孟文蓉,米浩宇,黃怡忱,黃志發(fā),劉琪彤,夏夢婕,房耀維

( 1.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇 連云港 222005; 2.江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 連云港 222005 )

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)是包括我國在內(nèi)的亞洲國家的重要淡水養(yǎng)殖品種,其味道鮮美、營養(yǎng)豐富,素有“水中人參”的美譽。近年來,隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷推進,使用抗生素導(dǎo)致藥物殘留等食品安全問題日益突出,嚴重影響了產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。目前,禁止抗生素作為動物飼料添加劑應(yīng)用已逐步成為世界各國的共識,因此尋找及研發(fā)安全、無毒、無副作用的抗生素替代品成為泥鰍養(yǎng)殖的必然選擇[1]。在若干替代品中,益生菌因其無毒、無抗藥性、無殘留等優(yōu)點引發(fā)廣泛關(guān)注。

筆者通過在泥鰍飼料中添加不同水平的貝萊斯芽孢桿菌MSP05,研究其對泥鰍生長性能、腸道消化酶活性及形態(tài)、抗氧化能力和非特異性免疫的影響,以期為泥鰍規(guī)?；B(yǎng)殖的病害防御和促進生長提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與條件

試驗用貝萊斯芽孢桿菌MSP05、攻毒用嗜水氣單胞菌為本實驗室從土壤、泥鰍病體中分離所得。泥鰍購自江蘇連云港贛榆養(yǎng)殖技術(shù)服務(wù)中心,室內(nèi)暫養(yǎng)并禁食24 h后選取初始平均體質(zhì)量為(3.24±0.14) g 的泥鰍共360尾。

參照Thurlow等[10]的方法,將保存的貝萊斯芽孢桿菌MSP05活化培養(yǎng),用無菌生理鹽水調(diào)整至密度為5×109cfu/mL的濃縮制劑。按照0、1×106、1×107和1×108cfu/g的劑量設(shè)計,將菌劑用無菌生理鹽水按比例稀釋后,等量噴灑至基礎(chǔ)飼料中,并用3%魚油均勻包裹,充分攪拌后自然陰干,4種飼料分裝,4 ℃保存?zhèn)溆?。嗜水氣單胞菌?jīng)TSB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后,用無菌生理鹽水稀釋至2.0×107cfu/mL。

1.2 試驗設(shè)計與管理

360尾泥鰍隨機分配到12個聚氯乙烯魚缸中,設(shè)置1個對照組和3個試驗組,每組3個平行,每個平行30尾。對照組飼喂僅添加無菌生理鹽水和魚油的飼料,試驗組分別飼喂含1×106、1×107、1×108cfu/g貝萊斯芽孢桿菌MSP05的日糧。試驗期間水溫(26±1) ℃,pH 6.9～7.3,溶解氧質(zhì)量濃度(6.4±0.4) mg/L,氨氮質(zhì)量濃度<0.06 mg/L,亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度<0.02 mg/L。日換水30%,日投喂2次(7:00、18:00),投喂量約為其體質(zhì)量的3%,并根據(jù)各水族箱實際情況適量調(diào)整,養(yǎng)殖周期為8周。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 樣品采集與保存

養(yǎng)殖試驗結(jié)束并禁食24 h后,統(tǒng)計各魚缸內(nèi)泥鰍總數(shù)并稱量質(zhì)量。每組隨機選取15尾泥鰍(每個平行5尾),間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉后,取9尾于尾靜脈處采血,每個平行的3尾血樣混合后,離心分離血清,-80 ℃冰箱保存,用于血清抗氧化、免疫指標測定;采血后冰上無菌解剖取腸道組織,剔除表面脂肪后裝入無酶離心管中,用液氮迅速冷凍后置于-80 ℃保存,用于腸道消化酶測定;剩余每組6尾魚,冰上解剖并剪取前腸、中腸、后腸,磷酸鹽緩沖液清洗干凈后固定,每個平行樣品混合保存,用于組織學(xué)研究。

1.3.2 生長性能測定

成活率(RS,%)、質(zhì)量增加率(wWGR,%)和特定生長率(RSG,%/d)按下式計算:

RS=nt/no×100%

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中,nt為終末數(shù)量(尾),n0為初始數(shù)量(尾),mt為終末體質(zhì)量(g),m0為初始體質(zhì)量(g),t為試驗時間(d)。

1.3.3 消化酶測定

將液氮冷凍保存的腸道樣品取出,冰浴勻漿后離心,取上清液用南京建成生物工程研究所試劑盒測定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。

1.3.4 腸道形態(tài)測定

取出固定后,將腸組織乙醇梯度脫水、二甲苯脫醇、浸蠟包埋、切片、烘干和染色。每組前腸、中腸、后腸分別做3個以上切片,選取絨毛完整走向平直的切片6張,100倍視野觀測拍照,使用ProPlus 6.0處理圖像,分別測量絨毛高度、絨毛寬度、肌層厚度、腸壁厚度。

