郭 爽，李 蓉，夏宗霄，龍小妹，劉海鵬，范 源，3*

（1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650200；3. 云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021）

甲狀腺功能亢進(jìn)癥（簡(jiǎn)稱甲亢），是由甲狀腺本身或甲狀腺以外器官的多種原因引起的甲狀腺激素增多，可進(jìn)入血循環(huán)中作用于全身的組織和器官，造成機(jī)體的神經(jīng)、循環(huán)、消化等系統(tǒng)的興奮性增高，以代謝亢進(jìn)為主要表現(xiàn)的疾病總稱[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，甲狀腺疾病多與患者情志不暢、肝氣郁結(jié)所致的實(shí)火內(nèi)傷存在密切聯(lián)系。甲亢屬于中醫(yī)“癭病”范疇，常見(jiàn)證型有肝火旺盛、心肝陰虛、氣滯痰阻、痰結(jié)血瘀，治療多以疏肝理氣、柔肝化痰、消癭散結(jié)等為基本治則。疏調(diào)氣機(jī)湯為國(guó)醫(yī)大師張震學(xué)術(shù)傳承、指導(dǎo)用藥的經(jīng)典之方，是疏調(diào)人體氣機(jī)理論中“一體兩翼”之代表方，由柴胡、香附、郁金、丹參、川芎、枳殼、白芍、白術(shù)、仙靈脾、茯苓、薄荷、甘草組成，具有疏肝解郁、舒暢氣機(jī)、理氣和血之功能，主治肝郁不舒、氣機(jī)失調(diào)[2]。在臨床治療中，疏調(diào)氣機(jī)湯被廣泛應(yīng)用于腫瘤[3-4]、甲狀腺疾病等的治療[5-6]。疏調(diào)氣機(jī)湯對(duì)甲亢有疏肝理氣等治療功效，對(duì)其病癥顯示出較好的治療作用[7]。血清代謝組學(xué)是研究生物體被擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的學(xué)科，通過(guò)揭示內(nèi)在和外在因素影響下代謝整體的變化軌跡反映發(fā)生病理生理過(guò)程中的一系列生物事件。代謝組學(xué)常被用于藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)、植物代謝差異分析，可為臨床應(yīng)用及食品應(yīng)用中提供參考依據(jù)[8]。在甲亢血清代謝組學(xué)的相關(guān)研究中，能量代謝、蛋白質(zhì)氨基酸代謝、糖代謝和脂代謝等相關(guān)物質(zhì)在大鼠體內(nèi)含量變化明顯[9-11]。本實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)疏調(diào)氣機(jī)湯治療甲亢大鼠的血清代謝組學(xué)變化及作用機(jī)制進(jìn)行分析及討論。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要藥物與試劑 優(yōu)甲樂(lè)（Merck KGaA，Darmstadt，德國(guó)，貨號(hào)：JX20190041），丙基硫氧嘧啶（購(gòu)自上海朝暉藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：2108N13），甲醇（millipore，美國(guó)，貨號(hào)：1.00030.4008），乙腈（millipore，美國(guó)，貨號(hào)：1.06007.4008），氨水（Merck，德國(guó)，貨號(hào)：105426），乙酸銨（Sigma，美國(guó)，貨號(hào)：73594），甲酸（millipore，美國(guó)，貨號(hào)111670），水合氯醛（購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。中藥材柴胡、香附、郁金、川芎、枳實(shí)、白芍、白術(shù)、茯苓、山藥，仙靈脾、薄荷、生甘草均購(gòu)自昆明益生藥業(yè)有限責(zé)任公司。促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、血清游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）、血清游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、促甲狀腺素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAb）、干擾素γ（interferon-α，IFN-γ）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 23 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)于云南致力科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，大鼠生長(zhǎng)環(huán)境為室溫24 ℃，濕度60%，自由飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方案已經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：R-062021G088）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 質(zhì)譜儀（Thermo Scientific，美國(guó)，型號(hào)：Q Exactive Plus），超高壓液相色譜儀（Shimadzu，中國(guó)，型號(hào)：Nexera X2 LC-30AD），色譜柱（Waters，美國(guó)，型號(hào)：ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm × 100 mm column），超聲波系統(tǒng)（Diagenode，美國(guó)，型號(hào)：Bioruptor），真空離心濃縮機(jī)（Eppendorf，德國(guó)，型號(hào)：Concentrator），離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge，德國(guó)，型號(hào)：5430R），可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)，型號(hào)：MultiSkan FC）。81-2 恒溫磁力攪拌器（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，分為空白組和造模組，造模組進(jìn)行為期10 d 的皮下注射左甲狀腺素溶液30 μg/100 g，造模后檢測(cè)造模組血清中TSH、FT3 和FT4 水平變化，血清指標(biāo)水平變化符合臨床疾病病理變化，確定造模成功。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 將造模組分為模型組、陽(yáng)性藥組和疏調(diào)氣機(jī)湯給藥組。空白組、模型組進(jìn)行等體積蒸餾水灌胃（100 g/mL），陽(yáng)性藥組進(jìn)行丙基硫氧嘧啶水溶液5 mg/（100 g·d）灌胃給藥，給藥組進(jìn)行疏調(diào)氣機(jī)湯20.6 g/（kg·d）灌胃給藥，連續(xù)給藥6 周，進(jìn)行取血和組織取材。取材前大鼠禁食12 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心得血清，-80 ℃保存待測(cè)。取大鼠甲狀腺進(jìn)行組織切片及HE 染色，并于顯微鏡下觀察。

