蒙薪赟，趙嘉，劉璟

（西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715）

砷（As）是一種有毒、致癌的類金屬元素，通常存在于礦物中，并通過采礦、冶煉、礦物風(fēng)化和大氣降水等途徑廣泛分布于自然界中，進而對人類健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成潛在威脅[1-3]。一般來說，黏土對As 具有較好的吸附和固定效果。Yamazaki 等[4]調(diào)查了孟加拉國一村莊土壤中的As 含量，發(fā)現(xiàn)黏土中的As 含量為20~111 mg·kg-1，而沙土中的As 含量則為3~7 mg·kg-1。在厭氧條件下，As 通常為毒性和流動性更強的三價態(tài)[As（Ⅲ）]，因此富含黏土礦物且長期處于淹水缺氧環(huán)境的土壤受到的As 污染較為嚴重[5-8]。土壤As污染問題已越來越引起人們的關(guān)注。

氮（N）是農(nóng)業(yè)土壤中的主要養(yǎng)分之一，土壤中N素的轉(zhuǎn)化及其含量的高低，對作物產(chǎn)量和生態(tài)平衡影響重大[9-10]。N 在固-液體系中以銨鹽、亞硝酸鹽和硝酸鹽等形態(tài)存在并進行轉(zhuǎn)換，在水體中具有很高的溶解度，會通過硝化作用氧化成，再通過反硝化作用轉(zhuǎn)化為N2O和N2，會異化還原為。N和As同處于農(nóng)田土壤環(huán)境中，如果能通過研究發(fā)現(xiàn)兩者間的聯(lián)系和其形態(tài)變換規(guī)律，將為土壤As 污染治理和修復(fù)提供新思路。

土壤中黏土礦物的含量對As 的吸附和N 含量的變化均有影響[13-14]。膨潤土[Al2O3·4（SiO2）·H2O]主要由蒙脫石組成，是一種2∶1 類型的黏土礦物，是國內(nèi)外開發(fā)最早、應(yīng)用最廣泛的非金屬礦產(chǎn)之一，具有良好的緩沖和吸附效果，在環(huán)境污染治理方面發(fā)揮著重要作用[15-17]。由于膨潤土具有較大的比表面積和較強的陽離子交換能力及吸附能力，可通過絡(luò)合作用吸附金屬離子，所以膨潤土及其改性產(chǎn)品常作為吸附劑吸附As 等重金屬[18]。Mar 等[19]通過等溫吸附實驗得出膨潤土的As（Ⅴ）吸附量最高可達0.33 mg·g-1。程冰冰等[20]通過干法提純得到的膨潤土對As（Ⅴ）的最大吸附量達0.186 mg·g-1。Su 等[21]用陽離子表面活性劑改性制備的有機膨潤土，可去除水溶液中As（Ⅴ）和As（Ⅲ）。除此之外，膨潤土也可作為微生物的天然養(yǎng)分載體，提高土壤中微生物的存活率[22]。因此，膨潤土可作為吸附劑和微生物載體用于本研究。在土壤環(huán)境中，硫（S）的氧化還原也會影響到As，厭氧環(huán)境下硫酸鹽還原菌（Sulfate-reducing bacteria SRB）等厭氧微生物會影響土壤中As 和N 的流動及變化[23-24]。目前，關(guān)于As 污染和N 素轉(zhuǎn)化的研究較多，但將兩者聯(lián)系起來的研究相對較少。因此，本研究以膨潤土為載體，SRB 為優(yōu)勢菌種，探究厭氧環(huán)境下不同因素對膨潤土固液體系中As 和N 的影響以及兩者間的聯(lián)系，以豐富對礦區(qū)土壤As污染的防控認識。

1 材料與方法

1.1 硫酸鹽還原菌的培養(yǎng)

本實驗所用的硫酸鹽還原菌來自四川西南某銅礦區(qū)，用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，平板劃線后分離純化，經(jīng)鑒定為Desulfovibrio vlugarisMiyazaki，以下簡稱SRB。本研究所用培養(yǎng)基為德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏庫（DSMZ）所記錄的DSMZ 63 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（http：//www.dsmz.de/microorganisms）[25]。該培養(yǎng)基含有K2HPO4（0.5 g·L-1），MgSO4·7H2O（2 g·L-1），Na2SO4（1 g·L-1），CaCl2·2H2O（2 g·L-1），Yeast extract（1 g·L-1）和DL-Na-lactate（2 g·L-1）。將硫酸鹽還原菌接種至上述培養(yǎng)基7 d 后取48 mL 以10 000 r·min-1（5810，艾本德，中國）離心20 min，倒掉上清液后用超純水定容至50 mL，搖勻備用。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 SRB厭氧微宇宙實驗

