劉 驥,陳艷茹,侯竹美,徐冬雪,谷元雪,宋文琦,宋宜澤,夏 斌

( 青島農(nóng)業(yè)大學,海洋科學與工程學院,山東 青島 266109 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus),屬棘皮動物門海參綱經(jīng)濟物種,具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。截至2020年底,我國仿刺參年產(chǎn)量1.97×106t,總產(chǎn)值超300億元[1]。隨著仿刺參養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,其病害問題也日益凸顯,給廣大養(yǎng)殖從業(yè)者帶來了嚴重的經(jīng)濟損失,其中以腐皮綜合征的危害最為嚴重,發(fā)病死亡率超過90%[2]。

燦爛弧菌(Vibriosplendidus),屬弧菌科弧菌屬細菌,革蘭氏陰性菌,可引發(fā)仿刺參、大西洋鮭(Salmosalar)和菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物患細菌性疾病[3-4]。目前已知仿刺參腐皮綜合征的主要病原為燦爛弧菌[5-8],其感染后可經(jīng)仿刺參體內(nèi)MyD88依賴的TLR信號通路進行信號轉(zhuǎn)導并引發(fā)免疫應答[9],改變仿刺參體內(nèi)免疫相關(guān)酶的活性[10]。為有效預防和控制燦爛弧菌引發(fā)的相關(guān)疾病,開發(fā)快速靈敏、特異可靠的燦爛弧菌檢測技術(shù)十分必要。另外,水產(chǎn)動物弧菌病的發(fā)生也與病原豐度直接相關(guān)[11],因此建立燦爛弧菌的定量檢測方法有著重要意義。目前已有的燦爛弧菌檢測方法包括細菌分離培養(yǎng)-生理生化試驗、基于蛋白質(zhì)檢測的免疫學技術(shù)[雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法、斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(Dot-ELISA)等]和基于核酸檢測的分子生物學技術(shù)(PCR法、核酸探針法)等[12-15]。然而,生理生化試驗靈敏度低、特異性差;分離培養(yǎng)法和免疫學檢測周期長、通量低;以PCR和核酸探針為代表的分子生物學檢測方法所需的儀器設備和人員培訓投入高、核酸探針設計復雜且昂貴,無法適用于基層單位和養(yǎng)殖現(xiàn)場等場所。

成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列(CRISPR)及其相關(guān)蛋白(Cas)是原核生物中廣泛存在的一種通過切割核酸來抵御病毒和外源核酸入侵的天然免疫防御系統(tǒng)[16]。近年,科學家們發(fā)現(xiàn),Cas13a在激活后具有核酸附屬切割活性,Gootenberg等[17]提出了基于CRISPR-Cas13a的核酸檢測方法:Cas13a可通過其內(nèi)部的CRISPR RNA(crRNA)識別并結(jié)合靶標RNA,從而激活Cas13a的附屬切割活性,非特異地切割RNA探針以檢測靶標RNA的存在。此后,他們進一步結(jié)合重組酶介導的聚合酶擴增(RPA)技術(shù),建立了SHERLOCK分子檢測平臺[18],并將其成功應用于病毒核酸分子(如寨卡病毒、埃博拉病毒、A型禽流感病毒等)和其他分子(如miRNA和N1-甲基腺苷等)的檢測[19-23]。

筆者設計針對燦爛弧菌gyrB基因的靶標特異性RPA引物和crRNA,利用CRISPR-Cas13a,建立1種CRISPR-Cas13a輔助的RPA檢測技術(shù)(圖1),旨在實現(xiàn)對燦爛弧菌快捷、靈敏、特異的定量檢測,為該病原引發(fā)的水產(chǎn)動物相關(guān)弧菌病的早期診斷和有效防控提供新的分子工具。

圖1 燦爛弧菌RPA-Cas13a快速檢測技術(shù)原理Fig.1 Schematic of RPA-Cas13a rapid detection of V. splendidus

