袁長深，李彥宏，劉晉邑，廖書寧，梅其杰，徐文飛，段 戡

（1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院四肢骨傷科，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學研究生院，廣西 南寧 530000）

S 期激酶相關(guān)蛋白2（S-phase kinase associated protein，Skp2）是一種癌癥相關(guān)蛋白，主要位于細胞核和細胞質(zhì)中，可在骨髓等組織中廣泛表達（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6502#geneexpression）。Skp2 作為細胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可促進細胞從G1期向S 期的轉(zhuǎn)換，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1，2］；甚至認為靶向Skp2 通路是癌癥治療的關(guān)鍵靶點［1］。然而，Skp2 在非腫瘤中，特別在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）中的作用機制仍不明確。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）可導致靶基因序列中同源雙鏈RNA 引起一種特異性轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象［3］；RNAi 具有序列特異性、高效性、藥物毒性小等特點，可參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡，影響非腫瘤與腫瘤的發(fā)?。?］。RNAi 已成為基因功能研究，甚至癌癥基因治療的重要手段。目前小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)已被用于食管癌［5］、胰腺癌［6］、喉癌［7］、肺癌［8］等研究，但在OA 中的報道鮮為少見。

因此，本研究通過設(shè)計合成針對siRNA 轉(zhuǎn)染人軟骨細胞，觀察Skp2 在人軟骨細胞中蛋白表達情況及基因沉默后對人軟骨細胞作用，為OA 進一步基因靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人軟骨細胞完全培養(yǎng)基（CM-H107，普諾賽）；IL-1β（CG93，novoprotein）；FBS（10099-141，Gibco）；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent（L3000015，Invitrogen）；OPTI-MEM 培養(yǎng)基（31985-062，Gibco）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（T1300，Solarbio）；1×PBS（0.01 mol/L，pH7.4）（KGB5001，凱基生物）；CCK-8 法細胞增殖檢測試劑盒（KGA317，凱基生物）；內(nèi)參：β-actin；Skp2 siRNA-318，Skp2 siRNA-504，Skp2 siRNA-59（洪博元分子實驗室提供）；Trizon Reagent（CW0580S，CWBIO）；超純RNA 提取試劑盒（CW0581M，CWBIO）；HiScriptⅡ QRT SuperMix for qPCR（+gDNAwiper）（R223-01，Vazyme）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711 - 02，Vazyme）；50×TAE 緩沖液（T1060，Solarbio）；6×DNA Loading Buffer（GH101-01，TRANS）；50 bp DNA Ladder（MD108，TIANGEN）；Gsafe Red plus 核酸染料（GK20002，GLPBIO）；瓊脂糖粉（75510-019，Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA 設(shè)計及載體構(gòu)建 根據(jù)基因庫Genebank 中提供人類Skp2（NM_001243120，Gene ID：6502）序列，通過https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站在線siRNA 設(shè)計工具設(shè)計三條siRNA。設(shè)計基因靶點是在NS 基因的第59、318、504 位點，靶點序列 分 別 是 ：Skp2 （human ）siRNA - 59 ：CAAAAAACUCAAAUUUAGUTTACUAAAU -UUGAGUUUUUUGTT ；Skp2 （human ）siRNA-318：CCAUCUAGACUUAAGUGAUTTAUCACUUAAGUCUAGAUGGTT；Skp2 （human）siRNA - 504：CCUUCAACUGUUAAAGGAATTUUCCUUUAACAGUUGAAGGTT；并設(shè)置陰性對照siRNA：UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT 和空載組。