董沙沙 車若琛 鄭必霞 張愛(ài)華 王春莉 白咪 陳穎

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南京 210000；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210000）

遺傳性低血磷性佝僂病/骨軟化癥是一組罕見(jiàn)的由鈣磷代謝紊亂引起的骨礦化異常性疾病，兒童主要表現(xiàn)為下肢畸形、身材矮小、牙釉質(zhì)發(fā)育不全等［1］。根據(jù)其病因不同，可分為多種類型，最常見(jiàn)的是由X連鎖磷酸調(diào)節(jié)中性肽酶同源物基因（phosphate-regulating gene with homologies to endopeptidases on the X chromosome，PHEX基因）突變引起的X 連鎖顯性低血磷性佝僂?。╔-linked dominant hypophosphatemic rickets，XLH或XLHR），發(fā)病率為1∶20 000～1∶25 000，占遺傳性低血磷性佝僂病的80%以上。PHEX基因定位于染色體Xp22.1，其編碼的蛋白質(zhì)可下調(diào)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23 （fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23） 表達(dá)。FGF23 可降低腎近曲小管刷狀緣膜上的鈉-磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ⅱa、Ⅱc 數(shù)量，從而增加腎臟的磷排泄［2］，也可通過(guò)抑制CYP27B1基因編碼的1α-羥化酶表達(dá)，刺激CYP24A1基因表達(dá)編碼24-羥化酶，減少1,25-二羥維生素D3，間接抑制腸道吸收磷，是XLH 的作用靶點(diǎn)。FGF23 活性形式為完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（intact fibroblast growth factor 23，iFGF23），當(dāng)其N 端信號(hào)肽被去除，Arg179 和Ser180之間的蛋白水解裂解將產(chǎn)生2個(gè)非活性片段（N-FGF23、C-FGF23）［3］，其中iFGF23的生物學(xué)功能最為活躍，能有效反映FGF23 與磷酸鹽負(fù)荷的關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)外尚未統(tǒng)一FGF23正常濃度范圍，而測(cè)量試劑盒種類多樣，其中日本Kainos 公司試劑盒一致性及穩(wěn)定性較好［4］。

低血磷性佝僂病需結(jié)合臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)及基因檢測(cè)明確診斷，但基因檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高，不利于低血磷性佝僂病的早期發(fā)現(xiàn)。我國(guó)低血磷性佝僂病患兒生存狀況調(diào)查分析顯示，患兒首次就醫(yī)未確診比例高達(dá)72.57%，60%以上經(jīng)歷過(guò)誤診，根據(jù)我中心研究數(shù)據(jù)，低血磷性佝僂病患兒平均確診時(shí)長(zhǎng)為42 個(gè)月，平均需去3家醫(yī)院才能確診［5］。早期診斷和治療可改善骨骼礦化代謝，避免嚴(yán)重下肢畸形與生長(zhǎng)遲緩［6］。靈敏度高、特異度強(qiáng)的生物標(biāo)志物是低血磷性佝僂病早診斷、早治療的關(guān)鍵。另一方面，布羅索尤單抗（burosumab）是FGF23 的單克隆抗體，可改善腎小管磷酸鹽重吸收、血清磷水平和線性生長(zhǎng)［7-8］，已被列為低血磷性佝僂病的一線治療用藥，但尚缺乏特異性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。目前，F(xiàn)GF23濃度研究主要集中于歐美及日本成人慢性腎臟病、腫瘤性骨軟化癥患者［9-10］，故本課題組擬通過(guò)橫斷面研究探討正常及患病兒童FGF23 濃度，分析其診斷價(jià)值，并探究其相關(guān)因素，為低血磷性佝僂病患兒的診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

