魏柯健，俞靜靜，蘇 潔，徐 潔，胡雪靈，周衡樸，何梓雯，顏美秋，陳素紅，呂圭源*

復方野菊花提取物對肝火亢盛型高血壓模型大鼠的作用研究

魏柯健1，俞靜靜1，蘇 潔1，徐 潔1，胡雪靈1，周衡樸1，何梓雯1，顏美秋1，陳素紅2*，呂圭源1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 310053 2. 浙江工業(yè)大學，浙江 杭州 310014

探討復方野菊花提取物對肝火亢盛型高血壓大鼠模型的影響及降壓作用機制。自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）ig復方附子湯建立肝火亢盛型高血壓大鼠模型，給予復方野菊花提取物干預后，檢測大鼠中醫(yī)證候指標、心率和血壓，測定血清與腎臟中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone dystem，RAAS）相關(guān)因子的含量，檢測血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）及血脂水平，觀察靶器官組織形態(tài)學變化。復方野菊花提取物能顯著降低模型大鼠眩暈恢復時間、面溫、耳溫、尿液吸光度（＜0.01），增加唾液分泌量及糞便含水量（＜0.01），緩解模型大鼠尖叫、攻擊、打斗、撕咬等攻擊性行為；顯著降低模型大鼠心率、收縮壓、舒張壓和平均動脈壓（＜0.05、0.01）；顯著降低血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）和ET-1水平（＜0.01），升高NO水平（＜0.01）；改善心臟、腎臟及胸主動脈組織結(jié)構(gòu)異常；降低血清中醛固酮（aldosterone，ALD）、腎素、血管緊張素-II（angiotensin-II，Ang-II）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）水平（＜0.05、0.01），降低腎臟腎素、Ang-II、ACE和胸主動脈Ang-II的蛋白表達（＜0.05、0.01），增加腎臟ACE2蛋白表達（＜0.01）。復方野菊花提取物能夠緩解高血壓模型大鼠肝火亢盛證，改善模型大鼠的內(nèi)皮狀態(tài)，其降壓機制可能與抑制RAAS過度激活有關(guān)。

野菊花；高血壓；肝火亢盛證；腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)；京尼平苷酸；金絲桃苷；蒙花苷

高血壓屬于我國傳統(tǒng)醫(yī)學“眩暈”“頭痛”的范疇，可分為肝火亢盛、痰濕壅盛、陰虛陽亢、陰陽兩虛等證型[1]，其中，肝火亢盛型在高血壓人群中占多數(shù)，且呈年輕化的趨勢[2-3]。其原因與現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的加快，人們精神壓力變大，飲食娛樂生活豐富，或任意嗜辣，或通宵達旦，致使肝陰受損而加重肝火亢盛證有關(guān)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，肝火亢盛型高血壓病理機制多樣，以腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）激活、交感神經(jīng)亢奮及內(nèi)皮功能異常為主[6-8]。其中，RAAS是平衡血壓的重要途徑，腎內(nèi)RAAS的不適當激活是高血壓的重要發(fā)病機制，其作用由醛固酮（aldosterone，ALD）、腎素、血管緊張素II（angiotensin-II，Ang-II）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）等多個受體共同負責[9]。內(nèi)皮被認為是調(diào)節(jié)血管張力的重要組織，在多個心血管疾病尤其是高血壓的發(fā)病機制中起著重要作用，同時內(nèi)皮功能異常可能導致RAAS的過度激活[10]。