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

1.1.1 菌株及樣本

試驗所用燦爛弧菌由中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所贈與,創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)、產(chǎn)黑假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophlia)和遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)為實驗室前期自養(yǎng)殖環(huán)境中分離,以上菌株均已在本實驗室保存。32份健康和疑似患腐皮綜合征的仿刺參皮膚黏液樣品、15份養(yǎng)殖水體樣本和10份表層沉積物樣品采集自山東青島、煙臺和威海的6個仿刺參養(yǎng)殖池塘。

1.1.2試劑與儀器

質(zhì)粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a購自武漢淼靈生物科技有限公司;細菌基因組核酸提取使用E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit(美國Omega Bio-tek公司);沉積物樣品DNA提取使用FastDNA?Spin Kit for Soil(MP bio);RPA使用TwistAmp?Basic kit(TwistDx);T7 RNA聚合酶、NTPs、柱形RNA純化試劑盒和RNase抑制劑均購于紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司;ABI 7500實時熒光定量PCR儀購于美國賽默飛公司;SpectraMax iD5多功能酶標儀購于美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 LwCas13a的表達與純化

將質(zhì)粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a轉(zhuǎn)化至RosettaTM (DE3) pLysS Singles感受態(tài)細胞(美國Millipore公司)后,進行Cas13a的表達,調(diào)整異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度、誘導溫度和誘導時間等以優(yōu)化蛋白表達條件,利用重組蛋白N末端的His標簽進行鎳柱純化,同時利用類泛素蛋白修飾分子(SUMO)標簽促溶促表達,經(jīng)酶切后過離子柱去除標簽,獲得純凈目的蛋白后透析并于-80 ℃保存于蛋白儲存緩沖液(600 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、5%甘油、1 mmol/L二硫蘇糖醇,pH 8.0)中。

1.2.2 RPA引物設計

燦爛弧菌的保守基因包括gyrB、16S rRNA、toxR、hsp60、vhhp2等,在GenBank中下載相關(guān)基因序列并在MegAlign中比對分析,最終選定在細菌中廣泛存在,在基因組中呈單拷貝、進化速度相對更快、堿基替換率高、無頻繁的基因水平轉(zhuǎn)移、特別適合親緣關(guān)系較近菌種的區(qū)別和鑒定的gyrB基因作為檢測燦爛弧菌的靶標基因[24-26]。選取50株燦爛弧菌和17株非燦爛弧菌(包括鰻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和遲緩愛德華氏菌等)的gyrB基因,尋找燦爛弧菌gyrB基因特異的保守區(qū)序列,并據(jù)此設計其RPA引物,在反向引物5′端添加T7 RNA聚合酶啟動子序列(表1)。

表1 燦爛弧菌RPA引物、crRNA和RNA報告探針序列Tab.1 Sequences of Vibrio splendidus RPA primers, crRNA and RNA-probe

1.2.3 crRNA的制備

根據(jù)設計的燦爛弧菌crRNA序列(表1),合成用于體外轉(zhuǎn)錄crRNA的模板(5′-TCATCTCAC GAGCTTTACGCGCTGCATCGTTTTAGTCCCC TTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTAT AGTGAGTCGTATTA-3′,下劃線部分為T7 RNA聚合酶的啟動子序列)及其互補鏈,通過雙鏈退火反應和T7 RNA聚合酶[紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司]體外轉(zhuǎn)錄制備crRNA。

1.2.4 RPA強化的CRISPR-Cas13a檢測

參照TwistAmp?Basic kit(TwistDx)說明書配置燦爛弧菌RPA反應體系(50 μL):將基礎緩沖液29.5 μL,10 μmol/L上、下游引物(表1)各2.4 μL,雙蒸水 12.2 μL,1.0 μL DNA模板加入到TwistdxAmp基礎單元中,混勻后加入2.5 μL 乙酸鎂溶液(280 mmol/L),37 ℃孵育20 min進行RPA反應。

