周 珊，普 芳，張值偉，趙 蘭，唐 彥

（云南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650051）

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中被認(rèn)為是機(jī)體接觸變應(yīng)原后主要由特異性免疫蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎癥[1]，故又稱之為變應(yīng)性鼻炎，在中醫(yī)學(xué)中屬于“鼻鼽”范疇，其具有發(fā)病率高、不易根治的特點(diǎn)[2]。在中醫(yī)學(xué)上，小兒鼻鼽的主要病因?yàn)檎龤馓撊?、外邪入侵，與氣候、地域、體質(zhì)關(guān)系密不可分，病位主要在肺脾腎，病機(jī)多以本虛標(biāo)實(shí)為主[3]。

蟲類藥因其具有搜風(fēng)、通絡(luò)、活血化瘀之功，成為治療鼻鼽的常用藥[4-5]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)蟬蛻、地龍、僵蠶等蟲類藥具有抗過敏的功效，廣泛應(yīng)用于過敏性疾病的治療中[6-10]。故深入研究含蟲類藥物組方核心藥對(duì)治療過敏性鼻炎的分子機(jī)制將更有利于其臨床應(yīng)用。

本研究通過收集治療兒童AR 的含蟲類藥物組方，并運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘手段以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的科學(xué)方法，發(fā)掘蟲類藥物治療兒童AR 的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制，并期望為相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 以“小兒過敏性鼻炎”“小兒變應(yīng)性鼻炎”“兒童過敏性鼻炎”“兒童變應(yīng)性鼻炎”“小兒鼻鼽”為初步搜索詞，查找2000—2022 年中國學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）內(nèi)的論文，獲取與小兒AR 有關(guān)的研究論文。以“中醫(yī)”“中西醫(yī)結(jié)合”“中藥”“蟲類藥物”“治療”等為檢索關(guān)鍵詞，進(jìn)行二次檢索，以獲取含蟲類藥物組方防治兒童AR 的有關(guān)論文。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①中醫(yī)治療兒童AR 的醫(yī)學(xué)研究成果及個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的論文。②論文中治療兒童AR的內(nèi)服藥物方劑中含有蟲類藥。③不限劑型。④對(duì)同一人撰寫內(nèi)容基本相同的論文，取其藥物組成相對(duì)詳備的論文。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、理論研究、綜述類的論文。②藥物組成不明確的論文。③疾病預(yù)防用藥或誤診用藥論文。

1.4 數(shù)據(jù)的整理與錄入 通過初步的文獻(xiàn)檢索與篩選之后，可獲得含蟲類藥物組方治療兒童AR 的文獻(xiàn)97 篇，共獲得含蟲類藥物組方102 個(gè)，其中重復(fù)處方13 個(gè)，最終納入處方89 個(gè)。錄入數(shù)據(jù)時(shí)，涉及到的中藥參照《中華人民共和國藥典（2020 版）》[11]及全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[12]統(tǒng)一規(guī)范名稱，如：“蟬衣、蟬殼、蟲退”統(tǒng)一為“蟬蛻”，“雙花”統(tǒng)一為“金銀花”，“南豆花”統(tǒng)一為“扁豆花”等，并對(duì)藥物名稱進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.5 數(shù)據(jù)挖掘 運(yùn)用古今醫(yī)案云平臺(tái)網(wǎng)頁版，將89個(gè)含蟲類藥物組方數(shù)據(jù)輸入“醫(yī)案管理”中的“分析池”，組方信息數(shù)據(jù)由兩人共同錄入并核對(duì)。然后將數(shù)據(jù)進(jìn)行用藥配伍規(guī)律分析，利用藥物頻數(shù)分析、藥物關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)核心藥對(duì)。