開展微宇宙實驗以研究不同SRB 活性對膨潤土中N 和As 形態(tài)以及濃度的影響，通過設(shè)置不同的SRB 生長環(huán)境：超純水、標(biāo)準(zhǔn)DSMZ 63 培養(yǎng)液和寡營養(yǎng)培養(yǎng)液（1%的DSMZ 63 培養(yǎng)液），分別建立有差異的SRB生長活性環(huán)境。以超純水為控制對照組，另外兩種營養(yǎng)條件作為實驗組。在250 mL 的三孔藍蓋瓶中分別加入上述溶液196.76 mL，然后加入1 g 膨潤土，用移液槍吸取對數(shù)期生長良好的SRB 菌液2 mL注入上述瓶中，加入1.2 g 硝酸鈉作為N 源，1.24 mL As（Ⅴ）儲備液（1 g·L-1）作為As 源，最終使得瓶中溶液體積達到200 mL，初始As 濃度和N 濃度分別為6 200 μg·L-1和4 200 mg·L-1。連續(xù)通入10 min 氬氣以創(chuàng)造厭氧環(huán)境，然后將三孔藍蓋瓶置于35 ℃，150 r·min-1下振蕩（IS-RDD3）。試驗周期為7 d，每天定時用10 mL 針管抽取樣品溶液，樣液過0.45μm 濾膜后，測定As 形態(tài)[As（Ⅲ）、As（Ⅴ）]和N 形態(tài)和。

1.2.2 共存N和有機酸影響實驗

對于N 濃度添加影響，參考1.2.1 部分，在其他實驗條件不變的前提下，改變硝酸鈉的添加量（0、0.3、1.2 g）開展相應(yīng)微宇宙實驗。對于共存有機物的影響，分別選用乙酸鈉和腐植酸作為代表性小分子和大分子酸進行研究。取乙酸鈉（Alfa Aesar）0、0.2 g 和0.5 g分別加入到上述（1.2.1）SRB溶液中，再分別加入0、0.4 mL 和4 mL 1 g·L-1腐植酸溶液（藥品配制，購自Alfa Aesar）到上述（1.2.1）SRB 溶液中開展相應(yīng)的微宇宙實驗。取樣和分析方法同上。上述所有實驗均采用超純水（18.25 MΩ）營養(yǎng)條件。

上述所有實驗均設(shè)置3 組平行，微宇宙實驗樣品總量為216個。

1.3 亞硝酸鹽對As氧化還原的影響

開展微宇宙實驗進一步研究N 對As 形態(tài)變化的影響。在250 mL 三孔藍蓋瓶中加入196.76 mL 的超純水和2 mL SRB 菌體溶液，參照1.2.1 部分避光厭氧培養(yǎng)后，將三孔藍蓋瓶放入恒溫振蕩箱以150 r·min-1在35 ℃的條件下振蕩3 d。之后用針管抽取20 mL溶液用于檢測初始N和As形態(tài)，再注入20 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1）。再次將實驗裝置放入恒溫振蕩箱后，每1 h取6 mL樣品溶液用于檢測N和As形態(tài)，實驗時間為5 h。

1.4 As和N的檢測

As 價態(tài)及濃度測試采用氫化物發(fā)生原子熒光光譜高效液相色譜法，以7%HNO3（優(yōu)級純）為載流，20 g·L-1KBH4（優(yōu)級純）和5 g·L-1KOH（優(yōu)級純）混合作為還原劑，1.96 g·L-1（NH4）2HPO4（優(yōu)級純）作為流動相，高級氬氣（0.3 MPa）作為載氣[26]，用高效液相色譜原子熒光質(zhì)譜儀（HPLC-AFS SAP50，北京吉天儀器有限公司）測試樣品。采用國家標(biāo)物中心提供的砷酸鹽和亞砷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)性為0.998。

2 結(jié)果與討論

2.1 細菌活性對膨潤土中N和As的影響

如圖1所示，厭氧條件下，在膨潤土-水溶液的體系中，As（Ⅴ）在SRB的生物還原作用下還原成As（Ⅲ），As（Ⅴ）濃度逐漸下降，As（Ⅲ）濃度逐漸升高。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液和寡營養(yǎng)體系中，As（Ⅲ）第0天就可以檢測到，而控制組（超純水）在第2 天之后才能檢測出As（Ⅲ）。對比7 d 的As（Ⅲ）平均濃度，超純水條件下As（Ⅲ）的平均濃度為668 μg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)條件下的平均濃度為983 μg·L-1，表明在有利的營養(yǎng)生長環(huán)境下，SRB能更有效地促進As（Ⅴ）的還原。