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 大鼠腹主動(dòng)脈取血，離心，取上清，試劑盒Elisa 檢測(cè)FT3、FT4、TSH、TRAB、IFN-γ、TNF-α、IL-6 水平。

2.4 代謝組學(xué)檢測(cè) 對(duì)血清進(jìn)行代謝物提取，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS 檢測(cè)。色譜分析采用SHIMADZU-LC30 超高效液相色譜系統(tǒng)使用ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱進(jìn)行分離。色譜分離條件：進(jìn)樣量為3 μL，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A：水+25 mM 乙酸銨，B：乙腈。質(zhì)譜分別采用電噴霧電離（ESI）進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式檢測(cè)，樣品經(jīng)UHPLC 分離后，使用QE Plus 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，使用HESI 源進(jìn)行離子化。使用MSDIAL 軟件進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。對(duì)得到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值＞50%的離子峰，對(duì)正負(fù)離子數(shù)據(jù)進(jìn)行總峰面積歸一化，并整合，使用R 軟件進(jìn)行模式識(shí)別，數(shù)據(jù)經(jīng)Unit variance scaling（UV）預(yù)處理后，進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，多組間數(shù)據(jù)差異顯著性方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清指標(biāo)檢測(cè) 對(duì)大鼠血清進(jìn)行TSH、FT3、FT4、TRAB 定量檢測(cè)，以及驗(yàn)證因子IFN-γ、TNFα/IL-6。從圖1、表1 可知，與模型組相比，給藥組的TSH 水平顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)T3、FT4 與模型組相比，具有下降的趨勢(shì)。圖2、表2 顯示，TRAB 與模型組比較，趨勢(shì)不明顯。IFN-γ、TNF-α/IL-6 具有顯著的下降趨勢(shì)，且疏調(diào)氣機(jī)湯給藥組與模型組比較存在明顯差異（P＜0.05）。

表1 大鼠血清TSH、FT3、FT4 指標(biāo)含量濃度（n=5）

圖1 大鼠血清TSH、FT3、FT4 含量變化柱狀圖

圖2 大鼠血清TRAB、IFN-γ、TNF-α/IL-6 含量變化柱狀圖

3.2 甲狀腺組織病理變化 對(duì)空白組、模型組、疏調(diào)氣機(jī)湯給藥組的大鼠甲狀腺進(jìn)行石蠟切片及HE 染色，見(jiàn)圖3。空白組可見(jiàn)甲狀腺濾泡腔形態(tài)正常，濾泡內(nèi)胞質(zhì)分布均勻，濾泡上皮細(xì)胞呈扁平狀，未見(jiàn)增生及濾泡間質(zhì)水腫。模型組可見(jiàn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞腫大，濾泡腔增大，大小形態(tài)不一，部分甲狀腺濾泡形態(tài)被破壞，濾泡內(nèi)胞質(zhì)分布不均，膠質(zhì)分泌旺盛，甲狀腺濾泡間質(zhì)水腫，可見(jiàn)部分淋巴細(xì)胞聚集，存在炎細(xì)胞浸潤(rùn)。給藥組與模型組比較，甲狀腺濾泡細(xì)胞腫大較輕，濾泡內(nèi)間質(zhì)部分分布不均，濾泡間質(zhì)水腫較輕。

