謝創(chuàng)波，艾娟，李向宇，趙高峰，許能貴

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州510006

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院華南針灸研究中心，廣東 廣州510006

電針（EA）鎮(zhèn)痛效果確切，臨床應(yīng)用廣泛，但其機(jī)制仍未完全闡明。一直以來，研究者們認(rèn)為電針鎮(zhèn)痛主要與疼痛神經(jīng)傳導(dǎo)通路上相關(guān)神經(jīng)元的活動變化有關(guān)[1-2]。近年來，星形膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的發(fā)生和調(diào)控中的作用被越來越多的研究者所報道[3-5]。多項研究表明，電針可以通過抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6-8]。在疼痛傳入通路的大腦皮層感覺區(qū)域——初級體感皮層中，星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與了疼痛的形成[9]。然而，初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞是否在電針鎮(zhèn)痛中發(fā)揮作用仍未見報道。本研究旨在通過觀察初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞在電針治療炎癥性疼痛中的作用，探討初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與電針鎮(zhèn)痛，探索電針鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取健康SPF 級8～12 周雄性C57小鼠80只，體質(zhì)量（25±3）g，購自廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，合格證號為SCXK（粵）2021-0057。飼養(yǎng)于光照與黑暗各12 h 循環(huán)交替，溫度控制在（23±1）℃的環(huán)境中，自由攝食和飲水。本動物實驗經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（No.20220629001），在廣州中醫(yī)藥大學(xué)華南針灸研究中心完成。

1.2 實驗分組與造模本研究分3 部分實驗。實驗一為電針治療炎性痛效果的觀察，將實驗小鼠隨機(jī)分為4 組（每組8 只）：空白對照組（ShamCFA 組）、模型組（CFA 組）、假電針組（CFA+ShamEA 組）和電針組（CFA+EA 組）。除ShamCFA 組外，其余3 組均在異氟烷麻醉下于左后足底緩慢注射完全弗氏佐劑（CFA）20 μL。ShamCFA 組以相同方法注射等體積0.9%氯化鈉溶液。實驗二為觀察抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對小鼠痛閾及電針鎮(zhèn)痛效果的影響，將實驗小鼠隨機(jī)分為4 組（每組8 只）：模型組（CFA+aCSF 組）、星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制組（CFA+L-α-AAA 組）、電針組（CFA+aCSF+EA 組）和星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制復(fù)合電針組（CFA+L-α-AAA+EA 組），各組CFA 造模方法同實驗一。實驗三為觀察激活星形膠質(zhì)細(xì)胞對電針鎮(zhèn)痛效果的影響，將實驗小鼠隨機(jī)分為2 組（每組8 只）：化學(xué)遺傳激活組（CFA+EA+CNO 組）和化學(xué)遺傳對照組（CFA+EA+Saline 組），2 組均需造模，方法同實驗一。

1.3 穴位選取及電針本實驗中電針穴位為左下肢“環(huán)跳”穴和“陽陵泉”穴，按照中國中醫(yī)藥出版社《實驗針灸學(xué)》定位，分別為后肢髖關(guān)節(jié)上緣0.3 cm 處和后肢腓骨小頭前下方凹陷處。電針時將華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格：0.25 mm×13 mm）刺入皮膚2～3 mm，電針參數(shù)為頻率2 Hz、電流1 mA，每次30 min，連續(xù)7 d。實驗一中空白對照組和模型組不進(jìn)行電針，假電針組僅將針灸針刺入皮下，不通電。實驗一和實驗三小鼠在造模后第2 天進(jìn)行電針治療。實驗二所有小鼠在藥物注射3 d 后進(jìn)行電針治療。