圖1 厭氧條件下不同SRB活性的膨潤土中As形態(tài)的濃度變化Figure 1 Arsenic species transformation in the presence of bentonite under different culture of sulfate reducing bacteria

圖2 厭氧條件下不同SRB活性的膨潤土中N形態(tài)的濃度變化Figure 2 Nitrogen species transformation in the presence of bentonite under different culture of sulfating reducing bacteria

2.2 不同N添加量對As氧化還原的影響

如圖3 所示，未添加硝酸鈉的條件下，幾乎檢測不出As（Ⅲ），而As（Ⅴ）總量相對添加N 的實驗組較低，這可能是受膨潤土吸附的影響。有研究表明膨潤土對氮肥和具有強烈的吸附效果，如果膨潤土對N 的吸附接近飽和，則吸附的As 相對較少[29]。在低N（0.3 g NaNO3）條件下，As（Ⅲ）濃度由第2 天的0.81 μg·L-1逐漸升高至第7 天的427 μg·L-1。對比低N 條件，高N（1.2 g NaNO3）條件下As（Ⅲ）濃度升高的趨勢更明顯，且在第7 天時達到1 341 μg·L-1，約為第7 天低N條件As（Ⅲ）濃度的3倍。

圖3 厭氧條件不同N含量膨潤土中As的形態(tài)濃度變化Figure 3 Arsenic species transformation in the presence of bentonite under different nitrogen addition

在圖4A 和圖4B 中，低N 條件下NO-3和NO-2的平均濃度分別為120 mg·L-1和0.3 mg·L-1，分別約為高N條件的1/3（404 mg·L-1）和1/7（2.1 mg·L-1）。兩種不同N 環(huán)境中的NH+4濃度變化波動較大，未觀測出明顯差異（圖4C）。Al-Tamimi 等[30]曾用生物競爭排除（Bio-competitive exclusion，BCX）技術(shù)研究硝酸鹽對SRB 產(chǎn)生的H2S 的影響，最終發(fā)現(xiàn)高濃度的硝酸鹽可以有效抑制SRB 產(chǎn)生H2S。H2S 在厭氧條件下可以和As（Ⅴ）形成沉淀以達到去除As 的效果[31]，因此我們推測硝酸鈉的加入使SRB 產(chǎn)生H2S 受阻，從而使得實驗體系中的As（Ⅴ）和As（Ⅲ）濃度升高，且在一定范圍內(nèi)As（Ⅲ）濃度與所添加硝酸鈉的量成正比。

圖4 不同硝酸鈉添加量條件下3種N形態(tài)濃度變化Figure 4 The change diagram of concentration of three nitrogen species under different sodium nitrogen addition

2.3 厭氧條件下不同乙酸鈉添加量對膨潤土中N、As形態(tài)的影響

乙酸鈉是土壤中較為常見的小分子有機酸，Azelee 等[32]通過螯合法研究銅綠假單胞菌（Pseudomo-nas aeruginosa）中重金屬的去除率，發(fā)現(xiàn)乙酸鈉對As的去除率為59.50%。因此可以推測在細菌存在的厭氧體系下，乙酸鈉的加入可以有效減少As 濃度。由圖5 可看出，在含有乙酸鈉的實驗體系中，As（Ⅴ）的還原率明顯高于未添加乙酸鈉的控制組。在低乙酸鈉（0.2 g）添加的條件下，As（Ⅲ）濃度從第3 天開始迅速升高，在第5 天達到最高濃度3 233 μg·L-1，為控制組（1 208 μg·L-1）的2.7 倍。與控制組相比，添加乙酸鈉的條件下As（Ⅲ）濃度的升高，明顯多于As（Ⅴ）濃度的減少，說明膨潤土中吸附的As（Ⅴ）也被釋放還原。這可能是因為醋酸鹽等小分子有機酸可以作為電子穿梭體，在礦物表面的微生物C 源氧化和溶液As（Ⅴ）還原吸附之間穿梭，從而提高As（Ⅴ）的還原率。如圖5B所示，在低乙酸鈉添加的條件下，As（Ⅴ）濃度在第5天幾乎接近于0 μg·L-1，說明SRB還原As（Ⅴ）的效率得到了極大的提高。高乙酸鈉（0.5 g）添加使得實驗體系中的As（Ⅴ）濃度升高，更多的As（Ⅴ）還原成As（Ⅲ），As（Ⅲ）在第5天的濃度為3 548 μg·L-1，是低乙酸鈉條件下的1.1倍，且As（Ⅲ）濃度持續(xù)升高至實驗結(jié)束。通過計算在低乙酸鈉和高乙酸鈉兩種添加條件下求得的平均As（Ⅲ）濃度（1 370、1 663 μg·L-1）約為控制組（667 μg·L-1）的2.0倍和2.5倍。

