［摘要］牙源性干細(xì)胞（DSCs）具有很好的自我更新及多向分化的潛能，是再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞。但DSCs衰老導(dǎo)致的增殖分化能力及細(xì)胞生理功能的衰退嚴(yán)重阻礙了其應(yīng)用。自噬通過維持細(xì)胞的代謝穩(wěn)態(tài)，在DSCs的衰老過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本文從自噬對DSCs 衰老的作用以及抗衰老藥物對DSCs自噬的影響作一綜述，以期為深入探索DSCs 衰老的研究及防治老年病建立基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］自噬；牙源性干細(xì)胞；衰老；抗衰老

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2023.05.020

Advancements in Understanding Autophagy's Role in Dental Stem Cell Aging

Zhan Luoning，Li Chunwang，Zuo Linjing，Gao Wenjia，Xie Xiaoyu，Li Yi**

Hospital of Stomatology，Jilin University，Changchun130021

**Corresponding author：Li Yi，email：lyi99@jlu.edu.cn

［Abstract］Dental stem cells（DSCs） possess remarkable potential for self-renewal and differentiation in multiple directions，making them invaluable seed cells in the domains of regenerative medicine and tissue engineering.However，their utility is impeded by senescence，a process that diminishes their capacity for cellular proliferation，differentiation，and physiological function.Autophagy，a highly conserved catabolic process within cells，plays a pivotal role in the aging of odontogenic stem cells by maintaining cellular metabolic homeostasis.By actively investigating the mechanisms underlying autophagy in DSCs aging and exploring strategies to delay senescence，novel and rational treatment approaches can be developed for regenerative medicine.This article provides a comprehensive review of the impact of autophagy on the senescence of DSCs and the influence of lifespan extension on autophagy in odontogenic stem cells.The objective is to establish a solid foundation for future research on DSCs senescence and the prevention and treatment of age-related conditions.

［Key words］Autophagy;Dental stem cells;Aging;Anti-aging

牙源性干細(xì)胞（Dental stem cells，DSCs）是具有自我更新和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，如成骨分化、軟骨分化、成脂分化、類牙體硬組織分化、促血管分化及肌源分化等，在再生醫(yī)學(xué)與組織工程領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用［1-2］。具有來源豐富、低免疫原性和無倫理限制等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)來源，DSCs有牙髓干細(xì)胞 （Dental pulp stem cells，DPSCs）、牙周膜干細(xì)胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、牙齦干細(xì)胞（Gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）、根尖牙乳頭干細(xì)胞（Stem cells from apical papilla，SCAPs）、牙囊干細(xì)胞（Dental follicle stem cell，DFSCs）以及乳牙干細(xì)胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）［3］。細(xì)胞衰老會降低DSCs的增殖、克隆形成和分化潛力，以及免疫特性、細(xì)胞遷移和黏附能力，阻礙其應(yīng)用［4］。自噬是一種高度保守的分解代謝過程，通過降解受損分子和失調(diào)細(xì)胞器以及減輕病理和感染引起的應(yīng)激，維持細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)，在干細(xì)胞衰老的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［5］。本文關(guān)注于自噬在DSCs衰老中作用的研究進(jìn)展，并對其作一綜述。

1自噬的概況

自噬是一種為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而去除受損細(xì)胞器、聚集的蛋白質(zhì)和入侵病原體的高度保守的胞內(nèi)分解代謝過程［6］。在自噬過程中，細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器和大分子被一種雙膜囊泡細(xì)胞器—自噬體吞沒，隨后與溶酶體融合形成自溶酶體，其中的水解酶降解被捕獲物質(zhì)，產(chǎn)物則通過外排通透酶的作用釋放回細(xì)胞質(zhì)供其他代謝途徑利用［7］。因此，自噬與生長、發(fā)育、疾病、衰老等過程密切相關(guān)。

1.1自噬的類型

根據(jù)分解底物被輸送到溶酶體降解過程的不同，自噬的類型分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA）。①巨自噬是目前研究最為深入的經(jīng)典形式，簡稱為自噬。其最初被認(rèn)為是一種非選擇性過程，自噬體通過靶向胞內(nèi)受損大分子或亞細(xì)胞器，運(yùn)輸?shù)饺苊阁w降解［8］。但隨著選擇性自噬受體如自噬相關(guān)基因的相互作用模體（Atg8-family interacting motif，AIM），或人微管相關(guān)蛋白輕鏈3相互作用域（Microtubule associated proteins interacting region，LIR）的發(fā)現(xiàn)，自噬逐漸被認(rèn)為是一種高度選擇性的細(xì)胞清除途徑，根據(jù)溶酶體降解的特定底物進(jìn)行分類，主要包括聚集自噬（蛋白質(zhì)聚集體）、脂肪自噬（脂肪顆粒）、線粒體自噬（線粒體）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）、糖噬（糖原）和異體自噬（病原微生物）等［8-9］。 ②微自噬是指溶酶體限制性膜直接內(nèi)陷，包裹衰老或變異蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，進(jìn)而被溶酶體內(nèi)各種溶解酶分解代謝的過程［10］。③CMA是一種高度選擇性的溶酶體依賴性降解過程。協(xié)助蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分子伴侶蛋白，即熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）特異性識別胞內(nèi)具有 KFERQ 五肽序列片段的自噬底物，并與其他分子伴侶蛋白形成復(fù)合體，靶向到溶酶體表面與LAMP2A受體結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔內(nèi)進(jìn)行降解［11］。