1.4 立體定位注射與化學(xué)遺傳操縱實驗二中所有小鼠在CFA 造模后第2 天進(jìn)行腦區(qū)藥物注射。在異氟烷麻醉下，CFA+L-α-AAA 組和CFA+L-α-AAA+EA 組注射星形膠質(zhì)細(xì)胞選擇性膠質(zhì)毒素L-α-氨基己二酸（L-α-AAA）（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，貨號A7275），使用人工腦脊液（aCSF）配制為0.1 mol/L，注射區(qū)域為初級體感皮層后肢區(qū)（S1HL），坐標(biāo)為（AP-0.5 mm，ML-1.75 mm），注射深度為硬腦膜下0.65 mm，注射量為1 μL，CFA+aCSF 組和CFA+aCSF+EA 組僅注射等量人工腦脊液。

實驗三中所有小鼠在CFA 造模前3 周進(jìn)行病毒注射。2 組小鼠均在異氟烷麻醉下注射化學(xué)遺傳激活病毒rAAV-GfaABC1D-hM3D（Gq）-mCherry，AAV2/5（武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司，批次5-1169-K210810，滴度5.31E+12 vg/mL）。注射區(qū)域和深度同實驗二，病毒注射量為200 nL，注射速度40 nL/min。CFA+EA+CNO 組在每次電針前40 min 按1 mg/kg 腹腔注射N-氧化氯氮平（CNO）（武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司，批次CNO-220412）以特異性激活初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞。CFA+EA+Saline 組電針前40 min腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 疼痛閾值檢測本實驗分別使用VonFrey 電子測痛儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）和紅外熱痛測試儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）進(jìn)行機(jī)械痛閾值（PWT）和熱痛閾值（TL）檢測。分別于造模前1 天（Baseline）、造模后1 天（Model）和電針第1、3、5、7 天（Day1、Day3、Day5、Day7）進(jìn)行檢測，共6 次。每次痛閾檢測重復(fù)3次，每次間隔大于5 min，取平均值作為該次測量值。

1.6 病毒表達(dá)位置驗證及免疫熒光檢測最后一次疼痛閾值檢測后在麻醉下將實驗小鼠進(jìn)行心臟灌注和斷頭取腦，4%PFA 固定后分別使用15%和30%蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水。小鼠腦組織在30%蔗糖溶液中沉底后，按照第4 版腦立體定位圖譜，使用冰凍切片機(jī)進(jìn)行大腦切片，厚度40 μm。分別使用兔源膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體（一抗，廣州昂科生物科技有限公司，批號WF3312325C）、驢抗兔IgG，Alexa Fluor 488 抗體（二抗，廣州昂科生物科技有限公司，批號2286294）和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，碧云天生物技術(shù)有限公司）對小鼠腦片進(jìn)行免疫熒光染色。標(biāo)本制備完成后，使用共聚焦顯微鏡（尼康，日本）拍攝熒光圖片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)使用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用Shapiro-Wilk 檢驗進(jìn)行正態(tài)性檢驗。各組不同時間點(diǎn)疼痛閾值的比較，符合正態(tài)分布時采用兩因素重復(fù)測量資料的方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 事后檢驗。不符合正態(tài)分布時采用秩和檢驗。P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 電針治療對炎性痛小鼠疼痛閾值的影響見圖1。造模24 h后，除ShamCFA 組外，各組小鼠PWT 和TL 與基線值相比均顯著下降（P＜0.05），提示造模成功。與CFA 組比較，CFA+EA 組電針治療第3、5、7 天PWT 均顯著上升（P＜0.05）；而CFA+ShamEA 組各時間點(diǎn)PWT 與CFA 組均無明顯差異（P＞0.05）。與CFA 組比較，CFA+EA 組TL 在電針治療第3、5、7 天均顯著上升（P＜0.05）；而CFA+ShamEA 組各時間點(diǎn)TL 與CFA 組均無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠疼痛閾值檢測結(jié)果比較

