顧祥文 王強(qiáng)

摘要 以公共數(shù)據(jù)庫所有組裝完整的銅綠假單胞菌基因組為研究對象，針對其2個(gè)紅素氧還蛋白的編碼基因（rubA2和rubA1）及鑒定出的蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)的演化分析。結(jié)果表明，其中一個(gè)紅素氧還蛋白的編碼基因來源于基因組中祖先基因的復(fù)制，而非其他物種的水平基因轉(zhuǎn)移。由于基因的功能分化，rubA2編碼的紅素氧還蛋白可能發(fā)揮電子傳遞以外的生物學(xué)功能，主要為DNA的轉(zhuǎn)錄和RNA的生成。該研究為微生物重要基因的演化和功能分化提供了參考，同時(shí)也揭示了一種銅綠假單胞菌增強(qiáng)侵染人類、牲畜和家禽能力的潛在機(jī)制。

關(guān)鍵詞 銅綠假單胞菌；基因復(fù)制；功能分化；演化分析；紅素氧還蛋白；電子傳遞系統(tǒng)

中圖分類號 Q36? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）12-0009-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.002

Evolutionary Analysis of Rubredoxin from Pseudomonas aeruginosa

GU Xiang-wen， WANG Qiang

（School of Life Sciences， Nanjing University， Nanjing， Jiangsu 210000）

Abstract Taking the all completely assembled P. aeruginosa genomes from public databases as the research object， a systematic evolutionary analysis was conducted on its two encoding genes for rubredoxins （rubA2 and rubA1） and the identified protein sequences.The results showed that one of the genes coding for rubredoxin originated from the duplication of an ancestral gene in the genome， rather than from the horizontal gene transfer of other species. Due to the functional differentiation of genes， the rubA2-encoded rubredoxin was likely to perform biological functions other than electron transfer， mainly for DNA transcription and RNA production. This study not only provides a reference for the evolution and functional differentiation of important microbial genes， but also reveals a potential mechanism for P. aeruginosa to enhance its infection ability to humans， livestock and poultry.

Key words Pseudomonas aeruginosa;Gene duplication;Functional differentiation;Evolutionary analysis;Rubredoxin;Electron transport system

作者簡介 顧祥文（1997—），男，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：植物與微生物的基因演化。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物的基因演化研究。

收稿日期 2022-08-23

銅綠假單胞菌是一種廣泛分布于土壤、動物、植物、臨床等其他環(huán)境的革蘭氏陰性菌［1］。作為醫(yī)院常見的條件致病菌之一，銅綠假單胞菌可能會引起泌尿道、呼吸道、燒傷創(chuàng)面和菌血癥等嚴(yán)重感染［2］。除了人類之外，在牛、豬、雞等牲畜和家禽中同樣分離出了具有致病性的銅綠假單胞菌，因此可能對畜牧業(yè)造成嚴(yán)重危害［3-5］。此外，銅綠假單胞菌也能夠利用代謝產(chǎn)物降解環(huán)境中的去污劑、原油等污染物［6-7］。銅綠假單胞菌的基因組大小約為6.3 Mbp，大于大多數(shù)細(xì)菌［8］。生存環(huán)境的多樣性和較大的基因組意味著該物種可能獲得了更多環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的基因，這些基因可能來源于基因組中祖先基因的復(fù)制，也可能來源于其他物種的水平基因轉(zhuǎn)移［9］。

紅素氧還蛋白（rubredoxin）是細(xì)菌和古菌中發(fā)現(xiàn)的具有氧化還原活性的鐵硫蛋白，大小約為6 kD［10-11］。銅綠假單胞菌的2個(gè)紅素氧還蛋白分別由rubA2（PA5350）和rubA1（PA5351）編碼，它們是碳代謝相關(guān)的電子傳遞系統(tǒng)中的重要成員［12-13］。盡管已經(jīng)有研究解析了銅綠假單胞菌紅素氧還蛋白及其互作蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，并證明了電子傳遞系統(tǒng)對銅綠假單胞菌在具有正構(gòu)烷烴的環(huán)境中生長的重要性［14］，但該系統(tǒng)可能還存在更加普遍的作用［15］。因此，研究銅綠假單胞菌2個(gè)紅素氧還蛋白的進(jìn)化來源和潛在的功能差異，有助于更多地發(fā)掘電子傳遞系統(tǒng)在銅綠假單胞菌生長、代謝中的功能。該研究對銅綠假單胞菌的2個(gè)紅素氧還蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的演化分析，推測了二者在進(jìn)化上的起源，并在此基礎(chǔ)上通過共表達(dá)基因的功能聚類探究了銅綠假單胞菌2個(gè)紅素氧還蛋白的功能分化情況。