參照《中藥新藥臨床研究指導原則》（2002年版）中《中藥新藥治療高血壓病的臨床研究指導原則》診斷標準，肝火亢盛證主證為眩暈、頭痛及急躁易怒，次癥包括便秘、面紅目赤、口苦口干、溲赤、舌紅黃、脈弦數(shù)，中醫(yī)多以清肝、平肝、泄火為高血壓肝火亢盛證的主要治療原則。本課題組根據(jù)高血壓肝火亢盛證的病證特點，結(jié)合臨床高血壓“平肝潛陽、清熱瀉火、滋補肝腎”之治則，在現(xiàn)有中成藥強力定眩片的處方基礎(chǔ)上加減，輔以具“清瀉肝火、平肝熄風”之功的羅布麻葉，與野菊花、杜仲共同配伍制成復方野菊花提取物，或可在改善眩暈、頭痛之證的同時，起到緩解肝火亢盛證的作用。在對復方野菊花提取物的前期研究中發(fā)現(xiàn)[11]，復方野菊花提取物具有降低血壓的作用，其降壓機制與抑制RAAS的過度激活有關(guān)，但尚未明確其對高血壓中醫(yī)證候的影響。因此，本研究對復方野菊花提取物進行成分分析，并采用課題組前期通過ig溫燥藥方法建立肝火亢盛型高血壓大鼠模型[12]，以眩暈恢復時間量化“眩暈”，性情分級量化“急躁易怒”，面部溫度量化“面紅”，唾液分泌量量化“口干”，糞便含水量量化“便秘”，尿液吸光度量化“溲赤”，結(jié)合其他藥效指標綜合評價復方野菊花提取物對肝火亢盛型高血壓模型大鼠中醫(yī)證候的改善作用，并基于前期藥效研究探討其降壓機制，為復方野菊花提取物臨床功能主治的確定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級WKY雄性大鼠10只，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g；SPF級雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）50只，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g；均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2021-0006，動物質(zhì)量合格證號110011210112172413、110011210112172584。動物實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（批準號ZSLL-2017-185）。

1.2 藥品與試劑

復方附子湯由附子、干姜、肉桂組成，附子（批號201201）、干姜（批號210301）、肉桂（批號201901）均購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，取上述藥材（1∶1∶1），浸泡0.5 h，分別加12、10倍量水煎煮2次，每次1 h，濾過后混合濃縮為含生藥1 g/mL的藥液；復方野菊花提取物（批號202710）由浙江中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥與健康產(chǎn)品研究所提供，由野菊花、杜仲、羅布麻葉提取制得，以純水配制成質(zhì)量濃度為含生藥量0.525、0.350、0.175 g/mL的藥液；卡托普利片（批號20110511）購自常州制藥廠有限公司，以純水配制成1.0 mg/mL的混懸液備用；對照品京尼平苷酸（批號111828-201805）、蒙花苷（批號111528-201911）、金絲桃苷（批號111521-201809）均購自中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)分別為98.1%、94.9%、98.5%；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號210901201）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）試劑盒（批號220623202）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號201015101）均購自美康生物科技股份有限公司；ALD、腎素、Ang-II、ACE試劑盒（批號分別為20220110-RXJ302392R、20220110-RX302359R、20220113-RX301962R、20211203-RX300267R）均購自泉州市睿信生物科技有限公司；內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）試劑盒（批號23011760）購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號20220119）購自南京建成生物工程研究所；Ang-II抗體（批號ab155106）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；腎素抗體（批號bs-6184R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ACE、ACE2抗體（批號分別為24743-1-AP、21115-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源β-actin抗體（批號B9901）購自美國Immuno Way公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號HP0119）購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

1200型高效液相色譜儀、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；BP-2010AUL型小動物無創(chuàng)測壓系統(tǒng)（北京軟隆生物科技有限公司）；TBA-40FR型全自動生化分析儀（日本東芝三廣醫(yī)療株式會社）；Power wave340型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；YHW-2型紅外測溫儀（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；ZH-SZ型平衡旋轉(zhuǎn)儀（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；FLIR ONE Pro紅外熱像儀（美國FLIR公司）；Tissue-Tek VIPTM 5Jr型全封閉組織脫水機（日本櫻花檢驗儀器株式會社）；EC360型包埋機（美康儀器設(shè)備制造高淳縣有限公司）；RM2245型半自動切片機（德國Leica公司）。

