韋玲靜,呂業(yè)堅,甘寶江,黃 杰,劉 康,張 盛,滕忠作,莫飛龍,葉香塵

( 1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)引育種中心,廣西 南寧 530031; 2.柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站,廣西 柳州 545006 )

皮膚是魚類的重要組織器官,具有多種不同的顏色。魚的膚色和著色模式與其交配、信息傳遞和生理調(diào)節(jié)等生物學活動息息相關(guān),同時膚色也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的經(jīng)濟表型特征。遺傳條件是影響魚類膚色的主要因素[1]。已有研究人員提出了魚類皮膚著色遺傳基礎(chǔ)的初步見解[2-4]。真黑素主要產(chǎn)生黑色和棕色皮膚表型,而褐黑素主要產(chǎn)生黃色和紅色皮膚表型[5],這2種色素均通過黑色素合成途徑產(chǎn)生。目前已發(fā)現(xiàn)的與皮膚色素沉著相關(guān)的遺傳信號通路有黑色素合成通路、細胞外因子/β-連環(huán)蛋白信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路等,其中涉及的體色調(diào)控相關(guān)基因包括酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TYRP2)和黑素皮質(zhì)激素受體1(MC-1R)、灰鼠信號蛋白、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和黑色素濃集素等[6-8]。然而魚類皮膚顏色調(diào)控分子機制尚不十分清楚,各色素沉著相關(guān)基因及其調(diào)節(jié)網(wǎng)絡還需要進一步研究。

金邊鯉(Cypinuscarpio)是針對稻田養(yǎng)殖而選育出的鯉魚新品系。金邊鯉的原始選育群體中有黑色和金邊2種膚色個體,其中金邊個體數(shù)約占30%,其背部金色皮膚面積較小,呈斷續(xù)狀未連成條帶。而經(jīng)選育后的金邊鯉,其背部金色條帶面積增大呈連續(xù)狀,并且能夠穩(wěn)定遺傳[9]。在前期的研究工作中,筆者主要對金邊鯉的皮膚顏色差異、群體遺傳結(jié)構(gòu)、肌肉營養(yǎng)成分、腸道菌群等方面進行了系統(tǒng)分析[10-14]。在金邊鯉皮膚轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組差異表達分析中,2個組學分析均富集到了肌球蛋白結(jié)合蛋白C3(MyBPC3),且金色皮膚中的MyBPC3 mRNA和蛋白表達量顯著低于黑色皮膚,認為肌球蛋白結(jié)合蛋白C3可能與金邊鯉皮膚顏色變異調(diào)控機制有關(guān),這與前人對魚類皮膚色素沉著相關(guān)研究結(jié)果多有不同。

肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MyBPC)是一種胞內(nèi)多膜結(jié)構(gòu)蛋白,屬于免疫球蛋白和纖維連接蛋白超家族[15]。MyBPC位于肌小節(jié)A帶C區(qū)中粗肌絲兩端肌球蛋白頭部的連接處,連接原肌球蛋白、肌聯(lián)蛋白和肌動蛋白,是粗肌絲的重要組成部分,具有維護肌小節(jié)的完整性和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性功能,并通過磷酸化作用參與肌小節(jié)的收縮和舒張功能調(diào)節(jié)[16-19]。MyBPC基因具有3種不同的亞型:慢骨骼肌型MyBPC1、快骨骼肌型MyBPC2和心肌型MyBPC3。通常認為2種骨骼肌型MyBPC1/2基因只特異性表達于骨骼肌中,而MyBPC3基因特異性表達于心肌細胞[20]。人MyBPC3基因發(fā)生突變已被證實與心臟疾病的風險有關(guān),是肥厚性心肌病發(fā)生的主要因素,因此該基因成為心血管疾病相關(guān)研究的熱點[21-22]。

目前國內(nèi)外關(guān)于MyBPC3基因的研究主要集中在哺乳動物上,尚未有關(guān)于鯉MyBPC3基因克隆和表達分析的相關(guān)報道。筆者克隆金邊鯉心臟組織中MyBPC3基因,分析其結(jié)構(gòu)和組織表達特性,并探索該基因與黑色素合成相關(guān)基因TYR、TYRP1、TYRP2和MC-1R的關(guān)系,為初步研究金邊鯉皮膚色素沉著差異分子調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用金邊鯉取自廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)引育種中心武鳴基地。試驗魚有金邊鯉和無金邊鯉 (3月齡)均為同一池塘養(yǎng)殖,體質(zhì)量(74.74±0.92) g。試驗分別采集8尾有金邊鯉和8尾無金邊鯉的大腦、心臟、皮膚、肌肉、肝臟、脾臟、腎臟和腸道共8種組織樣品于2 mL凍存管中(圖1)。樣品用液氮速凍后轉(zhuǎn)入—80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 不同皮膚顏色金邊鯉個體Fig.1 Jinbian carp with different skin coloursa.有金邊鯉;b.無金邊鯉.a.common carp with yellow skin; b.common carp with black skin.