1 材料與方法

1.1 蛋白鑒定

于2022年3月從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）下載銅綠假單胞菌所有公開的菌株的基因組序列。紅素氧還蛋白（Pfam登錄號PF00301）的氨基酸序列分別通過HMMER 3.3.2的hmmsearch和hmmscan［16］在Pfam 35.0［17］中進(jìn)行鑒定。將序列比對中的參數(shù)E值＜1×10-20的序列取交集合并。隨后，以E值＜1×10-5為閾值，連續(xù)進(jìn)行多輪蛋白質(zhì)Blast［18］，即將匹配到的序列作為下一輪的查詢序列，直到檢索不出新的序列。

1.2 進(jìn)化樹的構(gòu)建

通過hmmsearch鑒定出用于系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的120種細(xì)菌蛋白（bac120）［19］的氨基酸序列。用MUSCLE v3.8.1551［20］對bac120和鑒定出的紅素氧還蛋白序列進(jìn)行比對，并用trimAl v1.4［21］修正基于bac120序列比對較差的區(qū)域。隨后使用FastTree v2.1.11［22］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和蛋白進(jìn)化樹，并用iTOL v6［23］對樹進(jìn)行注釋。

1.3 泛基因組分析

通過PPanGGOLiN 1.2.78［24］對391株銅綠假單胞菌的基因組序列進(jìn)行泛基因組分析，再通過Gephi 0.9.5［25］實(shí)現(xiàn)泛基因組圖的可視化。

1.4 基因島分析

于2022年3月從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載γ-變形菌綱中相應(yīng)菌株的Genebank文件，用Clinker v0.0.23［26］進(jìn)行序列比對并實(shí)現(xiàn)基因共線性與相似性的可視化。

1.5 dN/dS計(jì)算

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫下載所有銅綠假單胞菌菌株的2個(gè)紅素氧還蛋白的CDS序列。用MEGA X［27］的Nei-Gojobori（Jukes-Cantor校正）［28］法計(jì)算非同義替換率（dN）和同義替換率（dS），最終的dN/dS為每個(gè)菌株兩兩配對dN/dS的平均值。

1.6 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）

銅綠假單胞菌PAO1在不同處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫和假單胞菌基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.pseudomonas.com/）下載。由于不同數(shù)據(jù)集在數(shù)據(jù)量和測序深度上存在差異，因此僅從23個(gè)歸一化的GDS數(shù)據(jù)集中選取15個(gè)有GSE原始數(shù)據(jù)的進(jìn)行后續(xù)分析。用R語言affy軟件包［29］中的函數(shù)RMA對GSE原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。203個(gè)樣本按照處理?xiàng)l件分成40個(gè)測試組，經(jīng)過3個(gè)-3個(gè)隨機(jī)配對，共得到64 000個(gè)條件組合。用R語言WGCNA軟件包［30］分別對2個(gè)不同的紅素氧還原蛋白基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。設(shè)定閾值＞μ+2σ以篩選出具有實(shí)際統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的共表達(dá)基因。共表達(dá)基因通過DAVID 2021［31］進(jìn)行聚類和注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅素氧還蛋白在細(xì)菌中的分布情況

為了從整體上了解紅素氧還蛋白在細(xì)菌中的存在情況，首先選取了來自厚壁菌門、放線菌門、衣原體門和變形菌門中15個(gè)模式生物的典型菌株，從中共鑒定出12個(gè)紅素氧還蛋白。分別構(gòu)建了這15個(gè)模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹和紅素氧還蛋白的進(jìn)化樹（圖1）。紅素氧還蛋白主要存在于變形菌門中，而在厚壁菌門的3個(gè)菌株中均不存在。銅綠假單胞菌PAO1中鑒定出2種不同的紅素氧還蛋白。