CRISPR-Cas13a檢測反應體系如下(50 μL):5 μL RPA 擴增產(chǎn)物,22.5 nmol/L crRNA,45 nmol/L Cas13a,2 μL RNase inhibitor[紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司],125 nmol/L RNA-probe(青島友虹生物化學科技有限公司),0.6 μL T7 RNA Polymerase Mix,2.5 μL NTP Buffer Mix[紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司],最后用Cas13a檢測緩沖液(60 mmol/L NaCl、40 mmol/L Tris-HCl、6 mmol/L MgCl2,pH 7.3)補齊至50 μL。通過SpectraMaxiD5多功能酶標儀在37 ℃下孵育2 h,并于485 nm的激發(fā)光和520 nm的發(fā)射光下每5 min收集1次熒光信號。

1.2.5 RPA-Cas13a檢測的靈敏度和特異性試驗

根據(jù)質(zhì)粒質(zhì)量濃度和長度計算稀釋前人工合成含有g(shù)yrB基因的質(zhì)粒(擎科生物)的拷貝數(shù),并進行梯度稀釋,最終獲得5.5×101～5.5×108拷貝/μL共8個gyrB基因的密度梯度,作為DNA模板對燦爛弧菌的CRISPR-Cas13a結(jié)合RPA檢測方法進行靈敏性評價。按同樣梯度稀釋方法制備燦爛弧菌熒光定量PCR檢測的DNA模板標準品并進行熒光定量PCR檢測[反應體系:10 μL 2×SYBR?Green Pro Taq HS Premix(艾科瑞生物),1 μL DNA模板,10 μmol/L上、下游引物(同RPA引物,見表1),0.4 μL ROX reference dye(艾科瑞生物),ddH2O補齊至20 μL。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。得到其對應循環(huán)閾值并以循環(huán)閾值≤35為陽性判別標準]。比較RPA-Cas13a和熒光定量PCR的檢測敏感性差異。

選取燦爛弧菌,與燦爛弧菌同屬不同種的創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌,與弧菌親緣關(guān)系相近的美人魚發(fā)光桿菌,仿刺參的常見致病菌產(chǎn)黑假交替單胞菌、嗜水氣單胞菌和水產(chǎn)動物常見致病菌遲緩愛德華氏菌及其混合培養(yǎng)物(9種菌株混合培養(yǎng)及無燦爛弧菌8種菌株的混合培養(yǎng))作為對照,提取其基因組DNA,利用燦爛弧菌的RPA引物(表1)對提取獲得的DNA進行RPA反應和后續(xù)CRISPR-Cas13a檢測,判斷該檢測方法的特異性。

1.2.6 養(yǎng)殖環(huán)境樣本驗證

采集青島、煙臺和威海養(yǎng)殖池塘32份仿刺參的皮膚黏液樣本、15份養(yǎng)殖水體樣本和10份表層沉積物樣品,通過十二烷基苯磺酸鈉-苯酚-氯仿法進行皮膚黏液樣本和養(yǎng)殖水體樣品DNA提取,利用試劑盒提取表層沉積物樣品DNA,以RPA-Cas13a和熒光定量PCR(qRT-PCR)法進行同步檢測,比較兩種方法對檢測實際養(yǎng)殖環(huán)境樣本的效果一致性。

1.2.7 統(tǒng)計分析

采用R軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料采用學生t檢驗,計數(shù)資料采用配對卡方檢驗,分析不同熒光信號強度的差別以及不同方法檢測實際養(yǎng)殖環(huán)境樣品中燦爛弧菌檢出率的結(jié)果差異,雙尾P<0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LwCas13a的表達及純化

