金忠調(diào),孫靜媛,梅瑛娜,夏敏琪,高凌

當(dāng)腹主動(dòng)脈橫徑超過正常橫徑 50%時(shí)可被診斷為腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA),AAA的危險(xiǎn)系數(shù)與動(dòng)脈橫徑呈正比,橫徑越大,破裂風(fēng)險(xiǎn)越高。既往認(rèn)為AAA僅僅是由于動(dòng)脈中膜的缺陷所導(dǎo)致,動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)降解、平滑肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)導(dǎo)致主動(dòng)脈壁受損[1]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮也直接或者間接參與了AAA病變[2]。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)葉酸(folic acid,FA)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能不全的AAA 模型小鼠(hph1小鼠是GTP環(huán)水解酶1缺乏的小鼠,因BH4 缺乏導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能不全)有治療作用[3],但是對(duì)其他AAA模型小鼠的治療作用以及機(jī)制不明。延胡索酸-3-氨基丙腈 (β-aminopropionitrile monofumarate,BAPN)是一種不可逆賴氨酸氧化酶(lysyl oxidase,LOX)抑制劑,可防止賴氨酸衍生醛的形成。LOX交聯(lián)彈性蛋白和膠原纖維,在維持彈性層的穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。有研究證明通過 NADPH 氧化酶 (NADPH oxidase,NOX) 的瞬時(shí)激活和隨之而來的過氧化氫依賴性、內(nèi)皮特異性四氫生物喋啉(Tetrahydrobiopterin,BH4)補(bǔ)救酶二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺乏來解偶聯(lián)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)[4]。故以血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)聯(lián)合BAPN建造另一種AAA小鼠模型,探究FA對(duì)其他模型的AAA是否有改善作用,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡C57BL/6雄性小鼠30只,SPF(specific pathogen free)級(jí),由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)屏障環(huán)境中,正常晝夜周期,自由飲水,室溫控制在(22.0±0.1)℃,濕度(60±10)%。(2)試劑與儀器:Ang Ⅱ(A9290)、葉酸(F8090)、HE染色試劑盒(G1120)、Weigert間苯二酚品紅染色試劑盒(G0032)購(gòu)自武漢索萊寶生物科技有限公司,BAPN購(gòu)自sigma公司,DHE熒光探針試劑(KFS377)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司, eNOS(GB11086)、MMP-2(GB11130)、MMP-9(GB12132)抗體購(gòu)自武漢市賽維爾生物科技有限公司,DHFR(A9299)抗體購(gòu)自愛博泰克生物科技有限公司。Altzet微量滲透泵購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司,高精度電子游標(biāo)卡尺購(gòu)自德國(guó)蘇測(cè),正置顯微鏡 (型號(hào)BX51,日本奧林巴斯),冰凍切片機(jī) (型號(hào) HM550,德國(guó)美康),酶標(biāo)儀 (EnSight 美國(guó)Perkin Elmer),化學(xué)發(fā)光儀 (ChemiDocTM Touch 美國(guó)BIO-RAD)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AAA造模:于2022年7—10月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[倫理號(hào):WDRM動(dòng)(福)第20210904號(hào)]。小鼠30只稱體質(zhì)量,依照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,正常對(duì)照組(n=10):實(shí)驗(yàn)全程用普通飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)水;AAA組(n=10):參照孫靜媛等[5]造模方法誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤,小鼠皮下植入微量滲透泵持續(xù)泵入 Ang Ⅱ (1 μg·kg-1·min-1) 28 d,同時(shí)用含0.25% BAPN 飼料飼喂 28 d; AAA+FA組(n=10):小鼠皮下植入微量滲透泵持續(xù)泵入 Ang Ⅱ (1 μg·kg-1·min-1)28 d,同時(shí)用含0．25% BAPN飼料飼喂28 d,葉酸(15 mg·kg-1·d-1)灌胃28 d。

1.2.2 樣品采集及處理:于實(shí)驗(yàn)第29天眼眶取血0.8 ml,4℃離心留取上清-80℃保存。取一部分新鮮腹主動(dòng)脈組織多聚甲醛中固定,行石蠟包埋;另一部分腹主動(dòng)脈組織液氨凍存,待用。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 腹主動(dòng)脈瘤直徑測(cè)量:所有小鼠開胸腹并暴露心臟、主動(dòng)脈及雙側(cè)腎臟,用生理鹽水沖洗心臟和主動(dòng)脈,將主動(dòng)脈與周圍組織分離,生理鹽水經(jīng)心臟灌入主動(dòng)脈中,使主動(dòng)脈保持正常形狀,使用高精度電子游標(biāo)卡尺測(cè)量主動(dòng)脈直徑,最寬處直徑大于正常值的50%時(shí),即認(rèn)定為發(fā)生腹主動(dòng)脈瘤。