隨后，以假單胞菌屬為重點(diǎn)關(guān)注對象，系統(tǒng)地鑒定了紅素氧還蛋白在銅綠假單胞菌所在的γ-變形菌綱中的存在情況。γ-變形菌綱的43個(gè)科中，有20個(gè)科鑒定出了紅素氧還

蛋白，其中絕大多數(shù)科的紅素氧還蛋白的拷貝數(shù)都不大于1。

對于銅綠假單胞菌以外的假單胞菌物種，僅產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、耳炎假單胞菌（Pseudomonas otitidis）和拉爾寬假單胞菌（Pseudomonas lalkuanensis）擁有3個(gè)拷貝，其他假單胞菌的拷貝數(shù)均小于2（表1）。

在391個(gè)完整組裝的銅綠假單胞菌菌株的基因組中，共鑒定出783個(gè)紅素氧還蛋白，它們平均分布在蛋白進(jìn)化樹的2個(gè)分支上，即所有銅綠假單胞菌菌株穩(wěn)定擁有2個(gè)紅素氧還蛋白（圖2）。

2.2 銅綠假單胞菌2個(gè)紅素氧還蛋白的演化來源

首先，在銅綠假單胞菌物種水平內(nèi)確定2個(gè)紅素氧還蛋白編碼基因在基因組上的穩(wěn)定性。除了最為典型的PAO1菌株外，額外選取了2個(gè)典型的銅綠假單胞菌菌株P(guān)A7和UCBPP_PA14，進(jìn)行基因的相似性和共線性分析。不同菌株相同紅素氧還蛋白的相似性為100%，相鄰紅素氧還蛋白的相似性也高達(dá)82%，且其上下游基因具有極高的共線性（圖3）。

為了探究該現(xiàn)象在391個(gè)銅綠假單胞菌菌株中是否具有普遍性，還進(jìn)行了銅綠假單胞菌的泛基因組分析，結(jié)果如圖4所示，紅色圓點(diǎn)表示的2個(gè)紅素氧還蛋白的上下游均為橙色圓點(diǎn)代表的“核心基因”，表明紅素氧還蛋白周圍不存在新獲得的基因?；驆u分析和泛基因組分析的結(jié)果證明，在銅綠假單胞菌物種水平內(nèi)，2個(gè)紅素氧還蛋白皆已穩(wěn)定地存在于基因組上，需要在更大范圍內(nèi)進(jìn)一步尋找基因的演化起源。

進(jìn)一步構(gòu)建了假單胞菌屬水平的系統(tǒng)發(fā)育樹和紅素氧還蛋白的進(jìn)化樹（圖5）。一方面，盡管一些假單胞菌部分菌株的紅素氧還蛋白拷貝數(shù)＞1（表1），但其代表性菌株僅擁有單拷貝，說明大部分假單胞菌物種并非穩(wěn)定擁有2個(gè)紅素氧

還蛋白，體現(xiàn)了銅綠假單胞菌的特殊性；另一方面，雖然銅綠假單胞菌2個(gè)紅素氧還蛋白之間的相似性高達(dá)82%，但是rubA2位于進(jìn)化樹中相對獨(dú)立的分支上，表明其序列與大部分假單胞菌的紅素氧還蛋白存在一定的差異，其蛋白功能可能也因此產(chǎn)生了分化。