對LwCas13a目的基因進行克隆,并對蛋白表達條件進行優(yōu)化,最終選定500 μmol/L IPTG,18 ℃誘導表達16 h,經(jīng)鎳柱純化、SUMO蛋白酶切割、離子柱純化和透析后,通過SDS-PAGE電泳檢測產(chǎn)物,結(jié)果顯示獲得了高純LwCas13a(圖2)。

圖2 純化LwCas13a蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.2 SDS-PAGE detection of purified LwCas13a protein

2.2 燦爛弧菌CRISPR-Cas13a結(jié)合RPA檢測的靈敏度

以梯度稀釋的DNA質(zhì)粒標準品(5.5×101～5.5×108拷貝/μL,gyrB)作模板進行檢測,發(fā)現(xiàn)RPA-Cas13a的檢測靈敏度為550拷貝/μL(gyrB)(圖3)。熒光定量PCR和RPA-Cas13a具有相同的檢測靈敏度,亦為550拷貝/μL(gyrB DNA分子的密度低于550拷貝/μL時,PCR擴增的循環(huán)閾值大于35,圖4)。

圖3 RPA-Cas13a檢測燦爛弧菌gyrB基因的靈敏度測試Fig.3 Sensitivity test for RPA-Cas13a detection of V. splendidus gyrB geneDW.雙蒸水;5.5×101～5.5×108. 5.5×101～5.5×108拷貝/μL(gyrB);*.與DW組比較有顯著性差異(P<0.05).DW. ddH2O; 5.5×101—5.5×108. 5.5×101—5.5×108 copies/μL(gyrB); *.compared with DW group, significant differences were observed(P<0.05).

圖4 熒光定量PCR法檢測不同拷貝數(shù)濃度燦爛弧菌gyrB基因的擴增曲線Fig.4 Amplification curves of V. splendidus gyrB gene with different concentrations detected by fluorescence quantitative PCR1～9.5.5×108～5.5×100拷貝/μL(gyrB);10.陰性對照(ddH2O);虛線表示設置的用于獲得循環(huán)閾值的熒光信號強度閾值.1-9. 5.5×108—5.5×100 copies gyrB/μL; 10. negative control (ddH2O); the dashed line indicates the fluorescence intensity threshold set to obtain the CT values.

2.3 燦爛弧菌CRISPR-Cas13a結(jié)合RPA檢測的特異性

特異性試驗結(jié)果顯示,僅具有燦爛弧菌DNA的樣本經(jīng)RPA-Cas13a檢測有熒光信號產(chǎn)生,而對照菌株及無燦爛弧菌的菌株混合培養(yǎng)物均未出現(xiàn)明顯熒光信號(圖5),表明建立的方法用于檢測燦爛弧菌具有較高的特異性。

圖5 RPA-Cas13a檢測燦爛弧菌gyrB基因的特異性測試Fig.5 Specificity test for RPA-Cas13a detection of V. splendidus gyrB gene*.與其他組比較有顯著性差異(P<0.05);紅色表示檢測結(jié)果為陽性,黑色表示檢測結(jié)果為陰性.*.compared with other groups, significant differences were observed(P<0.05); red color indicates positive test results, while black indicates negative test results.

2.4 養(yǎng)殖環(huán)境樣本檢測效果評價

提取32份養(yǎng)殖環(huán)境仿刺參皮膚黏液樣本、15份養(yǎng)殖水體樣本和10份表層沉積物樣本的DNA,分別采用RPA-Cas13a和熒光定量PCR法檢測樣本中的燦爛弧菌。結(jié)果顯示:RPA-Cas13a法共檢出陽性標本5份(陽性率8.77%);熒光定量PCR法共檢出陽性標本5份(陽性率8.77%),兩種檢測方法的實際應用效果無統(tǒng)計學差異(P>0.05)、一致性高(Kappa=1.00)(表2)。

表2 RPA-Cas13a和熒光定量PCR檢測養(yǎng)殖環(huán)境樣本的效果比較Tab.2 Comparison of the detection effects between RPA-Cas13a and quantitative PCR on aquacultural samples