1.2自噬的過程

自噬的發(fā)生過程可分為5個(gè)階段：起始、囊泡成核、囊泡延伸、囊泡融合、底物降解。①起始階段：機(jī)體接收到自噬誘導(dǎo)信號如饑餓、氧化應(yīng)激及病原體入侵后，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（Mammalian target of rapamycin-1，mTOR-1），激活單磷酸腺苷活化激酶（Adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase，AMPK）促使自噬啟動蛋白1 （Unc-51-like kinase 1，ULK1）復(fù)合物易位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，激活磷脂酰肌醇3激酶3（Phosphatidylinositol 3 kinase 3，PIK3C3）復(fù)合物，促進(jìn)自噬體膜的形成并啟動自噬的發(fā)生［12-13］。②囊泡成核：自噬相關(guān)蛋白Beclin 1在自噬囊泡成核階段發(fā)揮著重要角色。Beclin 1-PIK3C3復(fù)合物包括hVPS34、Beclin 1和p150蛋白及一系列相關(guān)蛋白如Bcl-2、VPS15、UVRAG、BIF-1、Atg14L等，募集胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成自噬體膜［14］。③囊泡延伸：自噬相關(guān)蛋白質(zhì)聚集到自噬前體的雙層膜外側(cè)形成復(fù)合物，控制雙層膜的曲度并募集游離膜使膜不斷延伸，同時(shí)，游離于細(xì)胞質(zhì)的LC3- I與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，轉(zhuǎn)位到自噬體膜上，轉(zhuǎn)化成LC3- Ⅱ，參與前自噬囊泡的延伸［7］。④囊泡融合：自噬囊泡與溶酶體在RAB蛋白、SNARE蛋白和HOPS復(fù)合物的輔助下通過微管骨架連接，溶酶體酶降解自噬囊泡的內(nèi)膜，形成自噬溶酶體［7，15］。⑤底物降解：LC3-Ⅱ與含有LIR的自噬受體，如p62等結(jié)合后，自噬溶酶體中的溶酶體酶使內(nèi)容物降解成脂肪酸、氨基酸和核酸等小分子被細(xì)胞循環(huán)再利用［16］。

2自噬在DSCs衰老中的作用

盡管應(yīng)用DSCs的干細(xì)胞療法已被證明是治療各種損傷和疾病的有效療法，但DSCs衰老卻嚴(yán)重影響了其在臨床復(fù)雜環(huán)境中的后續(xù)治療效果［17］。DSCs在體外長期培養(yǎng)后，會出現(xiàn)增殖能力下降、細(xì)胞周期阻滯、衰老相關(guān)蛋白p53/p21高表達(dá)等衰老相關(guān)跡象［17-18］。因此，為獲取足夠數(shù)量的健壯細(xì)胞或延長體外細(xì)胞擴(kuò)增，探索衰老對DSCs生命周期的影響則顯得尤為重要。在細(xì)胞衰老過程中，β-半乳糖苷酶高表達(dá)、活性氧積累、DNA損傷、線粒體功能障礙、代謝改變、表觀遺傳修飾或端粒酶異常等均發(fā)揮著不可小覷的影響［19］。但值得注意的是，越來越多的證據(jù)表明，自噬的發(fā)生在衰老干細(xì)胞中比其他類型細(xì)胞更加頻繁［20］。這或許是一個(gè)減弱DSCs衰老的新思路、新靶點(diǎn)。目前自噬在DSCs衰老中作用的研究大多聚焦于PDLSCs、DPSCs及DFSCs。

2.1自噬在PDLSCs衰老中的作用

細(xì)胞自噬是一個(gè)連續(xù)的過程，從自噬體形成到降解的過程則稱為自噬通量［21］。將PDLSCs從第二代傳代至第十五代，自噬溶酶體的數(shù)量減少，這種趨勢的變化并不是其降解導(dǎo)致的，而是長期傳代后的細(xì)胞自噬通量被阻斷的結(jié)果［16］。此外，參與自噬體延伸的LC3-Ⅱ是目前自噬體和自噬通量檢測中最廣泛使用的標(biāo)志物，主要定位于自噬體的外膜和內(nèi)膜上，其表達(dá)水平隨著自噬體與溶酶體融合及隨后被溶酶體降解而降低［22］。當(dāng)溶酶體的形成受到抑制后，LC3-Ⅱ在年輕一代的PDLSCs中顯著積累，而在第十五代PDLSCs中的表達(dá)則未受影響，除此之外，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞內(nèi)表征降解底物的p62蛋白逐漸升高，而Atg7和Beclin-1等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)則逐漸下降，表明隨著細(xì)胞傳代的增加，自噬體的形成受到了顯著抑制，而非自噬溶酶體的降解增加［16］。