1.2 總RNA提取和cDNA合成

各組織總RNA采用Trizol法提取,電泳和超微量分光光度計檢測RNA完整性、濃度和純度。采用TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金)合成cDNA第1鏈,用于中間片段擴增;采用TransScript All-in-One First-Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒(北京全式金)合成cDNA用于qPCR。

1.3 中間片段擴增

根據(jù)GenBank中鯉(XM_019108924)、鯽(Carassiusauratus)(XM026215405)和斑馬魚(Daniorerio)(NM_001044349)預測的MyBPC3基因序列,設計3對引物(MyBPC3-F1、R1、F2、R2、F3、R3)(表1)用于擴增MyBPC3基因中間片段。PCR反應體系(20.0 μL):cDNA 1.0 μL,引物F和R各0.5 μL(10 μmol/L),PCR Mix 10.0 μL,雙蒸水 8.0 μL;反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,32個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物電泳檢測后測序。

表1 MyBPC3基因擴增引物序列Tab.1 Primer sequences of MyBPC3 gene amplification

1.4 5′ RACE和3′ RACE擴增

根據(jù)中間片段測序結(jié)果,采用Oligo 7.0軟件設計RACE引物MyBPC3 5′-GSP1、MyBPC3 5′-GSP2、MyBPC3 3′-GSP1、MyBPC3 3′-GSP2。UPM-long用于RACE第1輪PCR的通用引物,UPM-short用于RACE巢式PCR的通用引物(表1)。采用SMART RACE 5′/3′ Kit試劑盒(Clontech)進行RACE cDNA合成及PCR擴增。第1輪RACE PCR模板為cDNA,反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,5個循環(huán);94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,70 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,5個循環(huán);94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,25個循環(huán);72 ℃ 10 min。以第1輪PCR反應產(chǎn)物(稀釋50倍)為模板,采用TransStart GoldPfu PCR Mix(北京全式金)進行第2輪反應,反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,25個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化克隆后測序,測序結(jié)果采用SeqMan軟件進行拼接,獲得完整的cDNA序列。

1.5 MyBPC3基因表達分析

根據(jù)擴增獲得的cDNA序列設計合成定量引物MyBPC3-DF和MyBPC3-DR,以β-actin為內(nèi)參基因(表1)。以稀釋20倍的cDNA為模板,以TransStart Top Green qPCR SuperMix為反應試劑進行定量擴增。反應體系(20.0 μL):cDNA 2.0 μL,primer F 和R各0.5 μL(10.0 μmol/L),PCR Mix 10.0 μL,雙蒸水 7.0 μL。反應條件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,41個循環(huán)。每個樣品設置3個平行。同時利用本課題組前期研究已發(fā)表的金邊鯉皮膚黑色素合成相關(guān)基因(TYR、TYRP1、TYRP2和MC-1R)的相對表達量數(shù)據(jù)[23]與MyBPC3基因表達量數(shù)據(jù)結(jié)果進行相關(guān)性分析。

1.6 序列分析及數(shù)據(jù)處理

利用在線分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找MyBPC3基因開放閱讀框及其對應編碼氨基酸序列;利用在線工具ExPASY ProtPAram Tool (https://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質(zhì)的理化特性;利用NetPhos 3.0 server、TMHMM和SignalP 5.1等在線軟件預測蛋白磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽區(qū)域;利用Clustal X2和MEGA 7.1軟件進行氨基酸序列多重比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建(鄰接法,自展值為1000);利用WISS-MOEDL在線軟件預測蛋白三級結(jié)構(gòu);利用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量并利用Sigma Plot 12.5軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 MyBPC3序列特征

金邊鯉MyBPC3基因cDNA全長為4253 bp,ORF為3783 bp,編碼1260個氨基酸。其5′非編碼區(qū)(5′UTR)為44 bp,3′非編碼區(qū)(3′UTR)為427 bp,末端含有AATAAA的加尾識別信號和28個堿基的poly(A)結(jié)構(gòu)(圖2)。在線軟件預測可知,MyBPC3蛋白分子式為C6288H9961N1709O1908S48,分子質(zhì)量為141.57 ku,理論等電點為6.42,半衰期為30 h,不穩(wěn)定指數(shù)為38.80,總平均疏水性指數(shù)為-0.505,為親水性酸性蛋白,無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。MyBPC3共有119個潛在的蛋白磷酸化位點,其中PKC磷酸化位點21個,PKA磷酸化位點5個,屬于高度磷酸化蛋白(圖2)。MyBPC3蛋白的三級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)環(huán)狀三角結(jié)構(gòu)(圖3a、b)。

