃描圖

2.2.2顯色時間的考察 精密稱定羧甲司坦0.1 g溶于20 mL pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液中,搖勻。精密量取4 mL三份于25 mL容量瓶中,各加入2%茚三酮試劑1 mL,用pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液定容至刻度,搖勻。水浴加熱15 min、20 min、25 min及30 min,置于冰水浴中迅速冷卻,觀察顏色變化。分別對羧甲司坦對照品溶液加熱15 min、20 min、25 min及30 min后,發(fā)現(xiàn)加熱15 min時溶液變?yōu)樽霞t色,冷卻至室溫變?yōu)闊o色透明,顯色反應進行不完全,未測出吸光度值;加熱20 min、25 min與30 min時溶液變?yōu)樽霞t色,冷卻至室溫溶液不褪色,顯色反應進行完全且測定結果穩(wěn)定,因此以20 min作為顯色時間。

2.2.3顯色劑的用量考察 精密稱定羧甲司坦0.1 g溶于20 mL pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液,搖勻。取4 mL三份溶液于25 mL容量瓶中,分別加入2%茚三酮試劑0.5 mL、1.0 mL及2.0 mL,加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液定容至刻度,搖勻。水浴加熱20 min,置于冰水浴中迅速冷卻,以溶劑為空白對照,在最大吸收波長處測定吸光度值,以吸光度值恰當者確定顯色劑用量。由表1可知,隨著顯色劑的用量的增加,吸光度值呈上升趨勢,以1 mL顯色劑用量時吸光度值最佳,因此選擇1 mL作為顯色劑用量。

表1 顯色劑用量測定結果

2.2.4標準曲線的制備 分別精密量取對照品溶液2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL及5.0 mL于25 mL容量瓶中,各加入1 mL 2%茚三酮溶液,以pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液定容,搖勻。水浴加熱20 min,迅速置于冰水浴中放置至室溫,以溶劑為空白對照,在最大吸收波長處測定吸光度,以吸光度值A為縱坐標,羧甲司坦的濃度C為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:A=0.0224c-0.5804,R2=0.999,在32.10～80.24 μg/mL濃度范圍內(nèi),羧甲司坦的濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.2.5精密度的測定 分別精密量取2.0 mL、3.0 mL及4.0 mL的對照品溶液,加入1 mL 2%茚三酮溶液,用pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液定容,搖勻,水浴加熱20 min,迅速置于冰水浴中放置至室溫。以溶劑為空白對照,在最大吸收波長處測定吸光度值,1天內(nèi)測定5次,計算日內(nèi)精密度;每天測一次,連續(xù)測定3次,計算日間精密度,計算RSD。精密度測定結果:日內(nèi)精密度的吸光度RSD分別為1.52%、1.36%和1.13%;日間精密度的吸光度RSD分別為4.65%,5.85%及6.85%,結果表明精密度良好。

2.2.6重復性的測定 精密量取對照品溶液6份,各3.0 mL至25 mL容量瓶中,加入1 mL 2%茚三酮溶液,加入適量的pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液,定容,搖勻。水浴加熱20 min,迅速置于冰水浴中放置至室溫,以溶劑為空白對照,在最大吸收波長處測定吸光值,計算RSD。重復性測定結果如表2所示:測定結果的RSD為3.2%,結果表明重復性良好。

表2 重復性實驗結果

2.2.7穩(wěn)定性的測定 精密量取對照品溶液3.0 mL至25 mL容量瓶中,加入1 mL 2%茚三酮溶液,加入pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液,定容,搖勻。水浴加熱20 min,迅速置于冰水浴中放置至室溫,以溶劑為空白對照,在0、2、4、6和8 h測定吸光值,計算RSD。穩(wěn)定性測定結果如表3所示:測定結果的RSD為3.31%,結果表明樣品穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性實驗結果

2.2.8回收率的測定 精密量取羧甲司坦對照品溶液2.0 mL、3.0 mL和4.0 mL于三個25 mL容量瓶中,各加入適量空白樣品溶液,加入1 mL 2%茚三酮溶液,用pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液定容,搖勻,水浴加熱20 min,迅速置于冰水浴中放置至室溫,以溶劑為空白對照,在最大吸收波長處測定吸光度值,計算RSD。由表4結果顯示:羧甲司坦的平均回收率為96.65%,RSD%為1.48%,表明其回收率良好。

表4 回收率實驗結果

2.2.9樣品含量測定 分別精密稱定三批羧甲司坦微囊各0.1 g溶于20 mL pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液中,過濾。分別精密量取濾液0.5 mL置于25 mL容量瓶中,各加入1 mL 2%茚三酮溶液,加入pH 6.6磷酸鹽緩沖液,定容,搖勻。水浴加熱20 min,迅速置于冰水浴中放置至室溫,以溶劑為空白對照,在最大吸收波長下測定吸光度值。利用回歸方程計算各樣品的羧甲司坦含量。自制羧甲司坦微囊的含量測定結果如表5所示:結果表明羧甲司坦緩釋微囊的含量測定結果符合要求,建立的含量測定方法可靠。

表5 羧甲司坦緩釋微囊含量的測定結果

2.3高效液相色譜法的建立

2.3.1色譜條件 色譜柱:WondaCract ODS-2 C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動相:pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液;流速:1 mL/min;檢測波長:210 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL。