1.6 藥對(duì)成分收集 將1.5 中發(fā)現(xiàn)的核心藥對(duì)，即辛夷-蟬蛻，作為研究對(duì)象，并通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）查詢辛夷-蟬蛻所有活性成分，并依據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（ADME）：辛夷口服利用度OB≥30%，蟬蛻口服利用度OB≥20%，藥物相似性（DL）≥0.18，由此作為化合物分子的篩選條件，篩選出藥物中的有效化學(xué)成分。

1.7 藥對(duì)靶點(diǎn)收集 通過藥物中有效成分的MOL ID 檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫中有效成分對(duì)應(yīng)的藥物作用靶點(diǎn)名稱?；谒幬镒饔冒悬c(diǎn)名稱通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）查找UniProt KB 中其所對(duì)應(yīng)的UniProt ID 和基因名稱，由此構(gòu)建藥物有效成分-靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫。

1.8 疾病靶點(diǎn)收集 使用“allergic rhinitis”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）和TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd）檢索及篩選靶點(diǎn)基因，找到AR 的疾病潛在靶點(diǎn)基因。

1.9 基因映射 將AR 的疾病潛在靶點(diǎn)基因與核心藥對(duì)靶點(diǎn)基因，輸入Venn Diagrams 系統(tǒng)（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）通過制作疾病藥物的韋恩圖，可以檢測(cè)出交集靶點(diǎn)基因，即核心藥對(duì)與AR 的聯(lián)合影響的靶點(diǎn)基因，是藥對(duì)治療疾病的靶點(diǎn)基因。

1.10 核心藥對(duì)成分-疾病靶點(diǎn)復(fù)合網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.9 中獲得的交集靶點(diǎn)基因輸入到Cytoscape 3.8.0（www.cytoscape.org）軟件，以形成核心藥對(duì)治療AR成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.11 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶基因篩選 將交集靶點(diǎn)基因提交至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫（http：//stringdb.org），屬性選擇為人類，篩選評(píng)分≥0.4 構(gòu)建辛夷-蟬蛻治療AR 的靶基因蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape 3.8.0 軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，通過degree 值測(cè)試出核心靶基因。

1.12 GO 富集分析與KEGG 信號(hào)通路分析 通過Metascape（http：//metascape.org）對(duì)1.6 中篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因生物過程（GO）富集分析與信號(hào)通路（KEGG）富集分析，生物過程（GO）富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細(xì)胞組分（cellular component，CC）3個(gè)功能層次。使用微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn）對(duì)結(jié)果實(shí)現(xiàn)可視化管理。根據(jù)P 值篩選出核心藥對(duì)治療AR 的靶點(diǎn)的GO、KEGG 過程，進(jìn)而明確該藥對(duì)治療AR 的影響機(jī)理。

2 結(jié)果

2.1 藥物頻數(shù)分析 納入統(tǒng)計(jì)的97 篇文獻(xiàn)中含有89 個(gè)處方，共計(jì)156 味藥物，其中使用頻數(shù)較高的前16 味藥物為辛夷、蟬蛻、防風(fēng)、甘草、白芷、蒼耳子、黃芪、白術(shù)、黃芩、烏梅、細(xì)辛、僵蠶、地龍、麻黃、五味子、茯苓，頻數(shù)均在20 次以上，使用率達(dá)22.47%以上。見表1。

表1 含蟲類藥物組方治療兒童AR 的藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.2 藥物關(guān)聯(lián)分析 對(duì)使用頻次≥20 次的藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析后，建立支持度≥0.20，置信度≥0.50的藥物組合。結(jié)合頻數(shù)統(tǒng)計(jì)及關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果分析，可確定辛夷-蟬蛻為含蟲類組方治療兒童AR 的核心藥對(duì)。見表2。

2.3 辛夷-蟬蛻主要成分及靶點(diǎn)的篩選 通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫中辛夷-蟬蛻所有活性成分，在設(shè)置藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)后所獲得的活性成分分別為辛夷15個(gè)、蟬蛻3 個(gè)，去除重復(fù)值，得到辛夷-蟬蛻藥對(duì)含有有效成分18 個(gè)?；谟行С煞值腗OL ID 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到其對(duì)應(yīng)的藥物作用靶點(diǎn)分別為辛夷34 個(gè)、蟬蛻27 個(gè)，通過去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到辛夷-蟬蛻藥對(duì)的作用靶點(diǎn)52 個(gè)。

