姜潔明,劉 鷹,3,劉 奇,閆紅偉

( 1.大連海洋大學(xué),遼寧 大連 116023; 2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023; 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266237 )

大多數(shù)脊椎動(dòng)物在形態(tài)和生理上表現(xiàn)出顯著的雌雄兩性性別差異,長(zhǎng)期以來(lái),性別一直是生命科學(xué)研究的重大命題之一[1]。性別決定和性別分化相互聯(lián)系又有所區(qū)別,性別決定是確定性別分化方向的方式,性別分化為具有雙向潛力的未分化性腺經(jīng)過(guò)程序性發(fā)生的一系列事件,發(fā)育成精巢或卵巢,并出現(xiàn)第二性征的過(guò)程[2]。大部分魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)具有顯著的性別差異,如黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)[3]、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[4]、烏鱧(Channaargus)[5]等的雄性個(gè)體大于雌性,鯉(Cyprinuscarpio)[6]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]、大西洋鮭(Salmosalar)[8]、歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[9]和半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[10]等雌性成魚(yú)個(gè)體大于雄性。此外,鱘魚(yú)卵可以做魚(yú)子醬,雌魚(yú)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)高于雄魚(yú),而河鲀的精巢在我國(guó)稱之為“西施乳”,雄魚(yú)價(jià)格高于雌魚(yú),因此,在生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)單性育種可以極大提高經(jīng)濟(jì)效益[11]。與其他脊椎動(dòng)物相比,魚(yú)類(lèi)分布廣、種類(lèi)多,同時(shí)也擁有最為多樣的性別決定方式。因?yàn)轸~(yú)類(lèi)的分類(lèi)處于承上啟下的地位,其性別決定除了受到遺傳因素的影響外,還容易受到外界環(huán)境的影響,如溫度、pH、密度、光照強(qiáng)度、溶解氧含量等,并具有高度的可塑性[12-14]。

核酸是遺傳的分子基礎(chǔ),它的堿基序列上包含生物體所有的遺傳信息,幾乎所有的生命活動(dòng)均由基因調(diào)控[15]。1942年,Waddington在研究細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)時(shí),首次提出了表觀遺傳學(xué)的概念[16],經(jīng)過(guò)30年的沉寂后,在20世紀(jì)70年代再次進(jìn)入人們的視野,并于20世紀(jì)80年代后期被重新提出,20世紀(jì)90年代末至今迅猛發(fā)展,成為生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一[16]。表觀遺傳學(xué)主要研究在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下,DNA及有關(guān)蛋白分子發(fā)生的可遺傳修飾,這些修飾可被細(xì)胞“記憶”并在隨后的細(xì)胞分裂過(guò)程中保留下來(lái)[17]。目前表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究?jī)?nèi)容主要包括DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控及組蛋白修飾等。研究人員發(fā)現(xiàn),表觀遺傳修飾在魚(yú)類(lèi)的性別分化過(guò)程中具有重要的作用,開(kāi)展與魚(yú)類(lèi)性別分化過(guò)程相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究,對(duì)深入了解其性別形成機(jī)制具有重要意義。因此,筆者重點(diǎn)從DNA甲基化和非編碼RNA等方面,綜述魚(yú)類(lèi)性別形成的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步深入研究魚(yú)類(lèi)性別分化過(guò)程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 DNA甲基化在魚(yú)類(lèi)性別決定和分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制

在脊椎動(dòng)物中DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,將S-腺苷-L-甲硫氨酸中的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶環(huán)第5位碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶[18-20]。DNA甲基化通常與基因沉默有關(guān),正常的甲基化水平是調(diào)控生物體基因表達(dá)的重要方式之一,參與較多生理過(guò)程,如維持染色體結(jié)構(gòu)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化等,而異常的甲基化水平則會(huì)引發(fā)疾病。DNA甲基化主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶dnmt1、dnmt3a、dnmt3b和dnmt3l催化[21]。其中,DNA復(fù)制后,dnmt1是DNA甲基化最主要的酶,負(fù)責(zé)將半甲基化位點(diǎn)恢復(fù)到完全甲基化及維持甲基化,Dnmt3a和dnmt3b主要參與新位點(diǎn)甲基化的形成過(guò)程。Dnmt3l主要是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)其他甲基轉(zhuǎn)移酶的活性,而其本身不具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性[22]。復(fù)制后的DNA修飾主要發(fā)生在DNA序列中的胞嘧啶上(CPG二核苷酸),這些二核苷酸可以聚集在被稱為CPG島的DNA小片段中,CPG島中存在于許多重要的基因啟動(dòng)子區(qū)。DNA甲基化過(guò)程會(huì)影響其基因的結(jié)構(gòu),從而進(jìn)一步影響RNA轉(zhuǎn)錄,引起基因沉默。DNA的去甲基化會(huì)誘導(dǎo)基因重新表達(dá),去甲基化過(guò)程也同樣重要,去甲基化包括主動(dòng)去甲基化和被動(dòng)去甲基化兩個(gè)主要過(guò)程:主動(dòng)去甲基化是DNA去甲基酶參與過(guò)程下形成的去甲基化,被動(dòng)去甲基化是DNA甲基化維持機(jī)制受到影響[15]。