與任何基因序列均無同源性，以上序列均由江西中洪博元生物技術(shù)有限公司合成。模板鏈兩端分別設(shè)計SacⅠ和XhoⅠ酶切位點，載體構(gòu)建名稱：YCSWT-Skp2-Pmi-rGLO，將結(jié)合位點進行突變，將突變目的基因片段進行生物合成，與pmirGLO 載體相連，載體構(gòu)建名稱為YCS-UMT-Skp2-pmirGLO。使用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切突變YCS-UMT-Skp2-pmirGLO 質(zhì)粒，在pmirGLO 載體上連接目的片段。將2 個多聚核苷酸片段置于37 °C 條件下酶切30 min 后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳分離得到條帶。紫外燈下切下線性化的條帶，應用瓊脂糖DNA 回收試劑盒，回收線性化的載體并發(fā)生連接反應的體系如下：目的質(zhì)粒（50 ng）1 μL，pmirGLO-F 0.5 μL，pmirGLO-R 0.5 μL，2× ES Taq Master Mix（Dye）12.5 μL，去離子水10.5 μL。連接產(chǎn)物分別命名為：siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504 和NC（陰性對照質(zhì)粒）。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 本實驗分為5 組：空載組、NC 組、Skp2 siRNA-59 組、Skp2 siRNA-318 組、Skp2 siRNA-504 組。首先，在6 孔板上植入細胞，每個孔約2×105～10×105個細胞，6 cm 皿每孔約5×105～2×106個細胞。當細胞密度達到70%時，準備轉(zhuǎn)染；用容量為1 mL 的無血清培養(yǎng)基取代細胞培養(yǎng)基；其次，取2 支滅菌EP 管，每支加入125 μL Opti-MEM，其中1 支加入5 μL lipofectamine 3000，另1 支加入12.5 μL siRNA 或者miRNA（siRNA 或者miRNA 干粉使用DEPC 水溶解；125 μL/1OD），混勻后室溫孵育5 min；最后，將以上2 支EP 試管混勻，在室溫孵育15 min 后，把混合溶液滴入6 孔板相應小孔中，將細胞移回室溫孵育。當轉(zhuǎn)染4～6 h 后，將1 mL 含20%血清完全培養(yǎng)基加到6 孔板中，在48 h 后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-PCR 檢測Skp2mRNA 表達水平 對人軟骨細胞總RNA 進行RT-PCR 檢測，根據(jù)TRIzol操作說明書進行總RNA 提取，用紫外分光光度儀從38 μL 體系的總RNA 溶液中抽取1.3 μL，在OD260和OD280下測定數(shù)據(jù)并記錄。RNA 濃度和純度分別由OD260×40=RNAng/μL 公式、1.8≤OD260/OD280≤2.2 公式計算。提取總RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳，進行RNA 跑膠，電壓200 V，電流180 mA 左右，時間13 min 左右，取出凝膠，化學發(fā)光成像系統(tǒng)儀在顯影后進行圖像采集。根據(jù)HiScript Ⅱ QRT SuperMix for qPCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法獲得到單鏈cDNA。PCR 反應體系：2×miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，引物各0.4 μL，去DEPC 水8.2 μL 總體積20 μL。PCR 條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s；58 ℃（β-actinF、β-actinR 為58 ℃，Skp2F、Skp2R 為60.5 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，超高靈敏度的化學發(fā)光成像系統(tǒng)儀所獲取的影像，以β-actin為內(nèi)參，引物名稱及序列見表1。

表1 引物名稱及序列Tab 1 Names and sequences of primers

1.2.4 細胞增殖抑制率檢測 先將細胞貼壁后加藥24 h，將待測96 孔板細胞用相同的培養(yǎng)基，每孔100 μL；并在每個孔中添加10 μLCCK8 試劑，然后放入培養(yǎng)箱孵化2 h，酶標儀檢測450 nm 波長下各孔吸光值（IOD 值）。當細胞貼壁后加藥24 h，再把待測96 孔板細胞用相同培養(yǎng)基，100 μL/孔培養(yǎng)基替換；Skp2mRNA 表達抑制率（%）計算方法為：1-siRNA 組Skp2mRNA/NC 組Skp2mRNA×100%。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析，組間用t檢驗和普通單因素方差分析比較均數(shù)，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重建質(zhì)粒的酶切鑒定及測序鑒定