2.4 辛夷-蟬蛻與過敏性鼻炎共有靶點(diǎn)的篩選 將“allergic rhinitis”作為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards（http：//www.genecards.org）及TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd）檢索后獲得過敏性鼻炎相關(guān)疾病靶點(diǎn)，通過去重后得到1 954 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將1 954 個(gè)疾病靶點(diǎn)與52 個(gè)辛夷-蟬蛻藥對(duì)的作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入jvenn 系統(tǒng)（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）在線制作疾病藥物韋恩圖，獲得辛夷-蟬蛻藥對(duì)與過敏性鼻炎共有靶點(diǎn)11 個(gè)。見圖1。

圖1 辛夷-蟬蛻藥對(duì)與過敏性鼻炎共有靶點(diǎn)韋恩圖

2.5 辛夷-蟬蛻治療AR 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將辛夷、蟬蛻的18 個(gè)共有有效活性成分，以及辛夷、蟬蛻、疾病11 個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，得到辛夷-蟬蛻治療AR 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。結(jié)果顯示，以化合物MOL000313（Galgravin）及化合物MOL012131（異二氫風(fēng)藤奎醇A）的靶點(diǎn)最多，各有6個(gè)；其次為MOL012123 （脫烷醇內(nèi)酯A）4 個(gè)，MOL000105（原兒茶酸）、MOL012112（去甲檳榔堿）、MOL012125（脫烷醇內(nèi)酯C）、MOL000314（二苯基四氫呋喃衍生物）各有3 個(gè)，可得出這7 個(gè)化合物可能是辛夷-蟬蛻治療AR 的核心成分。且從該圖中發(fā)現(xiàn)在11 個(gè)作用靶點(diǎn)中有6 個(gè)靶點(diǎn)與2 種以上活性成分相連。

圖2 辛夷-蟬蛻治療AR 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)分析 通過STRING 數(shù)據(jù)庫，對(duì)已獲得的共有靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)辛夷-蟬蛻治療AR 的靶點(diǎn)基因有11個(gè)。此時(shí)，將Degree 值設(shè)置為大于6，此時(shí)得出的靶點(diǎn)被認(rèn)為是核心靶點(diǎn)，包括CHRM5、ALOX5、ADRB2、PTGS1、NOS2、PTGS2、CHRM3、CHRM2、KCNH2、ADRA2C 等10 個(gè)靶點(diǎn)基因，據(jù)此推測(cè)這些可能是辛夷-蟬蛻治療AR 的核心靶點(diǎn)基因。見圖3。

圖3 辛夷-蟬蛻治療AR 的靶基因PPI 互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 生物過程及通路富集結(jié)果 將辛夷-蟬蛻藥對(duì)與AR 共有的10 個(gè)核心靶點(diǎn)基因?qū)雖etascape 數(shù)據(jù)庫，并對(duì)其進(jìn)行KEGG 富集分析及3 個(gè)GO 富集分析。結(jié)果顯示，辛夷-蟬蛻藥對(duì)治療AR 主要通過G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路、平滑肌收縮的調(diào)節(jié)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、突觸后膜、5-羥色胺受體活性、G 蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、乙酰膽堿受體活性等生物調(diào)節(jié)過程，見圖4。對(duì)其進(jìn)行的KEGG 分析結(jié)果顯示，辛夷-蟬蛻藥對(duì)治療AR主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等信號(hào)通路，見圖5。