1.3.2 腹主動(dòng)脈壁中彈性纖維變化觀測(cè):于實(shí)驗(yàn)第29天處死小鼠,剖開腹部暴露并分離腹主動(dòng)脈,剪切腹主動(dòng)脈用4%多聚甲醛保存。(1)腹主動(dòng)脈彈性纖維染色:主動(dòng)脈標(biāo)本從多聚甲醛中取出,行石蠟包埋,切片(橫切,片厚4 μm),切片脫蠟至水,置入Weigert間苯二酚品紅染色液的染缸,浸染3 h,沖洗,乙醇去除細(xì)胞漿背景著色,沖洗,常規(guī)脫水,透明,封片。置于正置顯微鏡下觀察并攝片。(2)腹主動(dòng)脈Masson染色:石蠟切片脫蠟至水,重鉻酸鉀染液滴染,鐵蘇木素液A與鐵蘇木素液B混合滴染;鹽酸酒精分化后麗春紅酸性品紅染液滴染,磷鉬酸分化液分化后苯胺藍(lán)染液滴染;乙醇脫水,二甲苯透明后,中性樹膠封片。采用40×放大倍數(shù)顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。

1.3.3 ROS含量檢測(cè): 采用二氫乙啶 (dihydroethidium,DHE) 熒光對(duì)腹主動(dòng)脈壁染色。小鼠新鮮腹主動(dòng)脈組織用冰凍切片包埋劑 (OCT) 包埋,用冰凍切片機(jī)垂直于血管縱軸切片;滴加DHE熒光染料,37℃避光孵育30 min,PBS洗3次,抗熒光淬滅劑封片,正置熒光顯微鏡鏡檢。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):取瘤樣病變血管組織46 mg,加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑冰浴勻漿,離心取上清,BSA法測(cè)定總蛋白濃度。取蛋白樣品加5×電泳緩沖液,加熱至變性,后凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,BSA封閉液封閉,一抗采用兔抗eNOS、MMP-2、MMP-9、DHFR抗體4℃孵育過夜,HRP標(biāo)記羊抗兔二抗孵育,洗脫、發(fā)光,曝光顯色。采用Image J軟件進(jìn)行光密度掃描進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生率及腹主動(dòng)脈直徑比較 AAA組發(fā)生腹主動(dòng)脈瘤8只(其中實(shí)驗(yàn)第21天腹主動(dòng)脈瘤破裂死亡1只),AAA+FA組發(fā)生腹主動(dòng)脈瘤4只,與AAA組比較,AAA+FA組小鼠腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生率降低(40.0% vs. 80.0%,χ2/P=1.667/0.170)。雖然腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生率降低無顯著差異,但與正常對(duì)照組比較,AAA組腹主動(dòng)脈直徑明顯增大[(0.99±0.07)mm vs.(2.08±0.50 )mm,t/P=6.417/<0.001],并且明顯大于AAA+FA組(1.44±0.19)mm,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=3.598/0.005)。見圖1。

圖1 3組小鼠腹主動(dòng)脈大體標(biāo)本比較Fig.1 Comparison of gross specimens of abdominal aorta in three groups of mice

2.2 3組小鼠腹主動(dòng)脈壁中彈性纖維變化比較 腹主動(dòng)脈Masson、Weigert間苯二酚堿性品紅染色顯示,與正常對(duì)照組比較,AAA組小鼠腹主動(dòng)脈瘤部位主動(dòng)脈壁彈力纖維排列紊亂,并且有斷裂及溶解,失去正常波浪狀結(jié)構(gòu);與AAA組比較,AAA+FA組小鼠腹主動(dòng)脈壁彈力纖維結(jié)構(gòu)完整平滑,走形規(guī)則連續(xù)呈波浪狀結(jié)構(gòu),見圖2。

圖2 3組小鼠腹主動(dòng)脈壁中彈性纖維變化比較(×40)Fig.2 Comparison of changes in elastic fibers in the abdominal aortic wall of three groups of mice (×40)

2.3 3組小鼠腹主動(dòng)脈壁中ROS含量表達(dá)比較 腹主動(dòng)脈DHE染色結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,AAA組紅色熒光明顯增強(qiáng),表明AAA小鼠腹主動(dòng)脈ROS表達(dá)增多;與AAA組比較, AAA+FA組小鼠腹主動(dòng)脈組織中紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱,表明 ROS 含量減少,見圖3。

圖3 3組小鼠腹主動(dòng)脈活性氧表達(dá)比較(二氫乙啶染色,×40)Fig.3 Expression of reactive oxygen species in the abdominal aorta of three groups of mice (stained with dihydroethylidine, ×40)

2.4 3組小鼠eNOS、DHFR、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)差異比較 與正常對(duì)照組比較,AAA組腹主動(dòng)脈eNOS、DHFR蛋白表達(dá)明顯下降,AAA+FA組上述2種蛋白表達(dá)高于AAA組(t/P=4.511/0.011,2.914/0.044)。MMP參與AAA的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)破壞和主動(dòng)脈壁重構(gòu)[6];通過Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈組織中MMP的表達(dá), MMP-2和MMP-9蛋白水平AAA組小鼠顯著高于正常對(duì)照組,而AAA+FA組小鼠主動(dòng)脈MMP-2和MMP-9蛋白水平顯著下降(t/P=4.206/0.048,5.267/0.011),見圖4。