2 方法

2.1 復方野菊花提取物含量測定

2.1.1 色譜條件 Eclipse XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，7% A；5～15 min，7%～8% A；15～25 min，8%～13% A；25～30 min，13%～17% A；30～45 min，17%～19% A；45～50 min，19%～26% A；50～60 min，26%～27% A；體積流量1.0 mL/min；檢測波長403 nm（0～5 min），240 nm（5～26 min），403 nm（26～37 min），256 nm（37～43 min），330 nm（43～60 min）；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備：精密稱取對照品京尼平苷酸、金絲桃苷、蒙花苷各適量，置量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，密塞，搖勻，得分別含京尼平苷酸、金絲桃苷、蒙花苷0.124 8、0.148 0、0.173 2 mg/mL的混合對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備：取復方野菊花提取物樣品約0.5 g，精密稱取，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 線性關(guān)系的考察及測定 精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液；分別精密吸取上述混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，按“2.1.1”項色譜條件測定峰面積，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制回歸方程。取供試品續(xù)濾液，進樣，測定峰面積，計算樣品中京尼平苷酸、金絲桃苷、蒙花苷的含量。

2.2 分組、造模與給藥

雄性SHR大鼠ig溫燥藥（0.2 g/mL復方附子湯）造模，連續(xù)造模5周后，通過血壓監(jiān)測及肝火亢盛證相關(guān)指標評估，選取造模成功，即血壓穩(wěn)定在收縮壓≥220 mm Hg（1 mm Hg＝133 Pa）且出現(xiàn)肝火亢盛證的大鼠。按血壓值隨機分為模型組、卡托普利（10 mg/kg）組和復方野菊花提取物高、中、低劑量（5.25、3.50、1.75 g/kg）組，每組10只；繼續(xù)ig溫燥藥造模。另取WKY大鼠10只作為對照組。各給藥組ig相應藥物（0.01 mL/g），對照組和模型組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。

2.3 中醫(yī)證候指標檢測

2.3.1 性情變化 將大鼠性情變化分為I～IV級，分別為：I級，無明顯表現(xiàn)；II級，有輕微抽搐；III級，發(fā)出叫聲且用力抖動；IV級，用力掙脫且表現(xiàn)攻擊趨向。于給藥前、給藥28 d后，觀察大鼠性情并進行評級。

2.3.2 眩暈恢復時間 于給藥前、給藥28 d后，將大鼠置于平衡旋轉(zhuǎn)儀上，1000 r/min旋轉(zhuǎn)1 min后取下，然后將其放置于平臺上，記錄大鼠恢復正常狀態(tài)所需時間。

2.3.3 面溫 于給藥前、給藥28 d后，安靜環(huán)境下，用非接觸式紅外測溫儀對準大鼠面部，當測溫儀穩(wěn)定后記錄所測數(shù)據(jù)，測定3次，取平均值。

2.3.4 唾液分泌量 于給藥前、給藥28 d后，將干燥棉簽置于干燥小型密封袋中稱定得到干質(zhì)量，再以干燥棉簽收集大鼠口腔中的唾液，將棉簽再放入密封袋中，避免唾液蒸發(fā)，稱定得到濕質(zhì)量，計算唾液分泌量。

唾液分泌量＝濕質(zhì)量－干質(zhì)量

2.3.5 糞便含水率 于給藥前、給藥28 d后，收集大鼠糞便，立即稱定記為糞便濕質(zhì)量，于70 ℃烘箱烘5 h，再次稱定記為糞便干質(zhì)量，計算糞便含水率。

糞便含水率＝(糞便濕質(zhì)量－糞便干質(zhì)量)/糞便濕質(zhì)量

2.3.6 尿液吸光度（） 于給藥前、給藥28 d后，采用代謝籠收集大鼠新鮮尿液200 μL，在430 nm下測定值。

2.3.7 耳溫 給藥28 d后，在安靜環(huán)境下，用FLIR ONE Pro紅外熱像儀對大鼠耳部進行紅外拍攝，測得大鼠耳部溫度。

2.4 血壓、心率監(jiān)測

于給藥前以及給藥1、3、7、14、21、28 d后，采用小動物無創(chuàng)測壓系統(tǒng)，在大鼠清醒且安靜環(huán)境下平行測定大鼠收縮壓、舒張壓和平均動脈壓，于給藥前、給藥28 d后測定大鼠心率。