圖3 大鼠甲狀腺切片HE 染色圖（100×）

3.3 代謝組學(xué)檢測(cè) 根據(jù)正負(fù)離子色譜（圖4）可知，血清中的小分子物質(zhì)可以在12 min 以前得到很好的分離，且各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中，儀器引起誤差較小。主成分分析（principal component analysis，PCA）能夠?qū)Υx物進(jìn)行主成分分析，從總體上反映樣本組間和組內(nèi)的變異度。偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）運(yùn)用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)。其中，R2Y 和Q2 越接近于1，模型越穩(wěn)定可靠。從圖5中可見(jiàn)，R2Y 均大于0.99，Q2 均大于0.5，即表明模型穩(wěn)定，且模型的預(yù)測(cè)能力好（R2、Q2 為回歸直線與Y 軸的截距）。

圖4 大鼠血清正負(fù)離子模式圖譜

圖5 代謝組學(xué)多元統(tǒng)計(jì)分析

甲亢大鼠潛在血清標(biāo)記物根據(jù)VIP 進(jìn)行篩選，VIP 值越大，物質(zhì)對(duì)分子的貢獻(xiàn)越明顯，并根據(jù)P 值進(jìn)行顯著性篩選。對(duì)空白組與模型組大鼠血清代謝物進(jìn)行比較，有61 種潛在代謝物具有顯著性變化；模型組與疏調(diào)氣機(jī)湯組大鼠血清代謝物比較，有73 種潛在代謝物具有顯著性變化。以FC＞1.5，logFC≥0 為上調(diào)，制作火山圖（圖6）。氣泡圖中可見(jiàn)，空白組與模型組中有16 種潛在標(biāo)志物下調(diào)，10 種潛在標(biāo)記物上調(diào)；模型組與給藥組中有14 中潛在標(biāo)記物下調(diào)，13種潛在標(biāo)記物上調(diào)。

圖6 大鼠體內(nèi)的血清潛在標(biāo)記物變化趨勢(shì)

對(duì)空白組、模型組、疏調(diào)氣機(jī)湯給藥組進(jìn)行代謝物Venn 分析（圖7），發(fā)現(xiàn)3 組中共同存在的物質(zhì)有8 種，分別為wedelolactone、solasodine、orotic acid、O-methylarmepavine、N-methylproline、N-fructosyl lsoleucine、levetiracetam 和hesperetin。對(duì)物質(zhì)進(jìn)行差異代謝物豐度分析，使用t 檢驗(yàn)檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量。模型組（M）與疏調(diào)氣機(jī)湯給藥組（G）相比，wedelolactone、solasodine、orotic acid、O -methylarmepavine 和N-methylproline 在疏調(diào)氣機(jī)湯的作用下表達(dá)降低，而N-fructosyl lsoleucine、levetiracetam 和hesperetin 表達(dá)升高（圖8）。

圖7 大鼠血清代謝物韋恩分析圖

圖8 差異代謝物豐度分析箱型圖

3.4 差異代謝物通路分析 對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG 通路分析，pathway 從上至下-log10（p-value）依次降低，即p-value 依次升高，顯著性依次降低。如圖9 所示，空白組與模型組比較，所含差異代謝物數(shù)量多的通路主要為2-氧代羧酸代謝途徑，神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑、甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝等，模型組與疏調(diào)氣機(jī)湯給藥組比較，差異代謝物參與的路徑主要為原發(fā)性膽汁酸代謝途徑。