為了進(jìn)一步確認(rèn)銅綠假單胞菌其中一個(gè)紅素氧還蛋白是否來源于其他物種的水平基因轉(zhuǎn)移，構(gòu)建了整個(gè)γ-變形菌綱的紅素氧還蛋白的進(jìn)化樹（圖6）。在圖6中綠色標(biāo)注的假單胞菌屬的物種之間存在幾個(gè)來源于其他科的物種，可能作為水平基因轉(zhuǎn)移的來源。然而，進(jìn)一步的基因島分析（圖7）表明銅綠假單胞菌的2個(gè)紅素氧還蛋白與這幾個(gè)物種唯一的紅素氧還蛋白相似程度幾乎相同（如0.78、0.76），而非其中一個(gè)拷貝與其他物種相似度較高，另一個(gè)則較低的情況。根據(jù)上述結(jié)果，銅綠假單胞菌其中一個(gè)紅素氧還蛋白的編碼基因來源于自身基因組中祖先基因的復(fù)制，而非其他物種的水平基因轉(zhuǎn)移。

2.3 銅綠假單胞菌2個(gè)紅素氧還蛋白的功能分化

重復(fù)基因是祖先基因在自然選擇壓力的驅(qū)動下，經(jīng)歷新功能化、亞功能化或無功能化后產(chǎn)生并在基因組中保留的［32］。計(jì)算了銅綠假單胞菌2個(gè)紅素氧還蛋白編碼基因的dN/dS以衡量它們受到的選擇壓力，發(fā)現(xiàn)二者的dN/dS頻率分布基本相同且均小于1（圖8A），表明2個(gè)編碼基因皆受到強(qiáng)烈的負(fù)選擇，在基因組中的存在較為穩(wěn)定，在生物體的進(jìn)化過程中發(fā)揮十分重要的作用。dS的計(jì)算結(jié)果則進(jìn)一步表明rubA2的進(jìn)化速率快于rubA1（圖8B）。

為了進(jìn)一步探究2個(gè)紅素氧還蛋白來源于祖先基因的新功能化、亞功能化還是無功能化，進(jìn)行了加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，從16個(gè)公開的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中尋找2個(gè)紅素氧還蛋白的共表達(dá)基因。值得注意的是，二者分別尋找到94和80個(gè)共表達(dá)基因，但這其中僅有4個(gè)交集基因。GO分析結(jié)果（圖9）表明，rubA1負(fù)責(zé)離子與環(huán)狀化合物的結(jié)合；rubA2的功能則與rubA1有所不同，可能參與DNA的轉(zhuǎn)錄和RNA的生成。

因?yàn)榈鞍椎墓δ芘c蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)，利用RoseTTAFold［33］預(yù)測了rubA1和rubA2編碼的紅素氧還蛋白的三維結(jié)構(gòu)，二者幾乎完全一致（圖10）。查詢假單胞菌基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.pseudomonas.com/）得知，盡管rubA1和rubA2在銅綠假單胞菌的基因組上相鄰，但rubA2受到的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能不如rubA1完備（圖11）。因此，2個(gè)紅素氧還蛋白潛在的功能差異并不是蛋白結(jié)構(gòu)的差異造成的，而可能是轉(zhuǎn)錄調(diào)控驅(qū)動的。

3 結(jié)論與討論

該研究嚴(yán)格鑒定了紅素氧還蛋白在γ-變形菌綱尤其是假單胞菌屬中的分布情況。隨后，通過系統(tǒng)發(fā)育樹和蛋白進(jìn)化樹的構(gòu)建、泛基因組分析及基因島分析證明了銅綠假單胞菌的其中一個(gè)紅素氧還蛋白編碼基因很大程度上可能來源于自身的基因復(fù)制，而非其他物種的水平基因轉(zhuǎn)移。共表達(dá)基因的GO分析結(jié)果表明，rubA1編碼的紅素氧還蛋白主要參與離子與環(huán)狀化合物的結(jié)合，而rubA2則可能參與DNA的轉(zhuǎn)錄與RNA的生成?？紤]到假單胞菌屬水平的紅素氧還蛋白進(jìn)化樹中，rubA2遠(yuǎn)離大部分假單胞菌物種的紅素氧還蛋白，位于較為獨(dú)立的分支上，該研究認(rèn)為rubA1編碼的紅素氧還蛋白保留了原有的功能，而rubA2編碼的紅素氧還蛋白則經(jīng)歷了對生物體有利的功能分化，從而使2個(gè)紅素氧還蛋白的編碼基因得以在基因組中共同保留。至于rubA2的GO功能聚類得到的基因數(shù)量較少，p值也大于rubA1，很可能是因?yàn)閞ubA2尚未形成完整的功能網(wǎng)絡(luò)。