2.5 血脂水平檢測

末次給藥后，各組大鼠腹主動脈采血，4 ℃凝血2 h，3500 r/min離心15 min，取上層血清，采用全自動生化分析儀檢測TG、TC、LDL-C水平。

2.6 血清NO和ET-1水平檢測

取大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中ET-1和NO含量。

2.7 血清ALD、ACE、Ang-II和腎素水平檢測

取大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中ALD、腎素、Ang-II和ACE的含量。

2.8 心臟、腎臟和胸主動脈組織病理學觀察

末次給藥后，ip 0.2 g/mL烏拉坦麻醉大鼠（5 mL/kg）。用鑷子夾其腳趾無反應后，將大鼠仰臥在手術(shù)臺上，沿腹中線解剖取大鼠心臟、腎臟和胸主動脈，放入盛有10%中性福爾馬林緩沖液的瓶中。經(jīng)固定、取材、脫水、包埋、切片，制得4 μm石蠟切片，采用蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色，中性樹脂封片，干燥后于顯微鏡下觀察心臟、腎臟及胸主動脈組織病理變化。

2.9 免疫組化法檢測腎臟中ACE、ACE2和胸主動脈Ang-II的蛋白表達

取腎臟和胸主動脈的石蠟切片（4 μm），經(jīng)過消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性、抗原修復、牛血清白蛋白封閉后，滴加ACE、ACE2、Ang-II抗體，4 ℃孵育過夜；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；經(jīng)DAB顯色、蘇木素染色、乙醇脫水及中性樹脂封片干燥后，于顯微鏡下觀察腎臟中ACE、ACE2和胸主動脈Ang-II蛋白的表達情況，并用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。

2.10 Western blotting檢測腎臟中腎素和Ang-II的蛋白表達

取腎臟組織，液氮充分研磨后，加入適量RIPA裂解液，冰上靜置10 min，離心取上清，提取組織蛋白。BCA法測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入腎素、Ang-II抗體，4 ℃孵育過夜；PBST洗膜3次，每次15 min；加入二抗，室溫孵育2 h；PBST洗膜3次，每次15 min；加入ECL化學發(fā)光液后，采用Modena凝膠成像儀檢測蛋白條帶，并用Image J軟件進行分析。

2.11 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 復方野菊花提取物含量測定

分別取混合對照品溶液和供試品溶液，分別按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖1）。復方野菊花提取物平行檢測3次，測定成分的色譜峰分離度（）均≥1.5，測得京尼平苷酸、金絲桃苷、蒙花苷的質(zhì)量分數(shù)分別為（2.710±0.150）、（3.470±0.147）、（10.690±0.529）mg/g。

1-京尼平苷酸 2-金絲桃苷 3-蒙花苷

3.2 復方野菊花提取物對模型大鼠中醫(yī)證候指標的影響

3.2.1 對性情的影響 如圖2所示，與對照組比較，給藥前各組大鼠具有顯著的攻擊表現(xiàn)（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的攻擊性（＜0.05、0.01）。

3.2.2 對眩暈恢復時間的影響 如圖3所示，與對照組比較，給藥前各組大鼠的眩暈恢復時間顯著上升（＜0.05、0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的眩暈恢復時間（＜0.01）。

NC-對照組 MC-模型組 CAP-卡托普利組 FYH-復方野菊花提取物高劑量組 FYM-復方野菊花提取物中劑量組 FYL-復方野菊花提取物低劑量組 與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 復方野菊花提取物對模型大鼠中醫(yī)證候指標的影響(, n = 10)

3.2.3 對面溫的影響 與對照組比較，給藥前各組大鼠的面溫顯著上升（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的面溫（＜0.01）。

3.2.4 對唾液分泌量的影響 與對照組比較，給藥前各組大鼠的唾液分泌量顯著減少（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著增加模型大鼠的唾液分泌量（＜0.01）。