2.3.2專屬性 精密量取“2.1.3”“2.1.4”“2.1.5”項下對照品溶液,供試品溶液,空白樣品溶液,各進樣20 μL,記錄色譜圖。由圖2、圖3和圖4可知,在210 nm下掃描,羧甲司坦微囊供試品和羧甲司坦對照品保留時間為2.93 min左右,輔料對其測定無影響,專屬性良好。

圖2 空白樣品溶液色譜圖

圖3 供試品溶液色譜圖

圖4 對照品溶液色譜圖

2.3.3標準曲線的制備 分別精密量取羧甲司坦對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL,0.6 mL和0.7 mL置于25 mL容量瓶中,用pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。注入高效液相色譜儀20 μL進樣,在210 nm檢測波長下,測定峰面積。以峰面積值A為縱坐標,羧甲司坦的濃度C為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:A=7432.5c-8452.1,R2=0.9994,在4.08～28.56 μg/mL濃度范圍內(nèi),羧甲司坦的峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.3.4精密度的測定 分別精密量取羧甲司坦對照品溶液0.2 mL、0.4 mL和0.6 mL置于25 mL容量瓶中,用pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。注入高效液相色譜儀20 μL進樣,測定峰面積,一天內(nèi)測5次,計算日間精密度;每天測一次,連續(xù)測定3次,計算日間精密度,計算RSD。精密度實驗結果如表6和表7所示:日內(nèi)精密度的峰面積RSD分別為0.59%、0.5%和0.6%,日間精密度的峰面積RSD分別為0.61%、0.37%和0.29%,結果表明精密度良好。

表6 日內(nèi)精密度實驗結果

表7 日間精密度實驗結果

2.3.5穩(wěn)定性的測定 精密量取羧甲司坦對照品溶液0.5 mL,分別于0、2、4,6、8、12 ,24 h內(nèi)注入高效液相色譜儀20 μL進樣,測定峰面積,計算RSD。穩(wěn)定性測定結果如表8所示:峰面積測定結果的RSD為1.02%,結果表明樣品穩(wěn)定性良好。

表8 穩(wěn)定性實驗結果

2.3.6重復性的測定 分別精密量取羧甲司坦對照品溶液0.5 mL 6份,分別注入高效液相色譜儀20 μL進樣,測定峰面積,計算RSD。重復性測定結果如表9所示:峰面積測定結果RSD為0.56%,結果表明重復性良好。

表9 重復性實驗結果

2.3.7加樣回收率的測定 精密稱定已知含量的羧甲司坦微囊共9份,向其中分別加入相當于羧甲司坦微囊含量 80%、100%和120%的羧甲司坦對照品溶液,各3份平行樣。分別注入高效液相色譜儀20 μL測定,計算回收率,計算RSD?；厥章蕼y定結果如表10所示:羧甲司坦的回收率為95.01%,RSD為1.90%結果表明回收率良好。

表10 回收率實驗結果

2.3.8樣品的含量測定 精密稱定3批自制羧甲司坦微囊,按照“2.1.4”項下供試品溶液制備方法制備樣品溶液3份,分別注入高效液相色譜儀20 μL,測定峰面積,根據(jù)回歸方程計算羧甲司坦微囊的含量。計算RSD。自制羧甲司坦微囊的含量測定結果如表11所示:結果表明羧甲司坦緩釋微囊的含量測定結果符合要求,建立的含量測定方法可靠。

表11 羧甲司坦微囊含量測定的實驗結果

3 討 論

將藥物制成緩釋制劑不僅可維持血藥濃度的穩(wěn)定,提高患者依從性以及生物利用度,同時也可減少給藥總量[7]。本研究通過建立羧甲司坦微囊含量測定發(fā)法,以為后期羧甲司坦微囊處方、制備工藝的優(yōu)化提供了實驗依據(jù)。既往研究[8-9]表明,應用HPLC測定羧甲司坦含量時可予pH 2.0磷酸鹽緩沖液和pH 3.0磷酸鹽緩沖溶液作為流動相,但本研究考慮流動相pH過低易導致色譜柱耐受性降低,極大降低其使用壽命。盡管羧甲司坦可溶于熱水,但易導致其峰面積值極不穩(wěn)定。本研究前期實驗表明羧甲司坦在pH 6.6磷酸鹽緩沖液穩(wěn)定性良好,且羧甲司坦主峰和雜質(zhì)峰分離較好,溶劑和輔料對主峰無影響。故最終采用pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液作為流動相。從表5及表11的結果表明,本研究所采用的兩種含量測定方法得出的含量測定結果均符合要求,建立的含量測定方法可靠,因此紫外分光光度法和高效液相色譜法均可作為羧甲司坦微囊含量的測定方法。雖然高效液相色譜法的RSD較紫外分光光度法小,精密度、靈敏度較UV更高,但UV相對于HPLC具有操作簡便,儀器簡單,分析速度快,成本低等優(yōu)點,因此,應充分利用兩種方法。

綜上所述,本試驗建立了羧甲司坦微囊的紫外分光光度法和高效液相色譜法兩種含量測定方法,其操作方法簡單,方便,穩(wěn)定,可靠,重現(xiàn)性好,為該制劑的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。