魚(yú)類(lèi)性別具有很強(qiáng)的可塑性,很容易受到環(huán)境因素的影響。已有研究表明,環(huán)境可能會(huì)影響魚(yú)類(lèi)性腺中的DNA甲基化水平,進(jìn)而調(diào)控一些性別分化相關(guān)基因的表達(dá),從而影響性別分化的過(guò)程,這說(shuō)明DNA甲基化可能與魚(yú)類(lèi)的性別分化存在密切的關(guān)系[15]。歐洲舌齒鱸具有XX/XY性別決定系統(tǒng),Pavlidis等[13]研究發(fā)現(xiàn),在歐洲舌齒鱸性別分化之前,溫度能影響其性別分化,當(dāng)水溫較高(20 ℃)時(shí),幼魚(yú)性腺大部分發(fā)育為精巢,而水溫較低(13 ℃)時(shí),幼魚(yú)性腺大部分發(fā)育為卵巢。雌激素是通過(guò)細(xì)胞色素P450芳香化酶將雄激素進(jìn)行轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的,該酶主要由細(xì)胞色素P450第19家族-A亞家族-多肽1a(cyp19a1a)編碼[23-24]。在分子性別分化關(guān)鍵期的雌魚(yú)性腺中,芳香化酶和內(nèi)源性雌激素特異表達(dá)和合成,誘導(dǎo)卵巢分化[25-26]。研究還發(fā)現(xiàn),雌魚(yú)體內(nèi)雌激素水平下降能夠誘導(dǎo)雌魚(yú)的雄性化,而雄魚(yú)體內(nèi)雌激素水平上升能夠誘導(dǎo)其雌性化[27-33]。Navarro-Martín等[34]對(duì)歐洲舌齒鱸幼魚(yú)研究發(fā)現(xiàn),在性腺形成前溫度對(duì)性別分化影響最大,雄性性腺中cyp19a1a啟動(dòng)子的DNA甲基化水平是雌性性腺中的兩倍,并且較高溫(21 ℃)會(huì)誘導(dǎo)雌性幼魚(yú)cyp19a1a啟動(dòng)子甲基化水平升高,誘導(dǎo)的cyp19a1a啟動(dòng)子高甲基化可能阻止了cyp19a1a的轉(zhuǎn)錄激活,從而減少了芳香化酶表達(dá)水平及雌激素的產(chǎn)生,最后誘導(dǎo)未分化的幼魚(yú)向雄性分化,說(shuō)明溫度可能會(huì)通過(guò)DNA甲基化影響歐洲舌齒鱸性腺中性別分化相關(guān)基因調(diào)控進(jìn)而調(diào)控其性別分化[35]。