3.2.5 對糞便含水率的影響 與對照組比較，給藥前各組大鼠的糞便含水率顯著降低（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著增加模型大鼠的糞便含水率（＜0.01）。

3.2.6 對尿液值的影響 與對照組比較，給藥前各組大鼠的尿液值均顯著上升（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的尿液值（＜0.01）。

3.2.7 對耳溫的影響 與對照組比較，給藥28 d后，模型組大鼠的平均耳溫均顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的平均耳溫（＜0.01）。

3.3 復方野菊花提取物對模型大鼠心率和血壓的影響

3.3.1 對模型大鼠心率的影響 如圖4所示，與對照組比較，給藥前各組大鼠心率均明顯升高（＜0.05、0.01）；給藥28 d后，中、高劑量的復方野菊花提取物能顯著降低模型大鼠心率（＜0.01），復方野菊花提取物低劑量組心率有降低趨勢。

3.3.2 對模型大鼠血壓的影響 與對照組比較，給藥前模型組在造模后不同時間點舒張壓均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，給藥1、3、7、14、21、28 d后，各劑量的復方野菊花提取物均能穩(wěn)定顯著降低模型大鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓（＜0.05、0.01）。

3.4 復方野菊花提取物對模型大鼠血脂水平的影響

如圖5所示，給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠血清中TC、LDL-C含量（＜0.01），復方野菊花提取物高劑量組顯著降低模型大鼠血清中TG含量（＜0.01），復方野菊花提取物低、中劑量組對TG含量有降低趨勢。

圖4 復方野菊花提取物對模型大鼠心率和血壓的影響(, n = 10)

圖5 復方野菊花提取物對模型大鼠血液生化學指標的影響(, n = 10)

3.5 復方野菊花提取物對模型大鼠血清中NO及ET-1含量的影響

如圖6所示，給藥28 d后，與對照組比較，模型組大鼠血清中ET-1含量顯著升高（＜0.01），NO含量顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著降低血清中ET-1含量（＜0.05、0.01），復方野菊花提取物高劑量組能顯著升高血清中NO含量（＜0.01），復方野菊花提取物低、中劑量組對NO含量有升高趨勢。

3.6 復方野菊花提取物對模型大鼠血清RAAS相關(guān)指標的影響

如圖7所示，給藥28 d后，與對照組比較，模型組大鼠血清中腎素、Ang-II、ACE、ALD含量均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠血清中腎素、Ang-II、ACE含量（＜0.05、0.01），復方野菊花提取物低、高劑量組能顯著降低ALD含量（＜0.05），復方野菊花提取物中劑量組對ALD呈現(xiàn)降低趨勢。

圖6 復方野菊花提取物對模型大鼠血清中NO及ET-1含量影響(, n = 10)

圖7 復方野菊花提取物對模型大鼠血清中RAAS相關(guān)指標的影響(, n = 10)

3.7 復方野菊花提取物對模型大鼠靶器官組織形態(tài)的影響

3.7.1 對模型大鼠腎臟組織形態(tài)的影響 如圖8所示，與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織HE染色可見腎小球萎縮，腎小管排列紊亂及間隙增大；Masson染色可見腎小管間隙出現(xiàn)大量藍紫色膠原蛋白沉積。與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物對大鼠腎臟病變有不同程度的改善，腎小球、腎小管形態(tài)接近對照組，腎小球萎縮明顯改善，腎小管間隙無顯著膠原蛋白沉積。

3.7.2 對模型大鼠心臟組織形態(tài)的影響 如圖9所示，與對照組比較，模型組大鼠心臟組織HE染色可見心肌纖維排列不規(guī)則，同時心肌細胞核深染、肥大、間距變寬、排列紊亂；Masson染色可見心肌纖維間出現(xiàn)大量藍紫色膠原蛋白沉積。與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均能使心肌組織結(jié)構(gòu)趨于正常，橫紋較清晰，心肌細胞肥大改善，形態(tài)較規(guī)則，心肌纖維間膠原蛋白沉積面積顯著減小。