圖4 GO 富集分析結(jié)果

圖5 KEGG 富集分析結(jié)果

3 討論

小兒鼻鼽病因復(fù)雜多變，《馮氏錦囊秘錄》中總結(jié)鼻鼽病因病機(jī)為“更有風(fēng)邪客于皮毛，是以津液不收……名曰鼻鼽”，外因多為風(fēng)邪為主的外邪侵襲肺衛(wèi)，其主要內(nèi)因?yàn)椤胺L(fēng)”留于肺臟，外因作用于內(nèi)因合而發(fā)病，以致肺氣失宣出現(xiàn)鼻塞、流涕、鼻癢、噴嚏頻發(fā)、眼癢等癥狀[13]。關(guān)聯(lián)規(guī)則顯示辛夷-蟬蛻藥對(duì)是含蟲類藥物組方治療小兒鼻鼽使用支持度最高的藥對(duì)。陶弘景《本草經(jīng)集注》有曰：“辛夷味辛，溫，無毒，主治五臟身體寒風(fēng)，風(fēng)頭腦痛”，表明辛夷以其散風(fēng)寒之功，能夠達(dá)到宣通鼻竅的之效。黃元御在《玉楸藥解》中指出了“蟬蛻發(fā)表驅(qū)風(fēng)……輕浮發(fā)散，專治皮毛”，且蟬蛻歸肺、肝經(jīng)，具有祛外風(fēng)、息內(nèi)風(fēng)的作用。兩藥配伍使用具有驅(qū)風(fēng)通竅之效，緊扣“外風(fēng)、伏風(fēng)”致本病的病因病機(jī)，充分體現(xiàn)了中藥處方配伍蟲類藥物治療AR 的用藥特點(diǎn)。

在兒童AR 發(fā)病過程中，由各種炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子等構(gòu)成其發(fā)病機(jī)制的生物標(biāo)記物，而這種生物標(biāo)記物體現(xiàn)了兒童AR 發(fā)生的內(nèi)在特性。因此，藥物成分分子作用機(jī)制及其作用靶點(diǎn)的研究可為AR 的精準(zhǔn)治療提供參考和依據(jù)。

本研究顯示，辛夷-蟬蛻藥對(duì)治療AR 的活性成分有化合物MOL000313（Galgravin）、MOL000314（二苯基四氫呋喃衍生物）、MOL012123（脫烷醇內(nèi)酯A）、MOL012125（脫烷醇內(nèi)酯C）等木脂素類成分，化合物MOL012131（異二氫風(fēng)藤奎醇A），MOL000105（原兒茶酸），MOL012112（去甲檳榔堿）等成分。研究發(fā)現(xiàn)Galgravin 等木脂素類化合物能有效抑制血小板活化因子（PAF），具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用[14-16]，而PAF 是促進(jìn)血小板活化作用最強(qiáng)的與炎癥和過敏性反應(yīng)有關(guān)的內(nèi)源性磷脂介質(zhì)。

運(yùn)用Cytoscape 3.8.0 軟件篩選出PPI 互作網(wǎng)絡(luò)中的10 個(gè)核心基因，對(duì)它們進(jìn)行KEGG 富集分析及3 個(gè)GO 富集分析。其中，GO 生物富集分析結(jié)果表明，辛夷-蟬蛻藥對(duì)主要通過影響下列生物調(diào)節(jié)過程從而改善AR：G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路、血液循環(huán)調(diào)節(jié)的生物過程，細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、突觸后膜等細(xì)胞組分，5-羥色胺受體活性、G 蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體活性、乙酰膽堿受體活性等分子功能。