半滑舌鰨具有ZW/ZZ性別決定系統(tǒng),其中Z連鎖doublesex和mab-3相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(dmrt1)基因的雄性特異性表達(dá)與其精巢分化相關(guān)[36]。Cui等[37]使用TALEN技術(shù)敲降半滑舌鰨幼魚(yú)性腺中的dmrt1基因,結(jié)果表明,基因型為雄性的幼魚(yú)在1齡時(shí)性腺發(fā)育成卵巢,說(shuō)明dmrt1基因在半滑舌鰨的性別分化過(guò)程中起著十分重要的作用。在常溫條件下(22 ℃),約14%的ZW半滑舌鰨遺傳雌性被逆轉(zhuǎn)為表型雄性(偽雄性),在性別發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期將半滑舌鰨幼魚(yú)暴露在更高的溫度(28 ℃)下會(huì)使性逆轉(zhuǎn)率增加至73%[38]。Shao等[39]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),半滑舌鰨在約22 ℃進(jìn)行養(yǎng)殖,性逆轉(zhuǎn)的偽雄魚(yú)具有繁殖能力,其后代ZW-F1的逆轉(zhuǎn)率(94%)極高,這表明性逆轉(zhuǎn)的能力是可遺傳的;同時(shí)對(duì)半滑舌鰨使用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序進(jìn)行性腺中整個(gè)基因組的DNA甲基化模式分析,結(jié)果顯示,雄魚(yú)和偽雄魚(yú)性腺中dmrt1的甲基化水平均較低,而在雌性中為高水平甲基化,表明雄魚(yú)和偽雄魚(yú)不僅在性腺組織學(xué)上結(jié)構(gòu)相同,而且dmrt1基因的DNA甲基化水平也是相同的。

Wen等[40]檢測(cè)了牙鲆成魚(yú)中cyp19a1a和dmrt1基因的表達(dá)部位、表達(dá)水平和甲基化模式,結(jié)果表明,dmrt1基因在精巢中的表達(dá)量是卵巢中的約70倍,而cyp19a1a基因在卵巢中的表達(dá)量是精巢中的約40倍。Dmrt1啟動(dòng)子CpGs在精巢中未發(fā)生甲基化,但在卵巢中甲基化接近60%;相反,精巢中的cyp19a1a啟動(dòng)子甲基化接近100%,而卵巢中的cyp19a1a啟動(dòng)子甲基化則約為75%。Si等[41]發(fā)現(xiàn),在牙鲆卵巢分化過(guò)程中,cyp19a1a與其轉(zhuǎn)錄激活因子foxl2甲基化和基因表達(dá)水平密切相關(guān),這兩個(gè)基因表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。這些研究結(jié)果表明,dmrt1、cyp19a1a和foxl2基因的甲基化水平對(duì)牙鲆的性別分化具有重要作用。Zhou等[42]研究了低溫誘導(dǎo)紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)雄性化過(guò)程中性腺DNA甲基化水平的變化規(guī)律,對(duì)雄性、雌性和低溫處理產(chǎn)生偽雄性的紅鰭東方鲀性腺進(jìn)行了全基因組甲基化測(cè)序和分析,結(jié)果顯示雄性、雌性和偽雄性性腺基因組中胞嘧啶(C)殘基的甲基化水平分別為11.016%、10.428%和11.083%。經(jīng)BSP克隆測(cè)序法驗(yàn)證,amhr2基因在正常雄性和偽雄性中呈低甲基化水平,在正常雌性中呈高甲基化水平,而cyp19a基因在正常雌性呈低甲基化水平,在雄性和偽雄性中呈高甲基化水平。

在雌雄同體魚(yú)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象,黃鱔(Monopterusalbus)從胚胎期到初次性成熟,其性腺都是卵巢,能產(chǎn)生成熟的卵子,但首次產(chǎn)卵后的卵巢逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚g性性腺,然后轉(zhuǎn)化成精巢,開(kāi)始產(chǎn)生精子。研究發(fā)現(xiàn),在其間性性腺中,cyp19a1a啟動(dòng)子的甲基化水平高于其在卵巢中的水平,且在雌性→間性→雄性性腺轉(zhuǎn)變過(guò)程中,性腺中cyp19a1a啟動(dòng)子的甲基化水平也在不斷升高[43]。用dnmt抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-dc)處理可以逆轉(zhuǎn)黃鱔的自然性別變化,表明DNA甲基化可能抑制黃鱔性腺中cyp19a1a基因的表達(dá),進(jìn)而控制黃鱔的性逆轉(zhuǎn)。黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)在幼魚(yú)期全部發(fā)育為雄性,在2齡后有一半的魚(yú)會(huì)性逆轉(zhuǎn)為雌性,在發(fā)生性逆轉(zhuǎn)時(shí),精巢中的cyp19a1a啟動(dòng)子的甲基化水平下降,cyp19a1a基因的表達(dá)水平上升[44]。對(duì)黑鯛幼魚(yú)使用外源雌激素(E2)處理2齡下的雄性幼魚(yú),會(huì)誘導(dǎo)雄性幼魚(yú)提前進(jìn)行性逆轉(zhuǎn),停止使用E2后雌性幼魚(yú)又變回雄性,但是處理過(guò)程中性腺cyp19a1a啟動(dòng)子的甲基化水平?jīng)]有下降,cyp19a1a基因的表達(dá)水平和內(nèi)源性雌激素水平也沒(méi)有上升[44]。將2齡黑鯛精巢切除后1個(gè)月,發(fā)現(xiàn)性腺中cyp19a1a啟動(dòng)子的甲基化水平明顯降低,而且其性別也發(fā)生了改變,說(shuō)明某些來(lái)源于精巢的因素可能影響cyp19a1a啟動(dòng)子的甲基化水平。這些結(jié)果表明,cyp19a1a基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控也可能在雌雄同體魚(yú)的自然性別變化及性逆轉(zhuǎn)中起著重要作用[45]。因此可以發(fā)現(xiàn),DNA甲基化既參與雌雄異體魚(yú)的性別分化和性別逆轉(zhuǎn),也參與雌雄同體魚(yú)的性別分化和性別逆轉(zhuǎn),DNA甲基化作為一種相對(duì)穩(wěn)定的表觀遺傳修飾,可能動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)基因表達(dá),進(jìn)而調(diào)控魚(yú)類(lèi)性別分化。