1.3.5 抗氧化及非特異性免疫指標測定

血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶、溶菌酶活性和丙二醛含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定。

1.3.6 感染試驗

剩余的泥鰍中每組挑選30尾(每個平行10尾)繼續(xù)飼喂。穩(wěn)定5 d后,根據(jù)攻毒前經(jīng)預(yù)試驗確定的半致死量,腹腔注射2.0×107cfu/mL嗜水氣單胞菌0.1 mL,對照組泥鰍腹腔注射等量無菌生理鹽水。周期為15 d,觀察并記錄泥鰍的發(fā)病和死亡情況。累積死亡率(RCM,%)按下式計算:

RCM=nm/nc×100%

式中,nm為死亡數(shù)量(尾),nc為攻毒數(shù)量(尾)。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示,對同一時間點不同試驗組的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,應(yīng)用鄧肯多重比較檢驗各組數(shù)據(jù)之間的差異性。通過軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚生長的影響

與對照組相比,試驗組貝萊斯芽孢桿菌MSP05顯著提高了泥鰍幼魚的終末體質(zhì)量、質(zhì)量增加率和特定生長率(P<0.05),且不同試驗組間差異不顯著(P>0.05);1×108cfu/g添加組泥鰍幼魚成活率顯著高于對照組(P<0.05),其他各組間差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚生長的影響Tab.1 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on growth of juvenile loach M. anguillicaudatus

2.2 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚消化酶活性的影響

各組泥鰍幼魚腸道消化酶活性測定結(jié)果見表2。試驗組泥鰍幼魚腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均顯著高于對照組(P<0.05);隨著貝萊斯芽孢桿菌MSP05添加量的增加,蛋白酶、淀粉酶活性先升后降,在1×107cfu/g添加組達到最大值,脂肪酶活性則不斷升高,且各組間差異顯著(P<0.05)。

表2 飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚消化酶活性的影響Tab.2 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on digestive enzyme activities of juvenile loach M. anguillicaudatus

2.3 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚腸道形態(tài)的影響

貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚腸道形態(tài)的影響見圖1、圖2。試驗結(jié)果顯示:與對照組相比,除中腸絨毛寬度外,貝萊斯芽孢桿菌MSP05顯著提升了泥鰍前腸、中腸各形態(tài)指標(P<0.05),且1×106cfu/g添加組指標提升效果最顯著;貝萊斯芽孢桿菌MSP05對后腸影響則差異較大,相較于對照組,1×106cfu/g添加組4個形態(tài)指標均有所降低,1×108cfu/g添加組肌層厚度也表現(xiàn)出抑制效果,相對而言,1×107cfu/g添加組后腸形態(tài)提升最顯著。

圖1 飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚腸道形態(tài)的影響Fig.1 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on intestinal morphology of juvenile loach M. anguillicaudatus

圖2 飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚腸道形態(tài)數(shù)據(jù)的影響Fig.2 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on intestinal morphology data of juvenile loach M. anguillicaudatusVH.絨毛高度;VW.絨毛寬度;TM.肌層厚度;TW.腸壁厚度;條形圖展示的為平均值±標準差(n=3),字母“a,b,c,d”表示鄧肯算法的子集,相同字母或未標記字母表示差異不顯著(P>0.05),不同字母表示差異顯著(P<0.05).VH.villus heigh; VW.villus width; TM.thicknesses of musculature; TW.thickness of intestinal wall; bars show the mean±SD(n=3); the letters “a, b, c, d” are subsets by Duncan algorithm; treatments with the same letters or absence of letters are not significantly difference (P>0.05), and different letters indicate significant difference(P<0.05).

2.4 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚血清抗氧化指標和非特異性免疫的影響

貝萊斯芽孢桿菌MSP05顯著影響了泥鰍幼魚各血清抗氧化及非特異性免疫指標(P<0.05)(表3)。隨著菌劑添加量的增加,泥鰍幼魚血清過氧化氫酶活性不斷升高,丙二醛含量不斷下降,二者在1×108cfu/g添加組分別達到最高值、最低值;超氧化物歧化酶活性先升后降,在1×107cfu/g添加組達到最大值;此外,泥鰍幼魚血清溶菌酶、堿性磷酸酶活性也不斷增加,在1×108cfu/g添加組分別達到最大值,較對照組分別顯著提升了180.56%、35.91%。

表3 飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚血清抗氧化和非特異性免疫指標的影響Tab.3 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on serological antioxidant enzyme activities and non-specific immune index of juvenile loach M. anguillicaudatus

2.5 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚抗病力的影響

飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌MSP05顯著降低了嗜水氣單胞菌攻毒15 d后泥鰍幼魚的死亡率(P<0.05),在1×108cfu/g添加組累積死亡率最低(圖3)。在瀕死或死魚中觀察到典型的氣單胞菌感染癥狀,主要表現(xiàn)為出血性敗血癥。