2.2自噬在DPSCs衰老中的作用

DPSCs中的自噬活性是確保亞細(xì)胞成分周轉(zhuǎn)和降解的基本機(jī)制，但自噬在DPSCs衰老中的確切作用仍然難以捉摸［23-24］。線粒體自噬常見于年輕的牙髓細(xì)胞中［25］。該途徑避免了牙髓細(xì)胞中溶酶體內(nèi)碎片的積累，從而維持正常生理功能，但在衰老的牙髓細(xì)胞中，脂褐素在溶酶體內(nèi)的進(jìn)行性累積標(biāo)志著溶酶體活性降低，自噬被顯著抑制，細(xì)胞活力和分泌功能嚴(yán)重受損［23，26］。衰老的DPSCs中可以觀察到大量的自噬囊泡，自噬相關(guān)蛋白Atg5、LC3-1A/1B及Beclin-1和細(xì)胞間黏附分子增加，而過氧化物酶體增殖物激活的受體γ和血紅素加氧酶1的表達(dá)下降［27］。其中，過氧化物酶體增殖物激活的受體γ可以激活衰老DPSCs中的線粒體活性和細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)血紅素加氧酶1和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低衰老DPSCs中的炎癥因子的表達(dá)，在DPSCs的生命周期內(nèi)通過調(diào)節(jié)自噬來維持牙髓生理穩(wěn)態(tài)［28］。但總的來說，誘導(dǎo)自噬通常與抑制細(xì)胞衰老有關(guān)，并且對細(xì)胞的持續(xù)存活非常重要。

2.3自噬在DFSCs衰老中的作用

將DFSCs體外擴(kuò)增至第十二代時(shí)便會出現(xiàn)衰老跡象，AMPK活性嚴(yán)重受損，但自噬相關(guān)蛋白LC3 a / b Ⅱ 與LC3 a / b I的比值卻未見明顯變化［29］。直接抑制自噬蛋白Atg12的表達(dá)可以促進(jìn)DFSCs的衰老，有趣的是，無論激活還是下調(diào)AMPK的活性均可以抑制DFSCs中的自噬并加劇DFSCs的衰老［20，29］。

3改善自噬，抵抗DSCs衰老的策略

3.1通過褪黑素改善自噬，抵抗DSCs衰老

褪黑素可以通過激活抗氧化防御系統(tǒng)，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，維護(hù)干細(xì)胞自我更新及分化潛能［30］。褪黑素可以激活PDLSCs中的褪黑素受體，從而下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路來恢復(fù)細(xì)胞自噬，并減弱PDLSCs的衰老［17］。此外，褪黑素還可以通過SIRT2依賴性途徑，減弱過氧化氫H2O2刺激的p38絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化，降低了衰老相關(guān)蛋白p16的表達(dá)，保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的過早衰老［31］。

3.2通過二甲雙胍改善自噬，抵抗DSCs衰老

二甲雙胍是AMPK和自噬的誘導(dǎo)劑，可以顯著抑制細(xì)胞衰老［32］。但最近的一項(xiàng)研究表明，二甲雙胍激活了AMPK后，自噬受損，加劇了DFSCs的衰老，這可能是由于長期應(yīng)用二甲雙胍治療后，AMPK的激活誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的消耗，降低了DFSCs中的NAD+/NADH比值，誘發(fā)了線粒體功能障礙，從而加劇了細(xì)胞的衰老［29］。PDLSCs暴露于H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激時(shí)，二甲雙胍可降低 反應(yīng)活性氧水平，增強(qiáng)抗氧化能力［33］。另外，二甲雙胍預(yù)處理可以抵御氧化應(yīng)激下PDLSCs的衰老，而加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的效應(yīng)，說明二甲雙胍對PDLCs的保護(hù)作用可能是通過自噬介導(dǎo)的［34］。二甲雙胍也可以通過調(diào)控自噬相關(guān)AMPK/mTOR信號通路下調(diào)微RNA miR-34a-3p，上調(diào)鈣結(jié)合蛋白39，從而緩解DPSCs的衰老［32］。因此，二甲雙胍對DSCs衰老的抑制作用表現(xiàn)出了其作為DSCs衰老治療靶點(diǎn)藥物的優(yōu)良潛力。

4小結(jié)與展望

不同DSCs衰老的機(jī)制和對環(huán)境改變的反應(yīng)不盡相同，自噬參與了DSCs衰老過程的調(diào)節(jié)，但相關(guān)性研究并不深入，而抗衰藥物誘導(dǎo)自噬在DSCs衰老過程中系統(tǒng)性的作用機(jī)制仍不明朗。深度探索自噬在維持DSCs功能并延緩衰老過程的作用機(jī)制，有利于為科研人員提供較為全面的信息，也為促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新靶點(diǎn)、新策略。

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（2023-03-13收稿）