圖9 差異代謝物KEGG 信號(hào)通路分析

4 討論

流行病學(xué)顯示，甲亢在全球的發(fā)病率約為0.2%～1.3%，歐洲平均患病率為0.75%，中國(guó)甲亢患病率為1.22%[12]。臨床治療主要以藥物治療、手術(shù)治療及放射碘治療為主[13]。甲亢在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被列為“癭證”，與肝、脾、心臟存在著聯(lián)系[14]?！度驑O一病證方論·癭瘤證治》指出，“此乃因喜怒憂思有所郁而成也”，即甲亢的發(fā)病多與情志相關(guān)。肝屬木，主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)。肝亦為風(fēng)木之臟，喜條達(dá)而惡抑郁，其氣易逆易亢，性剛強(qiáng)。故情志之調(diào)節(jié)功能，與肝密切相關(guān)[15-16]。

國(guó)醫(yī)大師張震認(rèn)為，氣之升、降、出、入運(yùn)動(dòng)貫穿于整個(gè)生命活動(dòng)，升降運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)機(jī)體物質(zhì)代謝，出入運(yùn)動(dòng)則可實(shí)現(xiàn)機(jī)體與外界的物質(zhì)交換，正由于臟腑不斷升清降濁、吐故納新，機(jī)體才能正常新陳代謝，痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物方能消散[17]。國(guó)醫(yī)大師張震結(jié)合多年行醫(yī)經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)識(shí)到疏調(diào)人體氣機(jī)并非單純疏肝理氣解郁所能圓滿實(shí)現(xiàn)治療之目的，必須把疏利肝氣與調(diào)護(hù)脾腎相結(jié)合，同時(shí)兼顧其他并發(fā)癥統(tǒng)籌治之，遂提出“一體兩翼，疏調(diào)氣機(jī)”理論，即“疏肝為主體，健脾補(bǔ)腎為兩翼”學(xué)說(shuō)[18]。疏調(diào)氣機(jī)湯具有疏肝解郁、理氣和血等功效，符合辨證論治理論，對(duì)甲亢可以起到對(duì)癥治療的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，疏調(diào)氣機(jī)湯可降低FT3、FT4 水平，升高甲亢大鼠的TSH 水平，對(duì)相關(guān)炎癥因子水平有較好的抑制作用，并能改善甲狀腺組織的病理形態(tài)。代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示，疏調(diào)氣機(jī)湯對(duì)甲亢大鼠體內(nèi)潛在標(biāo)記物的含量存在一定影響。根據(jù)KEGG通路分析結(jié)果，疏調(diào)氣機(jī)湯在原發(fā)性膽汁酸代謝途徑的表達(dá)幾率較高。血清代謝物的潛在標(biāo)記物主要作用：Wedelolactone 存在炎癥疾病中存在調(diào)節(jié)作用[19-20]；solasodine 能夠抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖等作用[21]；orotic acid 是由腸道菌群產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，是合成嘧啶核苷酸的中間體，能夠影響線粒體產(chǎn)生ATP 的能力，從而影響能量轉(zhuǎn)化通路，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[22]；O-methylarmepavine 具有較強(qiáng)的抗菌活性[23]；N-methylproline 對(duì)疾病代謝存在影響，與疾病的產(chǎn)生存在聯(lián)系[24]；levetiracetam 具有抗癲癇等藥理作用[25]；hesperetin 具有抗炎、抗氧化等藥理作用[26]。疏調(diào)氣機(jī)湯對(duì)甲亢大鼠血清標(biāo)記物影響的相關(guān)研究結(jié)果提示，疏調(diào)氣機(jī)湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)抗炎、抗氧化、抗菌物質(zhì)的表達(dá)水平，發(fā)揮其藥理作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分析疏調(diào)氣機(jī)湯影響甲亢大鼠血清特異因子及血清潛在標(biāo)記物的變化，結(jié)果表明，疏調(diào)氣機(jī)湯對(duì)甲亢大鼠存在良好的治療作用，并對(duì)血清代謝物存在顯著的調(diào)節(jié)作用，血清代謝標(biāo)記物表明疏調(diào)氣機(jī)湯藥理作用可能通過(guò)抗炎、抗氧化等代謝途徑發(fā)揮治療作用。