圖3 飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌MSP05對嗜水氣單胞菌攻毒后泥鰍幼魚死亡率的影響Fig.3 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on cumulative mortality rate of juvenile loach M. anguillicaudatus challenged with A. hydrophila

3 討 論

3.1 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚生長性能的影響

3.2 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚消化酶的影響

水產(chǎn)動物消化酶活性與飼料利用率和養(yǎng)殖效益密切相關(guān),而在飼料中添加適量的益生菌可以提高水產(chǎn)動物消化酶活性,進而提升飼料利用率和養(yǎng)殖成效。109cfu/kg枯草芽孢桿菌(B.subtilis)使彭澤鯽(C.auratusvar.pengsenensis)中腸內(nèi)淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活性顯著增加[15];經(jīng)過不同處理的短小芽孢桿菌(B.pumilus)使得斜帶石斑魚(E.coioides)肝臟淀粉酶和脂肪酶活性顯著增高[16]。貝萊斯芽孢桿菌MSP05顯著提升了泥鰍幼魚腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性,且隨著菌體添加量的增加,蛋白酶、淀粉酶活性先升后降,這與珍珠龍膽石斑魚研究結(jié)果一致[17]。貝萊斯芽孢桿菌可能通過自身產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶[14,18-19],并刺激魚體腸道產(chǎn)生多種高活性消化酶,綜合促進宿主對不同營養(yǎng)源的吸收利用。

3.3 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚腸道形態(tài)的影響

除消化酶外,腸道形態(tài)發(fā)育對魚類生長也起到至關(guān)重要的作用。絨毛高度、絨毛寬度、肌層厚度和腸壁厚度等的增加,均能增加腸黏膜的功能性表面積,提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收率,促進魚類生長。研究表明,芽孢桿菌能有效改善魚類腸道形態(tài)。以尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)為例,Won等[20]研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌WB60顯著提升了幼魚腸絨毛高度和肌層厚度;短小芽孢桿菌也顯著提升了中腸肌層厚度和皺襞高度[21];而解淀粉芽孢桿菌使魚體腸道整體黏膜厚度顯著提高,中腸、后腸絨毛高度也顯著增加[22]。本試驗中,貝萊斯芽孢桿菌MSP05顯著改善了泥鰍前腸、中腸的形態(tài),而較低或較高的菌體添加量卻不同程度抑制了后腸形態(tài)發(fā)育,這可能與泥鰍后腸消化功能弱化、主要用于輔助呼吸有關(guān)[23]。

3.4 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚抗氧化性能的影響

動物細胞在正常生理條件下會產(chǎn)生活性氧,若活性氧產(chǎn)生和去除之間不平衡會導(dǎo)致氧化應(yīng)激[24],因此機體往往采取多種抗氧化防御機制以減少機體損傷。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和丙二醛是重要的抗氧化指標。益生芽孢桿菌能夠作為抗原刺激魚體分泌抗氧化酶和抗氧化劑,有效清除多余自由基,阻止脂質(zhì)過氧化,調(diào)節(jié)機體的自由徑向平衡,從而提高抗氧化能力[25-26];若益生菌添加量過大,可能導(dǎo)致超氧化物歧化酶較過氧化氫酶活性先行降低,在凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)[27]、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)[28]的相關(guān)研究中及本試驗中均出現(xiàn)了此現(xiàn)象。

3.5 貝萊斯芽孢桿菌MSP05對泥鰍幼魚非特異性免疫性能的影響

由于溫度限制,大多數(shù)魚類特異性免疫系統(tǒng)不夠完善,主要依靠非特異性免疫以抵御外源微生物的入侵。溶菌酶和堿性磷酸酶活性可作為評估魚類非特異性免疫的重要指標。添加貝萊斯芽孢桿菌JW后,鯽堿性磷酸酶活性顯著提高,經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后存活率也顯著提高[13];貝萊斯芽孢桿菌K2可顯著上調(diào)珍珠龍膽石斑魚幼魚溶菌酶基因的表達,哈維氏弧菌攻毒28 d后其存活率也顯著提高[9];浸浴貝萊斯芽孢桿菌DY-6后仿刺參的2種酶活性均顯著提高[12]。本試驗中,貝萊斯芽孢桿菌MSP05使泥鰍幼魚血清溶菌酶、堿性磷酸酶活性顯著提高,且酶活性與菌體添加量正相關(guān);嗜水氣單胞菌攻毒后死亡率也有所降低,說明飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌可提高機體免疫力和抗嗜水氣單胞菌致病力。

4 結(jié) 論

飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌MSP05能夠有效促進泥鰍幼魚生長,提高消化酶、抗氧化酶活性,改善腸道形態(tài),提升非特異性免疫及對嗜水氣單胞菌的抗病力,且添加量為1×108cfu/g時,泥鰍幼魚生長、非特異性免疫和對嗜水氣單胞菌抗病力最佳。因此,貝萊斯芽孢桿菌MSP05有應(yīng)用于泥鰍飼料的潛力。