圖4 3組小鼠腹主動(dòng)脈各蛋白表達(dá)比較Fig.4 Comparison of protein expression in abdominal aorta of three groups of mice

3 討 論

腹主動(dòng)脈瘤是多因素影響的具有潛在破裂風(fēng)險(xiǎn)的主動(dòng)脈病理擴(kuò)張性疾病。目前的治療方案主要是開放手術(shù)和介入治療,缺乏有效的藥物控制AAA的發(fā)展。本研究采用AngⅡ聯(lián)合BAPN誘導(dǎo)小鼠AAA模型進(jìn)行研究,采用口服給藥的方式給予葉酸干預(yù)。雖然結(jié)果顯示AAA組與AAA+FA組的AAA發(fā)生率無顯著差異,這可能是由于樣本數(shù)量少的原因。但是口服葉酸可以顯著抑制AngⅡ聯(lián)合BAPN誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈直徑擴(kuò)張,并且防止主動(dòng)脈彈性纖維破壞。

AAA的發(fā)病機(jī)制是多因素的,包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞對(duì)外膜和中膜的浸潤(rùn);平滑肌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化和喪失;動(dòng)脈瘤組織中氧化應(yīng)激水平的升高;細(xì)胞外基質(zhì)的降解[7]。目前認(rèn)為,AAA的發(fā)病機(jī)制還涉及動(dòng)脈粥樣硬化和血流動(dòng)力學(xué)紊亂,其中內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮了重要作用[8]。有研究已經(jīng)證明eNOS解偶聯(lián)與BH4缺乏的因果作用,以及eNOS再偶聯(lián)在AAA形成中的治療潛力[9]。eNOS解偶聯(lián)導(dǎo)致一氧化氮(nitric oxide,NO)生物利用度下降,氮氧化合物累積從而引起內(nèi)皮氧化應(yīng)激。BH4作為eNOS偶聯(lián)的輔助因子,當(dāng)BH4的從頭合成及補(bǔ)救合成限速酶DHFR缺乏時(shí),同樣會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[10-11]。有研究已經(jīng)證明,葉酸通過恢復(fù) DHFR 以恢復(fù) eNOS 功能來預(yù)防AngⅡ輸注apoE缺失小鼠AAA 模型[12]。本研究中使用AngⅡ聯(lián)合BAPN誘導(dǎo)的AAA模型中的結(jié)果與之相符。

除此之外,內(nèi)皮是刺激或抑制底層平滑肌細(xì)胞增殖的分子來源。在正常的血管壁中,平滑肌細(xì)胞是靜止的,但當(dāng)內(nèi)皮受損時(shí)則會(huì)增殖[13]。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的相互作用是多種心血管病過程的基礎(chǔ),如動(dòng)脈生成、動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈重塑[14]。葉酸通過恢復(fù)內(nèi)皮功能進(jìn)一步維持動(dòng)脈肌層穩(wěn)態(tài),抑制BAPN聯(lián)合AngⅡ誘導(dǎo)的中膜平滑肌細(xì)胞紊亂和炎性反應(yīng)。

MMP在AAA形成過程中起著重要作用[15]。在正常主動(dòng)脈中,內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞(SMC)和外膜成纖維細(xì)胞負(fù)責(zé)MMP的產(chǎn)生。在AAA的情況下,炎性細(xì)胞充當(dāng)MMP的額外來源[16]。MMP是與細(xì)胞外基質(zhì)(ECMs)降解機(jī)制關(guān)聯(lián)最緊密的一類酶,可降解腹主動(dòng)脈壁組織中膠原和彈力蛋白成分。AAA形成過程中起主要作用的種類為MMP-2、MMP-9。MMP-9和活化的MMP-2在異種移植動(dòng)脈瘤變性過程中上調(diào),這些酶的進(jìn)一步增加與破裂有關(guān)[17]。MMP-2、MMP-9由成纖維細(xì)胞和SMC產(chǎn)生,并在AAA形成期間通過浸潤(rùn)外膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[18-19]。據(jù)報(bào)道,FA治療降低了糖尿病大鼠及高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血癥小鼠誘導(dǎo)的MMP-2、MMP-9分泌及活性[20-21]。有研究證明,FA通過誘導(dǎo)5-亞甲基四氫葉酸還原酶(5-methylene tetrahydrofolate reductase,5-MTHFR)將Hcy重新甲基化為甲硫氨酸來降低同型半胱氨酸水平,并誘導(dǎo)了金屬蛋白酶組織抑制劑,共同降低金屬蛋白酶[22]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步表明,AAA中MMP-2、MMP-9上調(diào)明顯,葉酸口服治療后上述2種基質(zhì)金屬蛋白酶明顯下降。

綜上,口服葉酸可能成為預(yù)防或治療AAA的一種選擇。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

金忠調(diào):設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;孫靜媛、梅瑛娜、夏敏琪:實(shí)施研究過程,數(shù)據(jù)收集;高凌:提出研究方案、研究思路,論文審核