至于研究過程中發(fā)現(xiàn)的擁有3個(gè)紅素氧還蛋白的耳炎假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌和拉爾寬假單胞菌來源于石油或農(nóng)藥污染的海洋或土壤，而耳炎假單胞菌則來源于臨床環(huán)境。因此，驅(qū)動紅素氧還蛋白基因復(fù)制的因素可能是多樣的，可能源自環(huán)境中越來越多有待降解的污染物，也可能源自臨床上抗生素的過度使用。

此前，曾有研究報(bào)道部分銅綠假單胞菌菌株通過水平基因轉(zhuǎn)移額外獲得了一個(gè)脂肪酶（LipC2）［34］。作為臨床常見的條件致病菌，更強(qiáng)的脂肪分解能力意味著銅綠假單胞菌獲得了更強(qiáng)的人體侵染毒力［34］。在該研究中，2個(gè)具有不同功能的紅素氧還蛋白完善了電子傳遞系統(tǒng)，從而使得銅綠假單胞菌能夠?qū)⑷祟?、牲畜和家禽的脂肪分解生成的飽和脂肪酸更好地氧化分解為水和二氧化碳，并從中攝取該反應(yīng)釋放的大量能量，進(jìn)一步增強(qiáng)自身的侵染毒力。該研究不僅為微生物重要基因的演化起源和功能分化的相關(guān)研究提供參考，同時(shí)也揭示了銅綠假單胞菌增強(qiáng)侵染毒力的潛在機(jī)制。作為臨床和畜牧環(huán)境中常見的致病菌，更加深入地了解銅綠假單胞菌的侵染和致病機(jī)制，可以更好地指導(dǎo)預(yù)防和治理活動，降低其對于人體健康和畜牧產(chǎn)業(yè)造成的危害。

參考文獻(xiàn)

［1］ KLOCKGETHER J，CRAMER N，WIEHLMANN L，et al.Pseudomonas aeruginosa genomic structure and diversity［J］.Front Microbiol，2011，2：1-18.

［2］ 張明月，胡福泉，黃廣濤.銅綠假單胞菌必需基因的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2021，48（6）：2143-2154.

［3］ 劉勃興，趙安奇，康圓圓，等.一株牛源銅綠假單胞菌的分離鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2020（16）：69-72，165.

［4］ 吳建華，芮萍，馬增軍.豬源銅綠假單胞菌分離及部分生物學(xué)特性研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004（9）：57-58.

［5］ 李玲.雞銅綠假單胞菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［6］ HAGELUEKEN G，ADAMS T M，WIEHLMANN L，et al.The crystal structure of SdsA1，an alkylsulfatase from Pseudomonas aeruginosa，defines a third class of sulfatases［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（20）：7631-7636.

［7］ ABALOS A，VIAS M，SABAT J，et al.Enhanced biodegradation of Casablanca crude oil by a microbial consortium in presence of a rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa AT10［J］.Biodegradation，2004，15（4）：249-260.

［8］ DICENZO G C，F(xiàn)INAN T M.The divided bacterial genome：Structure，function，and evolution［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2017，81（3）：1-206.

［9］ KUNG V L，OZER E A，HAUSER A R.The accessory genome of Pseudomonas aeruginosa［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2010，74（4）：621-641.

［10］ LOVENBERG W，SOBEL B E.Rubredoxin：A new electron transfer protein from Clostridium pasteurianum［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1965，54（1）：193-199.

［11］ 李瑩，柳參奎.紅素氧還蛋白研究進(jìn)展［J］.草業(yè)科學(xué)，2016，33（6）：1118-1125.

［12］ MARN M M，YUSTE L，ROJO F.Differential expression of the components of the two alkane hydroxylases from Pseudomonas aeruginosa［J］.J Bacteriol，2003，185（10）：3232-3237.