3.7.3 對模型大鼠胸主動脈組織形態(tài)的影響 如圖10所示，與對照組比較，模型組大鼠胸主動脈組織HE染色可見中膜明顯增厚，血管平滑肌細胞排列疏松、紊亂，血管內(nèi)皮細胞排列不齊且部分脫落；Masson染色可見中膜出現(xiàn)大量藍紫色的膠原蛋白沉積。與模型組比較，各劑量的復方野菊花提取物均可使胸主動脈中膜增厚、血管平滑肌細胞增生且排列紊亂等癥狀減輕，中膜膠原蛋白沉積顯著減小。

圖8 復方野菊花提取物對模型大鼠腎臟組織形態(tài)學的影響 (×200)

圖9 復方野菊花提取物對模型大鼠心臟組織形態(tài)學的影響(×200)

圖10 復方野菊花提取物對模型大鼠胸主動脈組織形態(tài)學的影響(×200)

3.8 復方野菊花提取物對模型大鼠腎臟ACE、ACE2及胸主動脈Ang-II表達的影響

3.8.1 對模型大鼠腎臟ACE和ACE2表達的影響 如圖11所示，大鼠腎臟中ACE2、ACE染色陽性產(chǎn)物表達在腎小管細胞，呈棕黃色。與對照組比較，模型組大鼠腎臟中ACE2表達明顯降低（＜0.01），ACE表達明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，復方野菊花提取物各劑量組大鼠腎臟中ACE表達均顯著降低（＜0.01），ACE2表達均明顯升高（＜0.01）。

3.8.2 對模型大鼠胸主動脈Ang-II表達的影響 如圖12所示，胸主動脈中Ang-II染色陽性產(chǎn)物表達在內(nèi)皮細胞表面，呈棕黃色。與對照組比較，模型組大鼠胸主動脈中Ang-II表達顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，復方野菊花提取物各劑量組胸主動脈Ang-II蛋白表達顯著減少（＜0.01）。

圖11 復方野菊花提取物對模型大鼠腎臟ACE和ACE2表達的影響(, n = 3)

圖12 復方野菊花提取物對模型大鼠胸主動脈Ang-II表達的影響(, n = 3)

3.9 復方野菊花提取物對模型大鼠腎臟中腎素和Ang-II蛋白表達的影響

如圖13所示，與對照組比較，模型組大鼠腎臟中腎素和Ang-II表達顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，復方野菊花提取物各劑量組腎臟中Ang-II表達明顯減少（＜0.05），復方野菊花提取物中、高劑量組腎素表達顯著減少（＜0.05），復方野菊花提取物低劑量組腎素的表達呈降低趨勢。

圖13 復方野菊花提取物對模型大鼠腎臟腎素和Ang-II蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

高血壓的病因大致有“風、火、痰、瘀、虛”等[13]，肝風、腎虛、痰濁則是其主要病理基礎(chǔ)[14]。高血壓病常伴有眩暈、頭痛等主證，但不同證候類型的高壓病其病因病機不同，其主次之證的側(cè)重點亦不相同，如若飲食不節(jié)，多食肥甘厚味，痰濕內(nèi)生，而發(fā)為痰濕壅盛型，其主證表現(xiàn)為胸悶、嘔吐痰涎并伴有失眠、耳鳴、健忘等次證；年老體衰、久病體虛，腎陰虧虛，陽亢于上，形成陰虛陽亢型，其主證表現(xiàn)為腰酸、膝軟、五心煩熱，伴有失眠、耳鳴、健忘等次證；久病陰損及陽，則出現(xiàn)陰陽兩虛，其主證表現(xiàn)為畏寒肢冷，伴有氣短、夜尿頻等次證[2]。而肝火亢盛證為實證，其病位在肝，病性為火，其主證主要表現(xiàn)為急躁易怒，并伴有面紅、目赤、口干、口苦、便秘、瘦赤等次證[15]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝火亢盛證為早期高血壓病的主要證候，而高血壓與肝的關(guān)系自古便有論述，如《素問·至真要大論》有言：“諸風掉眩，皆屬于肝”?！杜R證指南醫(yī)案》進一步指出：“所患眩暈者，非外來之邪，乃肝膽之風陽上冒耳”，而究其“火”之病性，多因情志不暢、飲食辛辣或作息不律致肝氣郁結(jié)，滯而為火，火為陽邪，燔灼于內(nèi)則耗氣傷津，致肝陰不足。肝風遇火，風火相煽，發(fā)為眩暈[16]。故而肝火內(nèi)熾、氣火上逆是為肝火亢盛型高血壓的主要病機?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》認為火氣失常是某些疾病的重要原因[17]，現(xiàn)代中醫(yī)在肝火亢盛證的臨床診療中亦發(fā)現(xiàn)“火”可致機體多方面的損傷或不適，如火性炎上，上擾清空可使神明不安，出現(xiàn)眩暈、頭痛；肝火循經(jīng)上攻于頭目，進而氣血隨之上涌，出現(xiàn)面赤、目赤等癥狀[18]，大多與肝火亢盛證的表現(xiàn)相符。本實驗采用“大熱”的溫燥藥進行造模，引火入肝，成功在自發(fā)性高血壓的基礎(chǔ)上使大鼠出現(xiàn)肝火亢盛高血壓主證眩暈、急躁易怒，次癥便秘、面紅、口干、溲赤。