3 討 論

隨著仿刺參養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖密度的增加,其病害問題日益凸顯,其中以腐皮綜合征危害最為嚴重,每年因該傳染性疾病造成的經(jīng)濟損失可達數(shù)十億元[27-28]。燦爛弧菌是引發(fā)仿刺參腐皮綜合征的主要病原之一[5-8],它可以快速感染仿刺參的體壁黏膜、肌肉和內(nèi)臟組織,發(fā)病后幾天內(nèi)便可導致大規(guī)模死亡。該菌也是其他多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的重要致病菌,可引發(fā)魚類皮膚潰瘍、內(nèi)臟糜爛,引起蝦、蟹、牡蠣和貽貝大量死亡,嚴重影響海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此,對養(yǎng)殖環(huán)境中燦爛弧菌進行快速定量檢測以便對相關(guān)水產(chǎn)動物弧菌病進行早期預警是水產(chǎn)病原微生物研究領域亟待解決的問題之一。

3.1 RPA-Cas13a檢測燦爛弧菌的原理分析

目前,針對燦爛弧菌已有的檢測手段均存在某些局限性,如:常規(guī)細菌分離純化和生理生化鑒定過程繁瑣、通量低;免疫學檢測特異性不強,易造成假陽性或假陰性結(jié)果;分子生物學檢測方法中的PCR技術(shù)所需儀器昂貴且不便攜,核酸等溫擴增技術(shù)中的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)引物設計難度較大且常出現(xiàn)非特異性擴增,核酸序列依賴擴增技術(shù)需要在變溫條件下才能完成引物結(jié)合且只能依賴RNA無法利用DNA作為模板;而RPA技術(shù)引物設計相對簡單、反應溫度低且恒定,近年來已得到普及,但該技術(shù)也存在產(chǎn)物檢測繁瑣、熒光探針設計復雜等問題。近年研究發(fā)現(xiàn),Cas9可與DNA靶序列的特異性位點結(jié)合并激活切割活性,自此開啟了利用CRISPR/Cas系統(tǒng)進行基因編輯的新時代[16]。除基因編輯功能外,Cas13a在特異性crRNA的引導下可結(jié)合靶標RNA并激活其附屬切割活力,對臨近RNA進行無選擇性非特異切割?；诖?可選擇在Cas13a+crRNA+靶標RNA的反應體系中添加非特異RNA報告探針,便可對靶標核酸分子開展特異性檢測[29-30]。Kellner等[18,31]進一步將RPA技術(shù)與CRISPR/Cas系統(tǒng)相結(jié)合,建立了SHERLOCK(應用Cas13a)和DETECTR(應用Cas12a)核酸檢測系統(tǒng),以上兩種檢測方法利用RPA技術(shù)對樣本中的靶標DNA分子進行信號預放大后再利用Cas識別并切割,使得檢測更加快速靈敏、特異性更強。

3.2 RPA-Cas13a檢測燦爛弧菌的靈敏性及特異性分析

經(jīng)燦爛弧菌靶標基因gyrB的RPA處理、T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄后,產(chǎn)生的靶標RNA分子在特異性crRNA的引導下結(jié)合Cas13a并激活其附屬切割活性,切割體系中添加的非特異RNA探針釋放熒光信號,以檢測樣品中燦爛弧菌的數(shù)量。本檢測方法無需設計和合成復雜的熒光探針,降低了檢測難度和成本。另外,T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄和Cas13a的附屬切割均可進行信號放大,使得RPA-Cas13a法相較單純RPA的檢測靈敏度更高,達到了DNA分子102個/μL量級,與本研究中熒光定量PCR的檢測靈敏度水平一致,與Chang等[32]通過RPA-Cas13a法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的靈敏度在同一數(shù)量級,但低于于永翔等[33]通過熒光定量PCR檢測的燦爛弧菌靈敏度(20拷貝/μL gyrB)。從不同稀釋梯度燦爛弧菌gyrB基因產(chǎn)生的熒光信號來看,其強度與gyrB基因密度呈正相關(guān)關(guān)系,因此熒光信號強度可用于初步定量養(yǎng)殖環(huán)境中燦爛弧菌的豐度或水產(chǎn)動物的燦爛弧菌攜帶量。