［13］ VAN BEILEN J B，NEUENSCHWANDER M，SMITS T H，et al.Rubredoxinsinvolved in alkane oxidation［J］.J Bacteriol，2002，184（6）：1722-1732.

［14］ HAGELUEKEN G，WIEHLMANN L，ADAMS T M，et al.Crystal structure of the electron transfer complex rubredoxin rubredoxin reductase of Pseudomonas aeruginosa［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（30）：12276-12281.

［15］ SMITS T H M，WITHOLT B，VAN BEILEN J B.Functional characterization of genes involved in alkane oxidation by Pseudomonas aeruginosa［J］.Antonie van leeuwenhoek，2003，84（3）：193-200.

［16］ POTTER S C，LUCIANI A，EDDY S R，et al.HMMER web server：2018 update［J］.Nucleic Acids Res，2018，46（W1）：W200-W204.

［17］ MISTRY J，CHUGURANSKY S，WILLIAMS L，et al.Pfam：The protein families database in 2021［J］.Nucleic Acids Res，2021，49（D1）：D412-D419.

［18］ CAMACHO C，COULOURIS G，AVAGYAN V，et al.BLAST+：Architecture and applications［J］.BMC Bioinformatics，2009，10：1-9.

［19］ PARKS D H，RINKE C，CHUVOCHINA M，et al.Recovery of nearly 8，000 metagenome-assembled genomes substantially expands the tree of life［J］.Nat Microbiol，2017，2（11）：1533-1542.

［20］ EDGAR R C.MUSCLE：Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（5）：1792-1797.

［21］ CAPELLA-GUTIRREZ S，SILLA-MARTNEZ J M，GABALDN T.trimAl：A tool for automated alignment trimming in large-scale phylogenetic analyses［J］.Bioinformatics，2009，25（15）：1972-1973.

［22］ PRICE M N，DEHAL P S，ARKIN A P.FastTree 2：Approximately maximum-likelihood trees for large alignments［J］.PLoS One，2010，5（3）：1-10.

［23］ LETUNIC I，BORK P.Interactive Tree Of Life（iTOL）v5：An online tool for phylogenetic tree display and annotation［J］.Nucleic Acids Res，2021，49（W1）：W293-W296.

［24］ GAUTREAU G，BAZIN A，GACHET M，et al.PPanGGOLiN：Depicting microbial diversity via a partitioned pangenome graph［J］.PLoS Comput Biol，2021，17（12）：1-27.

［25］ BASTIAN M，HEYMANN S，JACOMY M.Gephi：An open source software for exploring and manipulating networks［J］.Proc Int AAAI Conf Web? Soc Media，2009，3（1）：361-362.

［26］ GILCHRIST C L M，CHOOI Y H.Clinker &clustermap.js：Automatic generation of gene cluster comparison figures［J］.Bioinformatics，2021，37（16）：2473-2475.

［27］ KUMAR S，STECHER G，LI M，et al.MEGA X：Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms［J］.Mol Biol Evol，2018，35（6）：1547-1549.

［28］ NEI M，GOJOBORI T.Simple methods for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions［J］.Mol Biol Evol，1986，3（5）：418-426.

［29］ GAUTIER L，COPE L，BOLSTAD B M，et al.Affy：Analysis of Affymetrix Gene Chip data at the probe level［J］.Bioinformatics，2004，20（3）：307-315.

［30］ LANGFELDER P，HORVATH S.WGCNA：An R package for weighted correlation network analysis［J］.BMC Bioinformatics，2008，9：1-13.

［31］ SHERMAN B T，HAO M，QIU J，et al.DAVID：A web server for functional enrichment analysis and functional annotation of gene lists（2021 update）［J］.Nucleic Acids Res，2022，50：W216-W221.

［32］ HIBBIT C.The princeton guide to evolution［J］.Am Biol Teach，2015，77（2）：151.

［33］ BAEK M，DIMAIO F，ANISHCHENKO I，et al.Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network［J］.Science，2021，373（6557）：871-876.

［34］ ZHANG Z H，ZHANG X H.Evolution of subfamily I.1 lipases in Pseudomonas aeruginosa［J］.Curr Microbiol，2021，78（9）：3494-3504.