2 非編碼RNA在魚(yú)類(lèi)性別決定和分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制

非編碼RNA(ncRNA),包括miRNA、siRNA、piRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、circRNA等,是一類(lèi)被轉(zhuǎn)錄但未被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子,與一些最復(fù)雜的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象有關(guān)。

2.1 小分子RNA

非編碼RNA中研究最廣泛的是小分子RNA(miRNA),它是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度18～24個(gè)堿基的非編碼單鏈RNA分子,廣泛存在于真核生物當(dāng)中,并且在物種間高度保守[46]。成熟的miRNA通過(guò)結(jié)合到mRNA上3′非翻譯區(qū)(3′ UTR)或者蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)的靶位點(diǎn)序列從而抑制其表達(dá),影響生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程[47]。

自1993年Lee等[48-49]第一次從線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)miRNA以來(lái),已經(jīng)在超過(guò)250個(gè)其他物種中發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在,迄今為止,在人類(lèi)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)2500個(gè)miRNA。miRNA已被證明在脊椎動(dòng)物的性別分化、配子發(fā)生和有性繁殖中發(fā)揮重要作用。在小鼠性別決定的關(guān)鍵時(shí)刻,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-124能夠阻止sox9在卵巢細(xì)胞中的表達(dá),這是第一個(gè)證據(jù)表明miRNA參與了性別決定和性腺發(fā)育的過(guò)程[50]。在雞中,雄性高表達(dá)的miR-107通過(guò)直接靶向cyp19a1a基因的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)雌激素信號(hào)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[51]。Peng等[52]通過(guò)對(duì)橘小實(shí)蠅胚胎性別決定關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行小RNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析篩選,獲得了靶向橘小實(shí)蠅tra(Bdtra)基因的miRNA-1-3p,通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)證明,miR-1-3p能直接作用于Bdtra,抑制其表達(dá)。隨后通過(guò)胚胎注射miR-1-3p類(lèi)似物和抑制劑、RNAi、CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)等方法進(jìn)一步證實(shí),miR-1-3p通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制Bdtra基因的表達(dá),促進(jìn)啟動(dòng)下游Bddsx基因的雄性選擇性剪切,促進(jìn)雄性性別分化,在橘小實(shí)蠅的雌雄分化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。該研究首次揭示了miR-1-3p參與調(diào)控橘小實(shí)蠅性別決定的機(jī)制。這些結(jié)果為性別決定機(jī)制研究提供重要依據(jù)和新見(jiàn)解,對(duì)闡述生物性別分化具有重要的科學(xué)意義。