特異性crRNA的引導決定了該檢測過程是一種序列特異的識別過程,非燦爛弧菌gyrB基因的RPA產(chǎn)物因無法結(jié)合特異性crRNA而不能激活Cas13a的附屬切割活力。與單純RPA熒光檢測法相比,無需探針的雙熒光標記和引物四氫呋喃取代及末端封閉修飾等復雜設計,便可保證檢測方法的高度特異性,試驗成本和難度更低。目前已知燦爛弧菌可分為兩種生物型——生物Ⅰ型與Ⅱ型,均具有致病性[34],本方法對檢測以上兩種類型的燦爛弧菌在敏感性和特異性方面是否存在差異,尚待進一步研究。對仿刺參養(yǎng)殖環(huán)境樣品的檢測結(jié)果顯示,本方法與熒光定量PCR法的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學差異,檢出一致性高,表明該方法應用于實際環(huán)境樣本的特異性和準確性是可靠的。由于RPA-Cas13a的整個檢測過程均可在37 ℃恒溫下進行,現(xiàn)場實際操作中只需1臺便攜式恒溫熒光檢測儀,且整個檢測過程耗時較短,在1 h內(nèi)便可以進行結(jié)果判讀,因此適合在基層單位和養(yǎng)殖場使用。

3.3 RPA-Cas13a檢測燦爛弧菌的優(yōu)化方向

由于本方法需要先單獨完成RPA處理,獲得產(chǎn)物進行純化后,再加入到CRISPR-Cas13a檢測體系中,所以實際操作中較易引發(fā)陰性對照污染以及樣本間的交叉污染。在后續(xù)研究中,一方面可在RPA體系表面滴加油脂封住液面,防止污染;另一方面,也可對擴增和檢測體系進行優(yōu)化,實現(xiàn)單管一步法反應。若將熒光探針中的熒光淬滅基團改為生物素,便可與側(cè)向流動試紙相結(jié)合實現(xiàn)可視化定性檢測,最大程度減少對儀器設備的依賴,進一步降低應用成本。另外,如何簡化環(huán)境樣品中核酸提取的操作,甚至開發(fā)一套無需進行核酸提取的檢測方法,也是今后需要繼續(xù)探討的問題。

關(guān)于靶標基因的選擇,gyrB是DNA促旋酶B亞單位的編碼基因,具有在細菌基因組中廣泛存在、序列相對保守、單拷貝,相對16S rRNA基因進化速度更快、堿基替換率更高、無頻繁基因水平轉(zhuǎn)移等特征,特別適用于區(qū)別和鑒定親緣關(guān)系較近的菌種[24-26]?；【鷮儆捎谳^為龐大、細菌種較多,種間親緣關(guān)系較近,因此選擇該基因作為靶標恰好可滿足檢測需求,但其他具有類似遺傳和進化特征的管家基因,如rpoB、gapA、pyrH和recA等[35],均可在今后的試驗中考慮作為靶標建立有關(guān)檢測方法。

4 結(jié) 論

筆者將CRISPR-Cas13a系統(tǒng)與RPA技術(shù)相結(jié)合,建立了RPA-Cas13a檢測方法,應用于仿刺參腐皮綜合征主要病原體——燦爛弧菌的快速定量檢測。該方法簡單、靈敏、特異、高效,為預警和防控由燦爛弧菌引發(fā)的水產(chǎn)動物病害,實現(xiàn)水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖提供了有力的分子工具,也為建立其他水產(chǎn)病原體的快速分子檢測方法提供了思路。