YCS-WT-Skp2-pmirGLO、YCS-MUT-Skp2-pmirGLO 載體通過PCR 擴增后的條帶為578 bp，見圖1，電泳檢測結(jié)果和理論值吻合相似，測序結(jié)果和設(shè)計的DNA 片段序列完全一致，證實均為正確質(zhì)粒，得到的重組干擾質(zhì)粒的目的片段完全相符預期。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物條帶大小Fig 1 Agarose gel electrophoresis detection of PCR products stripe size

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對Skp2 mRNA 表達的影響

重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染后，siRNA-59、siRNA-318 和siRNA-504 轉(zhuǎn)染組Skp2mRNA 表達明顯低于NC組，具有顯著性差異（P＜0.05），且以siRNA-504Skp2mRNA 表達最低；而空載組和NC 組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），siRNA 干擾后實驗各組Skp2 mRNA 表達量，見表2；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對Skp2mRNA 表達的影響見圖2。同時，進一步采用DNA 電泳對其結(jié)果進行驗證，其結(jié)果與各組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Skp2mRNA 結(jié)果一致?？蛰d組、NC 組、siRNA-59 組、siRNA-318 組和siRNA-504 組表達量從左至右，分組順序與濃度測定一致，β-actin、Skp2條帶亮度正常且位置正確，為目的產(chǎn)物，見圖3。

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對Skp2 mRNA 表達的影響Fig 2 Effect of recombinant plasmid transfection on Skp2 mRNA expression

圖3 DNA 電泳結(jié)果Fig 3 DNA electrophoresis results

表2 siRNA 干擾后實驗各組Skp2 mRNA 表達量（n=3）Tab 2 Skp2 mRNA expression quantity after siRNA interference in all experimental groups（n=3）

2.3 細胞增殖抑制率檢測

細胞增殖抑制率檢測：采用1-siRNA 組Skp2mRNA/NC 組Skp2mRNA×100%，計算出siRNA-59 組、siRNA-318 組、siRNA-504 組的細胞增殖抑制率，結(jié)果分別為：60%、41%、64%，其中以siRNA-504 組的細胞增殖抑制率最為顯著。

3 討論

1998 年，F(xiàn)ire 等［9］首次發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）是秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)錄后基因沉默的致病因子，并將這種現(xiàn)象稱為RNAi。RNAi 作為進化過程中高度保守的雙鏈RNA 分子之一，可調(diào)節(jié)幾乎人類所有細胞中mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯［3］。在RNAi 中，有個重要的核酸內(nèi)切酶Dicer，它可與雙鏈RNA 分子結(jié)合，并從dsRNA 鈍頭或3 端有小懸突的dsRNA 上進行切割，將其剪切成2l-23nt 長及3'端突出的片段，即siRNA［10］。siRNA 對核苷酸序列具有高度特異性，可有效地對特定基因進行RNAi 沉默［3］，這是因為siRNA 在細胞內(nèi)被依附于RNA 的RNA 聚合酶1、2、6 進一步擴增，并以單鏈的形式與AGO1 蛋白結(jié)合，從而形成由RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），引導部分或完全互補的mRNA 與其相互作用，導致特異的mRNA 被降解，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［11］。PTGS 存在于自然生物細胞中，是細胞抵抗外來核酸入侵，并維持自身基因組完整性的一種防御手段［12］；PTGS 能將特異性同源雙鏈RNA 導入細胞內(nèi)，使靶點基因不表達或者表達水平下降。因此，RNAi 也作為一種簡單有效的代替基因敲除的方法［11］。隨著RNAi 技術(shù)的不斷發(fā)展，由于其具有高穩(wěn)定性、高特異性及高效性等特點，已在基因功能及腫瘤治療方面被廣泛運用［13］，但在OA 領(lǐng)域則較為少見。所以，RNAi 的發(fā)現(xiàn)和應用為生物醫(yī)學研究提供一個獨特且適應性強的工具，成為發(fā)展生命科學和藥物研發(fā)的重要方向［14］。RNAi 也有望成為治療OA 的一種有效方法，為防治OA 開辟新的途徑。