2.2 抑制初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞對炎性痛小鼠疼痛閾值及電針鎮(zhèn)痛效果的影響見圖2。與CFA+aCSF 組比較，CFA+L-α-AAA 組在造模后抑制了初級體感皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞，顯著提高了炎性痛小鼠的PWT 和TL（P＜0.05），并可維持到電針第7 天的時間點(diǎn)。與CFA+aCSF+EA 組比較，CFA+L-α-AAA+EA 組在電針第1、3 天PWT 顯著提高（P＜0.05）；而在電針第5、7天，2 組PWT 無顯著差異（P＞0.05）。與CFA+aCSF+EA 組比較，CFA+L-α-AAA+EA 組在電針第1、3 天TL 顯著提高（P＜0.05）；而在電針第5、7天，2 組TL 無顯著差異（P＞0.05）。另外，與CFA+L-α-AAA 組比較，CFA+Lα-AAA+EA 組在電針第7 天PWT 和TL 均顯著提高（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠疼痛閾值檢測結(jié)果比較

2.3 化學(xué)遺傳操縱病毒轉(zhuǎn)染初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的情況見圖3。本研究使用帶有星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子GfaABC1D 的重組腺相關(guān)病毒（rAAV）來轉(zhuǎn)染S1HL 腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞膜表面表達(dá)化學(xué)遺傳激活的元件——hM3Dq（一種G 蛋白偶聯(lián)受體，可被外源性藥物CNO 特異性激活）。圖3B 展示了病毒轉(zhuǎn)染的范圍，病毒表達(dá)報告蛋白——mCherry（紅色）的范圍指示了hM3Dq 準(zhǔn)確表達(dá)于S1HL腦區(qū)。圖3C 中CFA+EA+Saline 組和CFA+EA+CNO組的化學(xué)遺傳病毒均可準(zhǔn)確與星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物——GFAP 共標(biāo)，提示2 組病毒均轉(zhuǎn)染皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞并星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)化學(xué)遺傳操縱元件。

圖3 星形膠質(zhì)細(xì)胞化學(xué)遺傳病毒注射位點(diǎn)示意圖及病毒表達(dá)情況

2.4 化學(xué)遺傳激活初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞對電針鎮(zhèn)痛效果的影響見圖4。與造模24 h 后PWT 比較，CFA+EA+Saline 組電針第3、5、7 天的PWT 顯著提高（P＜0.05）。與CFA+EA+Saline 組比較，CFA+EA+CNO 組電針第3、5、7 天的PWT 均顯著降低（P＜0.05）。與造模24 h 后TL 比較，CFA+EA+Saline 組電針第3、5、7 天的TL 顯著提高（P＜0.05）。與CFA+EA+Saline 組比較，CFA+EA+CNO 組電針第3、5、7 天的TL 均顯著降低（P＜0.05）。