圖5 厭氧條件下不同乙酸鈉添加量的膨潤土中As形態(tài)的濃度變化Figure 5 Arsenic species transformation in the presence of bentonite under under different sodium acetate addition

圖6 不同乙酸鈉添加條件下3種N形態(tài)濃度變化Figure 6 The change diagram of concentration of three nitrogen species under different sodium acetate addition

2.4 厭氧條件下不同腐植酸添加量對膨潤土中N、As形態(tài)的影響

腐植酸是農(nóng)業(yè)土壤中常見且最具代表性的高分子有機物，也是影響土壤重金屬形態(tài)和活性的關(guān)鍵組分[33]。如圖7 所示，與控制組（無腐植酸）相比，加入腐植酸的實驗組As（Ⅴ）還原成As（Ⅲ）的效率明顯降低，隨著腐植酸添加量的增多，實驗體系中的As（Ⅴ）還原效果降低，總As 濃度也隨之減小。在腐植酸濃度為0.002 g·L-1的環(huán)境下，As（Ⅲ）濃度在第3 天達到還原釋放的最高濃度（1 150 μg·L-1），然后逐漸降低至0 μg·L-1，在4~7 d 時，As（Ⅴ）濃度有逐漸升高的趨勢。當(dāng)實驗體系中的腐植酸濃度達到0.02 g·L-1時，As（Ⅲ）濃度達到最高濃度，但僅有181 μg·L-1，遠低于控制組還原釋放的As（Ⅲ）濃度（1 208 μg·L-1）。Ko等[34]研究了腐植酸對As 的吸附和解吸動力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)腐植酸在As 的氧化還原反應(yīng)中起到一定的作用，并且發(fā)現(xiàn)腐植酸的存在更有利于As的氧化。

圖7 厭氧條件下不同腐植酸添加量的膨潤土中As形態(tài)的濃度變化Figure 7 Arsenic species transformation in the presence of bentonite under different humic acid addition

圖8 不同腐植酸添加條件下3種N形態(tài)濃度變化Figure 8 The change diagram of concentration of three nitrogen species under different humic acid addition

2.5 亞硝酸鹽對As氧化還原的影響

綜合分析不同SRB活性、外源N和乙酸鈉的實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度較高時，As（Ⅲ）的濃度也在升高，以此推測和As（Ⅲ）之間可能存在一定的聯(lián)系，為此開展了厭氧條件下亞硝酸鹽對SRB 作用的As（Ⅴ）還原的影響。如圖9所示，亞硝酸鹽注入后的1 h內(nèi)，其部分氧化成了，部分還原成了，As（Ⅲ）濃度達到了8.5 μg·L-1并逐漸升高，到實驗結(jié)束的第5小時，As（Ⅲ）濃度升高至14.6 μg·L-1，說明的存在有可能促進As（Ⅴ）還原成As（Ⅲ）。結(jié)合圖9 中濃度的降低和濃度的升高，推測得出以下方程式：

圖9 添加亞硝酸鹽后As(Ⅲ)和N濃度的變化Figure 9 Changes of As(Ⅲ)and nitrogen species concentration after adding nitrite

3 結(jié)論

（1）通過對比厭氧條件下不同營養(yǎng)條件膨潤土固-液體系中N 和As的變化，得出最適合硫酸鹽還原菌（Desulfovibrio vlugarisMiyazaki SRB）生長的條件，更有利于As（Ⅴ）還原生成As（Ⅲ），此時N 的濃度也維持在一個很高的水平，說明SRB 活性越強，還原生成的As（Ⅲ）濃度越高，對體系中的N也得到了固定。

（2）厭氧膨潤土固-液體系中，外源N的添加明顯促進了As（Ⅴ）的還原。在沒有外源N 添加的控制組幾乎檢測不出As（Ⅲ），并且隨著外源N 的增加，體系中成銨作用和反硝化作用也變得更加明顯。

（3）大分子有機物腐植酸和小分子有機物乙酸鈉對厭氧膨潤土固-液體系中As（Ⅴ）的還原表現(xiàn)出不同的效果。在厭氧條件下，高乙酸鈉添加的膨潤土生成釋放As（Ⅲ）的濃度約為未添加乙酸鈉的膨潤土的2.1倍，濃度也明顯升高。而腐植酸的添加對As（Ⅴ）的還原起到了明顯的抑制作用，促進了的生成。