圖2 金邊鯉MyBPC3基因的cDNA全長序列及對應氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and amino acid sequences of the cDNA of MyBPC3 in Jinbian carp C. carpio黑色方框標示起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA);圓圈表示PKC磷酸化位點,六邊形表示PKA磷酸化位點;粗體下劃線表示3′-UTR端AATAAA序列;粗體表示為poly(A).The AA corresponding to start codon (ATG) and termination codon (TAA) is shown in the black box; circles represent PKC phosphorylation sites, hexagon represent PKA phosphorylation sites; the nucleotides corresponding to the polyadenylation signal in the 3′-untranslated region (AATAAA) are marked with bold and underlined; the poly (A) is marked with bold.

圖3 金邊鯉MyBPC3蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預測Fig.3 Prediction of the second structure and tertiary structure of MyBPC3 protein in Jinbian carp C. carpioa.MyBPC3三級結(jié)構(gòu)卡通模型; b.MyBPC3三級結(jié)構(gòu)空間立體球模型.a.Cartoon model of tertiary structure of MyBPC3; b.Space fill model of tertiary structure of MyBPC3.

2.2 MyBPC3同源性比較與進化樹分析

圖4 基于MyBPC3氨基酸序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of MyBPC3 based on Neighbor-Joining method of species amino acid sequence

2.3 MyBPC3基因的組織表達特性

以腎臟組織為參考,qRT-PCR檢測MyBPC3基因mRNA在金邊鯉不同組織中的相對表達量。結(jié)果顯示:MyBPC3在檢測的8個組織中均有表達,其中在心臟中的表達量最高,顯著高于大腦、皮膚、肌肉、脾臟、肝臟、腸道和腎臟組織(P<0.05)(圖5);同時MyBPC3基因在金邊個體的心臟和皮膚中的表達量顯著低于黑色個體(P<0.05)。

圖5 MyBPC3基因在不同組織中的相對表達量Fig.5 Expression levels of MyBPC3 gene in difference tissuesHe.心臟;Br. 腦;Sk. 皮膚;Mu. 肌肉;Sp. 脾臟;Li. 肝臟;Gu. 腸道;Ki. 腎臟.圖中不同大寫字母表示不同組織表達差異顯著(P<0.05),小寫字母表示同種組織表達差異顯著(P<0.05).He. heart; Br. brain; Sk. skin; Mu. muscle; Sp. spleen; Li. liver; Gu. gut; Ki. kidney; different capital letters indicate significant difference in different tissues (P<0.05), different letters indicate significant difference in the same tissues (P<0.05).

2.4 MyBPC3與黑色素合成相關(guān)基因的相關(guān)性分析

MyBPC3基因與黑色素合成相關(guān)基因表達水平的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,MyBPC3與TYR、TYRP1、TYRP2及MC-1R均呈正相關(guān),其中與TYR、TYRP2及MC-1R基因相關(guān)性顯著(P<0.05)(圖6)。

圖6 MyBPC3基因與黑色素合成相關(guān)基因TYR(a)、TYRP1(b)、TYRP2(c)和MC-1R(d)的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of MyBPC3 and related genes TYR(a), TYRP1(b), TYRP2(c) and MC-1R(d) of melanin synthesis

3 討 論

3.1 MyBPC3基因序列及結(jié)構(gòu)特點

目前已有文獻報道了多個物種的MyBPC3序列和功能信息,其中研究較為深入的主要集中在小鼠和人類等哺乳動物上,關(guān)于魚類的相關(guān)研究甚少[24-26]。筆者從金邊鯉心臟組織中克隆獲得了MyBPC3的cDNA序列全長,其開放閱讀框長3783 bp,編碼1260個氨基酸。MyBPC3無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu),為胞內(nèi)蛋白。同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析顯示,MyBPC3與鯽和斑馬魚的親緣關(guān)系較近,與原雞、小鼠和智人等禽類和哺乳類的進化距離分別為0.12、0.16和0.16,表明MyBPC3在各物種進化過程中相對保守。