以我院2016 年1 月—2021 年6 月期間收治的28 例低血磷性佝僂病患兒為佝僂病組，男性20 例（71%），女性8 例（29%）；0～＜5 歲7 例（25%），5～＜10 歲11 例（39%），10～＜18 歲10 例（36%）；XLH患兒24例（86%），臨床診斷為低血磷性佝僂病但基因檢測(cè)陰性者4 例（14%）。身高（長(zhǎng)）測(cè)量用于評(píng)估患兒生長(zhǎng)情況，并使用國(guó)際兒童和青少年在線輔助計(jì)算器將身高轉(zhuǎn)化為Z評(píng)分［11］。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）0～＜18歲經(jīng)基因檢測(cè)或臨床符合低血磷性佝僂病診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］的患兒；（2）入組前停服磷酸鹽制劑及維生素D至少2周；（3）無(wú)其他伴隨疾病，入組家屬對(duì)本次研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組前使用腎毒性藥物；（2）患有肝性、腎性、內(nèi)分泌功能障礙疾病。

以隨機(jī)抽樣方法隨機(jī)抽取2021 年6—7 月就診于南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童保健科的40 例健康體檢兒童為健康對(duì)照組，男性32 例（80%），女性8例（20%）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）0～＜18歲健康兒童；（2）近2 個(gè)月無(wú)服用磷酸鹽、維生素D 制劑；（3）檢驗(yàn)其肝腎功能、電解質(zhì)、尿鈣、尿磷均正常；（4）家族中無(wú)相關(guān)遺傳性、慢性及其他異常疾病史。

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（202103041-1）。

1.2 基因檢測(cè)

22例（79%）患兒基因檢測(cè)采用二代測(cè)序，由北京邁基諾基因科技股份有限公司完成；6 例（21%）患兒采用PHEX基因靶向檢測(cè)。4例基因檢測(cè)陰性者有3 例采用PHEX基因靶向檢測(cè)，1 例為二代測(cè)序。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

隔夜空腹至少8 h以上取血，由我院檢驗(yàn)科測(cè)定生化指標(biāo)、甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）、25-羥維生素D［25-hydroxyvitamin D，25(OH)D］、尿磷、尿肌酐。生化指標(biāo)分析包括：血磷、血鈣、血鉀、血鈉、血氯、血鎂、血肌酐、總蛋白、 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），根據(jù)Walton等［13］的列線圖計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率校正的腎臟磷最大重吸收率即腎小管最大磷吸收/腎小球?yàn)V過(guò)率（renal tubules absorbed maximum phosphorus/glomerular filtration rate，TmP/GFR）。

檢測(cè)FGF23 濃度：全血樣本采集當(dāng)日離心分離血清，所有血清樣本均存儲(chǔ)于-80℃低溫凍存，避免反復(fù)凍融。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行iFGF23 測(cè)定，試劑盒購(gòu)于Kainos 公司，該試劑盒iFGF23 測(cè)定范圍為3～800 ng/L。測(cè)定步驟：準(zhǔn)備試劑及標(biāo)準(zhǔn)品，所有待測(cè)患兒血清提前一晚置于4℃冰箱解凍；取50 μL緩沖液加入每個(gè)微孔中；取50 μL FGF23標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或待測(cè)血清分別加入相應(yīng)微孔，覆鋁膜以避光，置于搖床上室溫孵育2 h；移去覆膜，洗板4 次，每次每孔加入300 μL洗液，最后完全移除洗液；每微孔中加入100 μL HRP標(biāo)記的FGF23抗體，覆膜，室溫?fù)u床孵育1 h；移去覆膜，洗板4 次，最后完全移除洗液；取100 μL 底物加入每孔，覆膜，置于鋁箔避光室溫孵育30 min；移除鋁箔和覆膜，每孔立即加入100 μL 反應(yīng)終止液，覆膜輕搖1 min；用酶標(biāo)儀在10 min 內(nèi)讀取450 nm（第二波長(zhǎng)取600 nm）的吸光度，計(jì)算各孔iFGF23 濃度。結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和光密度值繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及直線回歸方程得出。

1.4 資料收集

收集兩組兒童的資料，包括：（1）年齡、性別、身高（長(zhǎng)）；（2）血清FGF23、電解質(zhì)（鉀、鈉、氯、鈣、磷、鎂）、ALP、25(OH)D、血肌酐、血總蛋白、尿肌酐、尿磷等結(jié)果，其中血肌酐、尿肌酐、尿磷用于計(jì)算TmP/GFR。兒童不同年齡段血磷及ALP 正常范圍參照2021 年我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)頒布的兒童臨床常用生化檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間［14］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。作圖采用GraphPad Prism 9.0.1軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。偏態(tài)分布或等級(jí)變量的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。采用受試者操作特征曲線分析FGF23 對(duì)兒童低血磷性佝僂病的診斷價(jià)值。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童臨床資料比較