Skp2作為Skp1-Cullin-F-box（SCF 復合體）E3連接酶中的一種F-box 蛋白，可通過泛素介導G1 檢查點CDK 抑制劑-p21 和p27、p57 和叉頭轉(zhuǎn)錄因子1降解來靶向細胞周期進程。由于Skp2具有調(diào)控細胞周期的作用［4］，所以其表達水平影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預后等［2，15-17］。目前Skp2在腫瘤領(lǐng)域研究較多，但在OA 的研究甚少。Wang 等［18］通過對GSE48556、GSE46750、GSE32317 數(shù)據(jù)集綜合薈萃分析發(fā)現(xiàn)，Skp2存在于OA 中；且認為高糖狀態(tài)下Skp2過表達可促進軟骨細胞增殖［19］。同時，研究發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)豐富的條件下，Skp2的SCFE3 泛素連接酶可維持細胞核中精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶共激活因子1（CARM1）穩(wěn)定性［20］；而在饑餓狀態(tài)下，Skp2則會激活細胞核中的AMP 依賴蛋白激酶（AMPK），激活的AMPK使叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3 磷酸化，導致Skp2下調(diào)并增加細胞核中CARM1 蛋白水平；穩(wěn)定的CARM1 作為轉(zhuǎn)錄因子EB 必要激活因子，進而調(diào)控細胞自噬和溶酶體基因的表達。由于Skp2在AMPK-Skp2 -CARM1 信號軸中發(fā)揮關(guān)鍵介質(zhì)作用［21］，所以Skp2被認為是自噬相關(guān)疾病潛在治療靶點［19］。生信預測發(fā)現(xiàn)Skp2是OA 的關(guān)鍵基因［18］，而自噬能夠清除受損和功能失調(diào)的細胞器和大分子，保持OA 軟骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［22］，因而推斷Skp2可能在OA 自噬中發(fā)揮重要作用。因此，觀察Skp2在人軟骨細胞中的表達情況，為研究Skp2在OA 中的靶向治療提供依據(jù)。

本實驗通過使用在線siRNA 設(shè)計工具，利用Skp2 序列作為靶位點，設(shè)計三條序列，采用基因重組技術(shù)，成功體外構(gòu)建Skp2siRNA 表達載體，然后轉(zhuǎn)染到人軟骨細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504 轉(zhuǎn)染組Skp2mRNA 表達明顯低于NC 組，具有顯著性差異（P＜0.05）；進一步采用DNA 電泳對其結(jié)果進行驗證，其結(jié)果與各組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Skp2mRNA 結(jié)果一致。進而觀察對Skp2mRNA 表達抑制率，實驗顯示Skp2mRNA 在siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504 中的抑制率分別為60%、41%、64%，其中以siRNA-504 轉(zhuǎn)染組抑制率最高。針對Skp2的siRNA，能有效降低Skp2mRNA 表達，產(chǎn)生基因沉默效應，提示Skp2可能成為OA 治療的一個靶基因，而Skp2第504 位點可能是研究其重要靶點。

本研究通過構(gòu)建載體，成功介導siRNA 對人軟骨細胞Skp2表達的抑制作用，表明在OA 基因治療領(lǐng)域中具有可行性。隨著siRNA 技術(shù)的日臻完善，該技術(shù)可能成為OA 基因治療的重要組成部分。

作者貢獻度說明：

袁長深：文章撰寫，文章后期審校；李彥宏、劉晉邑、廖書寧、徐文飛：文章內(nèi)容修改；段戡：文章設(shè)計。梅其杰：文章評估。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。