在AR 的發(fā)病過程中，由副交感神經(jīng)釋放的乙酰膽堿具有刺激腺體分泌黏液，擴(kuò)張鼻腔血管的作用，導(dǎo)致鼻腔黏液分泌增多，鼻腔變窄通氣受限，進(jìn)而表現(xiàn)為鼻塞、流涕等癥，經(jīng)研究證實(shí)調(diào)節(jié)G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路，能控制乙酰膽堿的釋放并獲得脫敏的效果[17]，可有效控制AR。鼻黏膜在炎癥病理狀態(tài)下，由于毛細(xì)血管內(nèi)的大量血細(xì)胞聚集而導(dǎo)致血流速率降低，從而導(dǎo)致阻力毛細(xì)血管收縮或小毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管通透性增加，血漿滲出而產(chǎn)生AR 的各種臨床表現(xiàn)[18]，而通過調(diào)節(jié)血液循環(huán)可改善鼻黏膜血管通透性，減少血漿滲出，從而達(dá)到改善AR 癥狀的效果。5-羥色胺受體在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)參與腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)通路、鉀通道等多種信號(hào)通路及調(diào)節(jié)乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)[19]。5-羥色胺受體活性、G 蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體活性、乙酰膽堿受體活性的調(diào)控，均能通過抑制乙酰膽堿受體（M 受體），參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)，減少鼻腔黏液分泌、緩解鼻塞、降低氣道高反應(yīng)性、抗炎，進(jìn)而緩解過敏性鼻炎癥狀[20]。GO富集結(jié)果不僅體現(xiàn)了AR 復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)還體現(xiàn)中藥治療AR 具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)和生物特性。

KEGG 分析結(jié)果顯示，辛夷-蟬蛻藥對(duì)治療AR主要通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。神經(jīng)活性配體-受體相互作用的信號(hào)通路與AR 的發(fā)病有密切聯(lián)系，此通路是質(zhì)膜上一切與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路有關(guān)的受體、配體的集合[21]，它控制并調(diào)節(jié)膽堿能功能、生理節(jié)律、內(nèi)分泌等生物功能[22]，使AR 的癥狀得以改善。鈣信號(hào)通路參與體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，通過調(diào)節(jié)以內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)參與體內(nèi)細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移的過程，且與血管的生成和平滑肌收縮關(guān)系密切[23]，研究顯示鈣離子信號(hào)通路與AR 發(fā)生的致敏階段中T 細(xì)胞的分化關(guān)系密切[24-25]。由此推測(cè)，辛夷-蟬蛻藥對(duì)也能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路這兩條信號(hào)通路，在AR 的治療中發(fā)揮抗炎、抗過敏、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用。

4 結(jié)論

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，檢索到辛夷-蟬蛻藥對(duì)中18 種活性成分及52 個(gè)潛在靶點(diǎn)，藥對(duì)中過敏性鼻炎有關(guān)的靶點(diǎn)有11 個(gè)，核心靶點(diǎn)10 個(gè)。然后進(jìn)一步對(duì)這些靶點(diǎn)開展了GO 生物過程及KEGG 信號(hào)通路富集分析的研究，并由此推測(cè)辛夷-蟬蛻藥對(duì)治療兒童AR 的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與化合物MOL000313（Galgravin）、MOL000314（二苯基四氫呋 喃 衍 生 物）、MOL012123 （脫 烷 醇 內(nèi) 酯A）、MOL012125（脫烷醇內(nèi)酯C）等木脂素類成分及化合物MOL012131（異二氫風(fēng)藤奎醇A）、MOL000105（原兒茶酸）、MOL012112（去甲檳榔堿）等有關(guān)。上述的這些活性成分通過調(diào)節(jié)CHRM5、ALOX5、ADRB2、PTGS1、NOS2、PTGS2、CHRM3、CHRM2、KCNH2、ADRA2C 等靶點(diǎn)，通過調(diào)控G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路、G 蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體活性、乙酰膽堿受體活性及5-羥色胺受體活性、鈣離子信號(hào)通路、調(diào)控神經(jīng)活性配體-受體相互作用等信號(hào)通路，從而抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能，進(jìn)而達(dá)到治療過敏性鼻炎的目的，其作用特點(diǎn)表現(xiàn)為多成分、多靶點(diǎn)、多通路。本課題為研究辛夷-蟬蛻在治療兒童AR方面的藥理藥效機(jī)制進(jìn)行了早期的實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)，其具體的機(jī)理則仍需要通過后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究證明。