Let-7是首個(gè)在硬骨魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的miRNA,其在多種動(dòng)物中均有表達(dá),具有高度的保守性[53],李文笙等[54]已綜述過(guò)近年來(lái)一些魚(yú)類(lèi)雌雄性腺中差異表達(dá)的miRNA,但是對(duì)于硬骨魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō),幼魚(yú)的性腺較小,分離較困難,目前的研究也主要集中在成魚(yú)階段(即分化后的卵巢和精巢,表1)。Bizuayehu等[55]在大西洋庸鰈(Hippoglossushorglossus)的精巢和卵巢中篩選并鑒定了大量性別差異表達(dá)的miRNA,他們發(fā)現(xiàn)let-7a、miR143、miR-145和miR-202-3p在成魚(yú)精巢中的表達(dá)高于卵巢,miR-202-5p在雄性幼魚(yú)性腺中的表達(dá)顯著高于雌性幼魚(yú)。Lau等[56]對(duì)青鳉(Oryziaslaitpes)的研究發(fā)現(xiàn),miR-202-5p、miR-21、miR-26b在卵巢和精巢中豐度較高,miR-27a、miR-1692、miR143、miR-216b在卵巢中高表達(dá),miR-2184和miR-2476在精巢中高表達(dá)。Xiao等[57]對(duì)發(fā)育過(guò)程中(受精后30 d)的尼羅羅非魚(yú)卵巢和精巢進(jìn)行了測(cè)序,發(fā)現(xiàn)miR-29、miR-129-3p和miR-727-3p在卵巢中顯著高表達(dá),而miR-143、miR-33a和miR-135b在精巢中高表達(dá),其中miR-143的高表達(dá)和哺乳動(dòng)物類(lèi)似,都與精巢的成熟有關(guān)。Wang等[58]報(bào)道,miR-101a和miR-155-p在黃河鯉的卵巢中高表達(dá),而miR-203和miR-203b-3p在卵巢發(fā)育階段表達(dá)逐漸降低,表明miR-101a和miR-155-p可能在雌性性腺生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要作用,而miR-203和miR-203b-3p在卵巢發(fā)育早期起作用。

Tao等[59]在尼羅羅非魚(yú)性別分化關(guān)鍵期(孵化后5 d)性腺中鑒定出635個(gè)成熟miRNAs,其中,XX和XY性腺中顯著高表達(dá)的miRNAs分別為62和49個(gè),對(duì)這些性別差異表達(dá)的miRNAs(如miR-9、miR-21、miR-30a、miR-96、miR-200b、miR-212和miR-7977)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,其靶基因包括編碼類(lèi)固醇合成途徑關(guān)鍵酶的基因(cyp11a1、hsd3b、cyp19a1a、Hsd11b)和參與脊椎動(dòng)物性別分化的關(guān)鍵分子(foxl2、amh、star1、sf1、dmrt1),其中cyp19a1a、foxl2和dmrt1已被證實(shí)參與尼羅羅非魚(yú)的雌性或雄性性別分化,說(shuō)明miRNA可能通過(guò)靶向這些性別分化相關(guān)基因進(jìn)而調(diào)控魚(yú)類(lèi)性別。筆者還發(fā)現(xiàn)一些miRNA(例如miR-96和miR-737)同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)參與類(lèi)固醇合成的基因,表明在尼羅羅非魚(yú)的性別分化早期可能存在一個(gè)復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Wang等[60-61]以受精后67 d的尼羅羅非魚(yú)為研究對(duì)象進(jìn)行miRNA鑒定,發(fā)現(xiàn)miR-17-5p和miR-20a在卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢,對(duì)它們的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn),其靶基因?yàn)閐mrt1,qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,dmrt1基因精巢中的表達(dá)量顯著低于卵巢,因此,其認(rèn)為miR-17-5p和miR-20a可能通過(guò)抑制dmrt1基因的表達(dá)和促進(jìn)cyp19a1a基因的表達(dá)從而在雌激素生成中發(fā)揮作用,其還發(fā)現(xiàn)miR-138、miR-200a和miR-338可能負(fù)調(diào)控cyp17a2基因的表達(dá),而該基因在細(xì)胞增殖和精子發(fā)生中起到重要作用。綜上所述,在尼羅羅非魚(yú)性腺不同發(fā)育階段高表達(dá)的miRNA具有差異性,而這些差異表達(dá)的miRNA靶向性別分化相關(guān)基因,表明在魚(yú)類(lèi)性別分化關(guān)鍵期miRNA確實(shí)發(fā)揮重要作用。Yu等[62]預(yù)測(cè)了點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)中miR-26a-5p的靶基因,并通過(guò)體內(nèi)外研究驗(yàn)證其靶向cyp19a1a并抑制其表達(dá),他們同時(shí)對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)使用雌激素E2處理,結(jié)果顯示,處理后雄魚(yú)會(huì)發(fā)生向雌性逆轉(zhuǎn),進(jìn)行qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雌激素E2處理抑制了miR-26a-5p的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)cyp19a1a基因的表達(dá),說(shuō)明miR-26a-5p參與了點(diǎn)帶石斑魚(yú)的性別逆轉(zhuǎn)。Yan等[63]發(fā)現(xiàn)在紅鰭東方鲀性腺未分化幼魚(yú)中鑒定出8個(gè)差異表達(dá)的miRNA,其中miRNA-novel_167靶向dmrt1基因,fru-miR-15b靶向foxl2基因。近年來(lái)關(guān)于miRNA在硬骨魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育中的研究還集中在篩選和鑒定性腺發(fā)育相關(guān)的miRNA,雖然某些性別分化相關(guān)靶基因已被確定,但對(duì)其功能研究相對(duì)較少,應(yīng)更多地進(jìn)行魚(yú)類(lèi)性腺中miRNA的功能研究,以便更早了解并闡明miRNA在魚(yú)類(lèi)性別分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。