3.2 MyBPC3基因組織表達特點

不同MyBPC亞型在心肌和骨骼肌中都有不同的調(diào)控,在MyBPC3缺失的情況下,骨骼亞型可以在心臟發(fā)生轉(zhuǎn)補體[20]。Dhoot等[27]認為骨骼肌和心肌MyBPC通常主要表達于相應的組織中,但是MyBPC1和MyBPC2在心臟組織中也有表達,同樣MyBPC3在骨骼組織中也可表達。Ward等[28]發(fā)現(xiàn)MyBPC3在鳥類和兩棲類動物的骨骼肌發(fā)育中均有表達。本試驗中MyBPC3基因在金邊鯉心臟、腦、皮膚和肌肉等組織中均有表達,其中在心臟中的表達量最高,為主要效應組織,這與已有研究的人MyBPC3基因組織表達的結(jié)果基本一致[29]。同時筆者還發(fā)現(xiàn),MyBPC3基因在金邊個體的心臟和皮膚中的表達量均顯著低于黑色個體,推測其表達差異可能與其皮膚顏色變異有關(guān)。

3.3 MyBPC3功能與金邊鯉體色變異的關(guān)系

MyBPC3通常以磷酸化形式存在于血清中。腎上腺素能受體激活、膽堿能受體激活、內(nèi)皮素、Ca2+等均可引起MyBPC3磷酸化,且主要通過蛋白激酶和鈣/磷脂依賴性蛋白激酶途徑進行[30-31]。在受到β-腎上腺素刺激時,MyBPC3通過磷酸化作用于肌聯(lián)蛋白、肌動蛋白和肌球蛋白,加速橫橋與肌動蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)肌絲運動[32-33]。筆者預測得到MyBPC3的多個PKA和PKC磷酸化位點,推測這些磷酸化位點在調(diào)節(jié)肌絲的收縮和舒張功能上發(fā)揮重要作用。黑色素是存在于脊椎動物體內(nèi)的主要色素,其生物合成由多種酶類參與,并受多基因調(diào)控[34-35]。大量研究已證實,黑素皮質(zhì)激素受體1、酪氨酸酶、酪氨酸相關(guān)蛋白1、酪氨酸相關(guān)蛋白2是調(diào)控黑色素合成途徑中的主要基因[5,36-38]。細胞骨架和肌絲微管相關(guān)蛋白參與黑色素在角質(zhì)形成細胞內(nèi)的分布和運動,肌動蛋白可作為黑素體的運輸馬達,與肌球蛋白一同為黑素體轉(zhuǎn)運提供動力[39]。筆者在前期的金邊鯉皮膚轉(zhuǎn)錄組研究中富集到了與細胞骨架和肌絲蛋白的相關(guān)基因,包括心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白基因(MyBPC2和MyBPC3)、肌動蛋白基因(ACTC1和ACT3)、肌球蛋白基因(MYH1、MYH2、MYH6和MYH7)、肌漿球蛋白基因(TPM1、TPM2和TPM3),這些基因均在金邊個體皮膚中表達下調(diào),并發(fā)現(xiàn),除了MyBPC2和MyBPC3基因,其余的均為心肌腎上腺素信號通路中的基因[10]。有研究顯示,β2腎上腺素能受體通過G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶A(GS-AC-PKA)途徑調(diào)節(jié)酪氨酸酶活性及其相關(guān)基因,從而影響黑色素的合成[40]。本研究中,金邊鯉皮膚中MyBPC3基因表達量與黑色素合成相關(guān)基因TYR、TYRP2及MC-1R基因均為顯著正相關(guān),且金邊個體皮膚中的MyBPC3表達量下調(diào),推測MyBPC3可能通過心肌腎上腺素信號通路間接參與黑色素合成以及調(diào)節(jié)黑色素在角質(zhì)形成細胞的分布和運動,從而形成了金邊鯉皮膚色素沉著差異。

4 結(jié) 論

筆者從金邊鯉的心臟組織中克隆獲得了MyBPC3基因序列,其開放閱讀框為3783 bp,編碼1260個氨基酸。金邊鯉MyBPC3與鯽的進化地位最為接近。組織表達分析和相關(guān)性分析結(jié)果顯示,MyBPC3基因與黑色素合成相關(guān)基因TYR、TYRP2及MC-1R基因均為顯著正相關(guān),且其在金邊個體的心臟和皮膚中表達量顯著低于金邊個體(P<0.05)。結(jié)果表明,MyBPC3基因可能影響金邊鯉皮膚黑色素的合成,其基因表達差異可能是金邊鯉皮膚顏色差異形成的原因。該結(jié)果可為研究金邊鯉皮膚色素沉著差異調(diào)控機制提供參考。