佝僂病組共28 例，18 例（64%）系家族遺傳性病例，其中16 例來(lái)自母親，2 例來(lái)自父親；10例（36%）系散發(fā)病例。24例PHEX基因突變患兒中，共檢出18 個(gè)不同的基因突變分布（圖1），其中截短突變14 例（58%），非截短突變10 例（42%）。佝僂病組與健康對(duì)照組的性別、年齡、血鉀、血鈉、血氯比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。佝僂病組血清FGF23、ALP 水平高于健康對(duì)照組（P＜0.01），血磷、血鈣、血鎂、血總蛋白低于健康對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組兒童臨床資料比較

圖1 PHEX基因外顯子結(jié)構(gòu) 圖中方框?yàn)橥怙@子結(jié)構(gòu)，箭頭所指為本研究中確定的18個(gè)突變位點(diǎn)堿基位置。

2.2 佝僂病組患兒血清 FGF23與臨床指標(biāo)的關(guān)系

Spearman 秩相關(guān)分析顯示，低血磷性佝僂病患兒血清FGF23 濃度與TmP/GFR 呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.64，P＜0.01），與ALP、25(OH)D 呈正相關(guān)（分別rs=0.38、0.39，均P=0.04），見(jiàn)圖2。年齡（rs=-0.04，P=0.84）、身高Z 評(píng)分（rs=-0.25，P=0.20）、性別（rs=-0.12，P=0.23）、PTH（rs=-0.04，P=0.87）與血清FGF23濃度無(wú)顯著相關(guān)性。

圖2 低血磷性佝僂病患兒血清FGF23與ALP、25(OH)D、TmP/GFR的相關(guān)性分析圖

2.3 繪制血清FGF23對(duì)診斷低血磷性佝僂病的受試者操作特征曲線

受試者操作特征曲線分析結(jié)果顯示，F(xiàn)GF23診斷低血磷性佝僂病的曲線下面積為0.874（95%CI：0.782～0.965），約登指數(shù)為0.746，靈敏度為0.821，特異度為0.925，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.885，陰性預(yù)測(cè)值為 0.881， 最佳截?cái)嘀禐?55.77 pg/mL （P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 FGF23診斷低血磷性佝僂病的受試者操作特征曲線

3 討論

本研究利用日本Kainos 公司試劑盒對(duì)兩組兒童進(jìn)行iFGF23 水平檢測(cè)，結(jié)果顯示，佝僂病組血清FGF23濃度高于健康對(duì)照組，與Endo等［15］研究結(jié)果一致。一項(xiàng)納入227 例兒童的橫斷面研究中，血清FGF23 濃度為（44±37）pg/mL，但該研究中半數(shù)兒童為腎功能異常者，不能代表正常兒童的水平［16］。Jonsson 等［17］報(bào)道26 例兒童［（10.9±5.5）歲］FGF23 濃度為（69±36）mL/RU。本研究中健康對(duì)照組兒童血清FGF23 濃度為33.52（24.78，42.63）pg/mL，與Smith 等［10］測(cè)量健康人群FGF23 濃度為11.7～48.6 pg/mL 大致相似（年齡25～62 歲，晨起空腹8:00—10:00）。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示XLH患兒FGF23濃度并無(wú)性別差異，與Ichikawa 等［18］的關(guān)于小鼠體外FGF23 與性別劑量效應(yīng)的研究結(jié)果一致，具體機(jī)制尚不清楚，可能與X染色體隨機(jī)失活、等位基因表達(dá)差異有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組和佝僂病組FGF23、血鎂、總蛋白、血磷、血鈣水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低血磷性佝僂病患兒由于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，除鈣磷代謝異常外可能伴有其他電解質(zhì)紊亂。Hamano［19］在低鎂與骨密度的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，低鎂可能是導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良患兒骨密度改變的重要因素，所以對(duì)于蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良的低血磷性佝僂病患兒，尤其是合并低鎂血癥者，早期加鎂治療可能對(duì)改善骨骼礦化具有重要意義。