復方野菊花提取物以野菊花為君，其味苦辛、涼，入肝、心經(jīng)，可清熱解毒，瀉火平肝[20]，《本草綱目》中稱有“利五脈、調(diào)四肢，治頭風熱、腦骨腫痛、養(yǎng)目血、去翳膜、主肝氣不足”之功，主治頭眩腫痛、頭目風熱等癥；配以羅布麻葉平肝安神，清熱利水[19]，與野菊花共去肝臟邪火，以平肝陽眩暈；佐以杜仲，補肝腎不足[19]，助野菊花復肝腎正氣而治頭暈目眩。諸藥合用，共達清肝熱、平肝陽、養(yǎng)肝腎、涼血散結(jié)之功，使人體趨于陰平陽秘、血脈平和，從而緩解肝火亢盛證。本研究發(fā)現(xiàn)復方野菊花提取物可有效降低模型大鼠的心率與血壓，并改善模型大鼠性情狀況，降低眩暈恢復時間、面溫、耳溫、尿液值，增加唾液分泌量、糞便含水量。證明復方野菊花提取物能夠在降壓的同時有效改善模型大鼠“眩暈”“急躁易怒”“口干”“溲赤”“耳赤”等證候指標。

現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)高血壓的病理機制是多個生物因子相互作用的結(jié)果。薛曉興等[20]認為RAAS中Ang-II可作為高血壓肝火亢盛證的標志性物質(zhì)，Ang-II是RAAS的主要效應因子，是一種由腎素和ACE共同作用而形成的強效血管收縮劑[21-22]。同時，Ang-II可通過誘導活性氧的生成，從而抑制NO的生成和活性[23]。NO為內(nèi)皮依賴性舒張血管因子，其含量與生物活性的變化能反映內(nèi)皮功能的狀態(tài)，與收縮血管因子ET-1構(gòu)成了一對具有拮抗效應的血管活性物質(zhì)[24]。而ET-1可刺激RAAS，并可介導Ang-II引起的心血管損傷[25]。此外，長期血壓過高將導致脂代謝紊亂，而肝火亢盛證高血壓病患者的TG、TC、LDL-C水平相對高于其他證型患者[26-27]。機體在LDL-C、TC水平長期升高的狀態(tài)下，將導致血管內(nèi)皮細胞損傷[28]，內(nèi)皮功能受到損害，使NO減少，造成內(nèi)皮舒縮因子（ET-1/NO）的失衡，血壓持續(xù)升高，促進高血壓的發(fā)生發(fā)展[29]。另有研究表明TG是高血壓的重要危險因素，控制TG水平可減緩高血壓的發(fā)病[30]。目前，已有學者發(fā)現(xiàn)京尼平苷酸、金絲桃苷和蒙花苷可以起到降壓作用，其中金絲桃苷和蒙花苷可有效抑制Ang-II的表達而降低高血壓血管的張力[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)復方野菊花提取物能明顯降低模型大鼠血清中ALD、腎素、Ang-II、ACE水平，下調(diào)腎臟中腎素、ACE、Ang-II和主動脈中Ang-II的蛋白表達，上調(diào)ACE2的蛋白表達。說明復方野菊花提取物可能是通過抑制循環(huán)和腎臟局部RAAS的過度激活而起到降低血壓的作用。進一步對血清進行生化分析，發(fā)現(xiàn)復方野菊花提取物能夠降低模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C的水平，同時調(diào)節(jié)ET-1/NO的失衡，改善內(nèi)皮功能。結(jié)合病理學觀察，復方野菊花提取物能夠有效改善模型大鼠腎、心、主動脈等臟器的損傷，減輕高血壓對機體的損傷。