2.2 長(zhǎng)鏈非編碼RNA

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)長(zhǎng)度為200～10 000 nt,是一類(lèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成的副產(chǎn)物,最開(kāi)始lncRNA被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能,只是基因轉(zhuǎn)錄時(shí)生成的無(wú)作用的產(chǎn)物,直到Brown等[76]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA Xist參與哺乳動(dòng)物X染色體失活的調(diào)控,開(kāi)啟了人們對(duì)lncRNA的研究歷程。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,人們對(duì)分子生物學(xué)的研究也越來(lái)越深入,大量的lncRNA被發(fā)現(xiàn)和挖掘[77-78]。在哺乳動(dòng)物中,lncRNA已經(jīng)被證明在性別分化中起著重要作用[79-81],Zhang等[82]對(duì)孵化后30 d的中華鱉(Pelodiscussinensis)進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄分析,篩選出大量與性別相關(guān)的lncRNA。其中,從卵巢中獲得932個(gè)高表達(dá)的lncRNA,從精巢中獲得449個(gè)高表達(dá)的lncRNA,多數(shù)參與了性腺分化過(guò)程。

在魚(yú)類(lèi)中l(wèi)ncRNA的研究停留在篩選及鑒定上,如:彭錕等[83]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了尼羅羅非魚(yú)雌、雄性腺中呈現(xiàn)差異表達(dá)的lncRNA,并發(fā)現(xiàn)lncRNA TCONS_02477925在羅非魚(yú)卵母細(xì)胞發(fā)育和性別分化中可能有重要作用;Yan等[63]對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)性別分化關(guān)鍵時(shí)期的性腺lncRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)與雌性性腺相比,雄性性腺中79個(gè)lncRNA上調(diào),51個(gè)下調(diào);Cai[84]使用米非司酮(RU486)誘導(dǎo)XX尼羅羅非魚(yú)的性逆轉(zhuǎn),并利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)性別偏向的性腺lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行了比較研究,發(fā)現(xiàn)了大量與性別分化相關(guān)的lncRNA,qPCR和原位雜交試驗(yàn)表明,在RU486處理過(guò)程中表現(xiàn)出較大差異的lncRNA在早期性別分化過(guò)程中表現(xiàn)出明顯性別二態(tài)性。這些發(fā)現(xiàn)為深入研究lncRNA在性別分化中的作用提供了理論基礎(chǔ),lncRNA的表達(dá)變化可能是通過(guò)表觀遺傳修飾導(dǎo)致性逆轉(zhuǎn)的部分原因[80]。而lncRNA是如何發(fā)揮作用和調(diào)控基因表達(dá)的,還需進(jìn)一步研究。