診斷方面，本研究顯示FGF23 診斷低血磷性佝僂病的曲線下面積為0.874，最佳截?cái)嘀禐?5.77 pg/mL，與FGF23 預(yù)測(cè)腫瘤性骨軟化癥的靈敏度（86%）［20］相似，提示FGF23作為診斷低血磷性佝僂病生物標(biāo)志物的效能較高。Ito 等［21］分析FGF23 診斷FGF23 相關(guān)/不相關(guān)低血磷性佝僂病的靈敏度和特異度分別為100%和81.8%，這有力地支持了FGF23 具有作為新的臨床診斷標(biāo)志物的潛能。但目前不同F(xiàn)GF23 試劑盒的診斷截?cái)嘀瞪胁煌耆_定，未來(lái)有必要繼續(xù)積累更多的FGF23 臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)，以確定中國(guó)兒童的正常參考范圍。

本研究發(fā)現(xiàn)血清FGF23 濃度與ALP 呈正相關(guān)，低血磷性佝僂病患兒由于生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞終末分化和礦化所需磷酸鹽供應(yīng)不足，成骨細(xì)胞活躍，故ALP 增高明顯。TmP/GFR 是穩(wěn)定狀態(tài)下測(cè)量腎臟重吸收磷的最佳方法，可有效代表腎磷閾，低血磷性佝僂病患兒TmP/GFR 顯著降低。本研究中血清FGF23 濃度與TmP/GFR 呈負(fù)相關(guān)， 與Yamamoto等［22］的研究結(jié)果一致。由于布羅索尤單抗通過(guò)直接結(jié)合FGF23 抑制其生物活性，提高腎臟重吸收磷，改善TmP/GFR 以維持血磷在正常范圍內(nèi)，故FGF23 或許可成為監(jiān)測(cè)布羅索尤單抗療效的有效指標(biāo)。既往認(rèn)為，F(xiàn)GF23濃度過(guò)高可引起1,25-二羥維生素D3生成不足［23］，從而減少鈣磷吸收，但本研究顯示二者呈正相關(guān)，原因可能與本研究中患兒非初診，曾長(zhǎng)期服用大劑量骨化三醇有關(guān)，而活性維生素D的半衰期長(zhǎng)達(dá)2～3周，停藥2周后患兒體內(nèi)可能仍殘留部分外源性活性維生素D。本研究表明FGF23 濃度與年齡、身高Z 評(píng)分無(wú)顯著相關(guān)性。一項(xiàng)包含29例（成人14例，兒童15例）的回顧性研究中，F(xiàn)GF23濃度與身高標(biāo)準(zhǔn)差分?jǐn)?shù)、發(fā)病年齡均無(wú)相關(guān)性［24］，可能與患兒身高受遺傳、治療時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)狀況等多因素影響相關(guān)。

總之，F(xiàn)GF23是腸、腎、骨之間聯(lián)系、調(diào)節(jié)的紐帶，其血清濃度不僅與多種輔助診斷的生化標(biāo)志物相關(guān)，是低血磷性佝僂病的潛在診斷靶標(biāo)，同時(shí)也有可能成為評(píng)估布羅索尤單抗療效的指標(biāo)。

本研究尚存在以下局限性：（1）XLH 為罕見(jiàn)病，本研究樣本量小且為單中心研究，仍需進(jìn)一步的前瞻性研究證實(shí)血清FGF23 濃度對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值；（2）未能評(píng)估FGF23 濃度對(duì)低血磷性佝僂病不同年齡段、不同類型低血磷性佝僂病的診斷價(jià)值，以及不同檢測(cè)方法的差異；（3）影響FGF23 因素較多，未來(lái)可行多重線性回歸分析，減小其他混雜因素帶來(lái)的偏倚。鑒于這些局限性，我們的結(jié)果需要在更大的樣本和更廣泛的年齡范圍中進(jìn)行前瞻性、多中心研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。