綜上，復方野菊花提取物能夠有效改善肝火亢盛諸證和心臟、腎臟、主動脈等靶器官的損傷，并通過抑制RAAS過度激活起到降壓作用，同時調(diào)節(jié)血脂代謝進而改善血管內(nèi)皮功能，最終起到改善肝火亢盛證高血壓的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of compoundextract on hypertensive model rats with liver-fire hyperactivity syndrome

WEI Ke-jian1, YU Jing-jing1, SU Jie1, XU Jie1, HU Xue-ling1, ZHOU Heng-pu1, HE Zi-wen1, YAN Mei-qiu1, CHEN Su-hong2, LYU Gui-yuan1

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

To explore the effect and hypotensive mechanism of compoundextract on hypertensive model rats with liver-fire hyperactivity syndrome.Spontaneously hypertensive rats (SHR) were ig compound Fuzi Decoction (復方附子湯) to induce hypertensive model with liver-fire hyperactivity syndrome, after the intervention of compoundextract, the indexes of TCM syndromes, heart rate and blood pressure of rats were monitored, the contents of renin-angiotensin-aldosterone dystem (RAAS) related factors in serum and kidney were measured, the levels of nitric oxide (NO), endothelin-1 (ET-1) and blood lipids in serum were detected, and the histomorphological changes of kidney, heart and aorta were observed.Compoundextract could significantly reduce the recovery time of vertigo, face temperature, ear temperature and urine absorbance (< 0.01), increase saliva secretion and fecal water content (< 0.01), and alleviate the temperament changes of model rats such as screaming, fighting and biting. Compoundextract significantly decrease heart rate, systolic blood pressure, diastolic blood pressure and mean arterial pressure (< 0.05, 0.01), reduce total cholesterol (TC), triacylglycerol (TG), low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) and ET-1 levels in serum (< 0.01), while increase NO level (< 0.01). Compoundextract could improve the abnormal tissue structure of heart, kidney and thoracic aorta, reduce the levels of aldosterone (ALD), renin, angiotensin-II (Ang-II) and angiotensin converting enzyme (ACE) in serum (< 0.05, 0.01), reduce the protein expressions of renin, Ang-Ⅱ, ACE in kidney and Ang-Ⅱ in thoracic aorta (< 0.05, 0.01), increase the protein expression of ACE2 in kidney (< 0.01).Compoundextract can alleviate liver-fire hyperactivity syndrome in hypertensive model rats, improve the endothelial status of hypertensive model rats, and its hypotensive mechanism may be related to the inhibition of RAAS over activation.

(L.) Des Moul.; hypertension; liver-fire hyperactivity syndrome; renin-angiotensin-aldosterone system; geniposidic acid; hyperoside; buddleoside

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4573 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.018

2023-03-24

國家自然科學基金資助項目（81873036）；國家自然科學基金資助項目（82003977）；浙江省重點研發(fā)計劃項目（2017C03052，2020C04020）；浙江省重點實驗室項目（2012E10002）

魏柯健，碩士研究生，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: wkj_955@163.com

呂圭源，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: lv.gy@263.net

陳素紅，研究員，博士生導師，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: chensuhong@zjut.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]