2.3 環(huán)狀RNA

環(huán)狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA分子,與傳統(tǒng)的線性RNA(含5′和3′末端)不同,circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu),長(zhǎng)度為幾百至幾千個(gè)核苷酸,不受RNA外切酶影響,表達(dá)更穩(wěn)定,不易降解。circRNA由特殊的前體mRNA可變剪接產(chǎn)生,剪接形式具有多樣性,其形成方式可歸結(jié)為兩大類(lèi):外顯子環(huán)化和內(nèi)含子環(huán)化。circRNA有miRNA海綿的作用,其具有miRNA作用位點(diǎn),可以競(jìng)爭(zhēng)性地與miRNA結(jié)合,從而間接調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)。Shen等[85]已在斑馬魚(yú)中檢測(cè)出了3000余種circRNA,但是circRNA是否參與到魚(yú)類(lèi)性別決定和分化當(dāng)中還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,非編碼RNA確實(shí)影響魚(yú)類(lèi)的性別分化,這些結(jié)果為進(jìn)一步研究非編碼RNA對(duì)魚(yú)類(lèi)性別分化影響提供參考。但是目前對(duì)非編碼RNA的研究不深,大多停留在篩選及鑒定層面,對(duì)于非編碼RNA的功能研究還有待進(jìn)一步開(kāi)展。

3 組蛋白修飾

在真核生物中,核小體是組成染色質(zhì)的重要成分,由DNA包裹的組蛋白八聚體[兩分子的二聚體(H2A-H2B二聚體)和兩分子的H3、H4]組成[86]。常見(jiàn)的組蛋白修飾類(lèi)型有組蛋白甲基化/去甲基化、泛素化/去泛素化、乙酰化/去乙?；土姿峄＿@些修飾是由一系列酶完成的,包括組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)、乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)、磷酸激酶和泛素化酶。這些翻譯后修飾在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、染色質(zhì)動(dòng)態(tài)、DNA修復(fù)和基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用[87]。

雖然組蛋白修飾在哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物等相關(guān)研究較多,但目前尚不清楚其是否參與了魚(yú)類(lèi)性別決定和分化過(guò)程及其機(jī)制,僅在近幾年中少數(shù)魚(yú)類(lèi)中有報(bào)道。高溫處理歐洲舌齒鱸幼魚(yú)后,在幼魚(yú)雌性性腺中上調(diào)了幾種表觀遺傳調(diào)控因子,其中包括:1種作為轉(zhuǎn)錄抑制物的DNA結(jié)合蛋白jarid2a和1種環(huán)指基序pcgf2,它形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以維持轉(zhuǎn)錄抑制;也包括1種與組蛋白修飾相關(guān)的酶hdac11[88]。Lai等[89]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析了黃鱔性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的組蛋白修飾,結(jié)果顯示,K120處的H2B單泛素化是在精巢當(dāng)中富集的組蛋白修飾位點(diǎn),它與精子發(fā)生相關(guān),并且在雄性性別決定基因dmrt1修飾中存在大量的修飾位點(diǎn),特別是在其外顯子區(qū)域,表明這種修飾可能在精巢dmrt1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)為魚(yú)類(lèi)性別分化的表觀遺傳學(xué)研究提供了新的資源。

4 展望與挑戰(zhàn)

魚(yú)類(lèi)性別決定和分化是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,魚(yú)類(lèi)的性別具有較高的可塑性,除了受到遺傳因素影響,還會(huì)受到溫度、光照、pH等環(huán)境因素影響。外界環(huán)境因素會(huì)誘導(dǎo)表觀遺傳修飾的改變進(jìn)而調(diào)控性別分化的過(guò)程。因此研究硬骨魚(yú)性別決定和分化過(guò)程中的表觀遺傳機(jī)制是非常重要的,不僅能夠深入解析魚(yú)類(lèi)性別分化過(guò)程對(duì)環(huán)境的應(yīng)答過(guò)程,更能使我們?nèi)媪私怍~(yú)類(lèi)性別決定與分化的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而,相關(guān)的研究?jī)H在一些主要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)和模式動(dòng)物中開(kāi)展,未來(lái)還需要在其他更多魚(yú)類(lèi)中開(kāi)展相關(guān)研究。同時(shí),相關(guān)研究還有待深入,如:表觀遺傳信息在世代之間傳遞的規(guī)律如何?已經(jīng)篩選的性別差異表達(dá)的非編碼RNA具體功能如何?尚需借助各種分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行深入研究。最重要的是,如何對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)和新興的表觀遺傳學(xué)理論知識(shí)進(jìn)行整合分析,全面揭示魚(yú)類(lèi)性別形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并基于此實(shí)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)的性別調(diào)控育種,是今后水產(chǎn)科技工作者面臨的巨大挑戰(zhàn)。