圖4 2 組小鼠疼痛閾值檢測結(jié)果比較

3 討論

炎癥性疼痛是指由創(chuàng)傷、手術(shù)以及感染等引起的外周組織損傷并導(dǎo)致炎癥時所產(chǎn)生的疼痛，是臨床常見的疼痛類型。本研究中，我們選用了國內(nèi)外較為公認(rèn)的炎癥性疼痛模型—CFA 模型[10]研究。在造模24 h后，小鼠機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的檢測均表明了造模成功。電針鎮(zhèn)痛是廣為認(rèn)可的治療疼痛的有效手段之一。據(jù)報道，電針可以有效治療炎癥性疼痛[11-12]。參照相關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，本研究選取了環(huán)跳穴和陽陵泉穴作為電針干預(yù)穴位。本研究結(jié)果表明，CFA+EA 組在電針治療第3 天開始出現(xiàn)明顯的鎮(zhèn)痛效果，隨著電針次數(shù)的增加，疼痛閾值逐漸升高，說明了電針環(huán)跳穴和陽陵泉穴可以有效治療CFA 誘導(dǎo)的炎性痛，并且存在累積效應(yīng)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的一類膠質(zhì)細(xì)胞，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元周圍。在脊髓與初級體感皮層中，疼痛的發(fā)生均伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[6-7，9]。電針可以抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6-8]。由此可以推測，電針也可能通過對初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究中，使用星形膠質(zhì)細(xì)胞選擇性膠質(zhì)毒劑——L-α-AAA[13]對初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行抑制，并觀察抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對炎性痛小鼠疼痛閾值的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與電針治療的效果類似，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞可以提高炎性痛小鼠的疼痛閾值。與電針治療的累積效應(yīng)不同的是，直接抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的CFA+L-α-AAA組在電針第1 天的時間點(diǎn)就呈現(xiàn)出提高痛閾的效果，并維持到第7 天。在電針治療的第1 天和第3天，CFA+L-α-AAA+EA 組小鼠的疼痛閾值顯著高于CFA+EA組，這可能是由于L-α-AAA 對星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制程度強(qiáng)于這兩個時間點(diǎn)電針?biāo)苓_(dá)到的效應(yīng)。值得注意的是，雖然L-α-AAA 對星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制可以顯著提高疼痛閾值，但是在電針治療的第5 天和第7天，CFA+L-α-AAA+EA 組小鼠的疼痛閾值與CFA+EA 組無明顯差異，提示我們電針治療炎性痛的機(jī)制可能包含了對星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制，即星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了電針鎮(zhèn)痛。在電針治療第7天，CFA+L-α-AAA+EA 組小鼠的疼痛閾值顯著高于CFA+L-α-AAA組，這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞的參與只是電針治療炎性痛的部分機(jī)制。

為了進(jìn)一步證明星形膠質(zhì)細(xì)胞參與電針治療炎性痛，本研究使用化學(xué)遺傳學(xué)的方法激活初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，并觀察其對電針鎮(zhèn)痛的影響。本研究結(jié)果表明，在電針治療時激活初級體感皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以翻轉(zhuǎn)電針的鎮(zhèn)痛作用。這與通過間接活化星形膠質(zhì)細(xì)胞翻轉(zhuǎn)電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究結(jié)果類似[14]。該研究中，研究者通過鞘內(nèi)注射選擇性腺苷A1 受體抑制劑引起了脊髓L4～6節(jié)段星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，逆轉(zhuǎn)了電針的鎮(zhèn)痛效果，從而證明了脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了電針鎮(zhèn)痛作用[14]。

Sun Kwang K等[9]研究發(fā)現(xiàn)，激活初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞代謝性谷氨酸受體5（mGluR5）信號通路可以誘發(fā)長時間的痛覺過敏，而阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞mGluR5 信號通路則可以抑制機(jī)械痛覺過敏。阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸信號通路也可能是本研究中抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和電針治療提高疼痛閾值的潛在原因。對“三聯(lián)突觸”（由突觸前膜、突觸后膜及包繞在其周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞三部分共同組成）的研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞可以感知和調(diào)控神經(jīng)元活動[15]。大腦皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的交互作用與疼痛的發(fā)生有關(guān)[4，9]。Yin W等[4]研究者發(fā)現(xiàn)，前扣帶回皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)與CFA 誘導(dǎo)的炎癥性疼痛密切相關(guān)。抑制糖異生和乳酸釋放可以阻斷CFA 誘導(dǎo)的持續(xù)疼痛，而外源性L-乳酸可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞參與電針治療炎性痛的機(jī)制也可能是由于電針抑制了皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究僅從初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制和激活對電針治療炎癥性疼痛的影響這一角度說明初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了電針鎮(zhèn)痛。電針如何影響初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，以及神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞如何相互作用并最終影響電針鎮(zhèn)痛效果仍需要進(jìn)一步的研究。另外，初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞是否在電針治療其他類型的疼痛發(fā)揮作用仍有待探討。

總之，本研究結(jié)果表明電針環(huán)跳穴和陽陵泉穴可以有效治療CFA 誘導(dǎo)的炎癥性疼痛，而初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞參與電針治療炎性痛。對初級體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)可能是電針鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一，也可能是炎癥性疼痛治療的靶點(diǎn)。