邢秀梅,沈銘浩,李 杰,寧先會,張 凱, 尹紹武

( 1.南京師范大學 海洋科學與工程學院,江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術工程研究中心,江蘇 南京 210023; 2.南京市高淳區(qū)青松水產(chǎn)專業(yè)合作社,江蘇 南京 211300 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis),屬節(jié)肢動物門甲殼綱十足目方蟹科絨螯蟹屬,又名河蟹、大閘蟹[1]。中華絨螯蟹因含有礦物質元素、脂肪酸、氨基酸、核苷酸和膽固醇等多類營養(yǎng)物質而深受長江流域居民喜愛,其肌肉中蛋白質品質高且肌苷酸的含量豐富,雄蟹性腺中更是包含25種脂肪酸[2]。近年來,我國中華絨螯蟹的種業(yè)保護措施較薄弱,加上無序引種和苗種盲目放流,導致種質混雜和退化,嚴重制約了該產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展[3-4]。國外水產(chǎn)選育多以種業(yè)企業(yè)為主體,投入大、效果顯著;國內則以科研單位為主,這樣會造成產(chǎn)業(yè)集中度低、良種化水平和覆蓋率均較低、苗種質量不穩(wěn)定等一系列問題[5]。因此,對種業(yè)的投入和育種技術的突破刻不容緩。

2021年中央一號文件指出,“打好種業(yè)翻身仗。農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化,種子是基礎……加強國家作物、畜禽和海洋漁業(yè)生物種質資源庫建設……有序推進生物育種產(chǎn)業(yè)化應用”[6]。目前已成功選育出中華絨螯蟹“長江1號”(GS-01-003-2011)、“光合1號”(GS-01-004-2011)、“長江2號”(GS-01-004-2013)、“江海21號”(GS-02-003-2015)和“諾亞1號”(GS-01-005-2016)共5個新品種,推動了中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。但隨著市場競爭的日益激烈及產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展,現(xiàn)有品種遠不能滿足中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求。此外,目前中華絨螯蟹新品種的選育方法為傳統(tǒng)的選擇育種,難以避免出現(xiàn)遺傳漂變、混雜衰退等問題[7]。隨著現(xiàn)代分子生物學和遺傳學的不斷發(fā)展,為中華絨螯蟹遺傳育種提供了新的途徑,將現(xiàn)代分子育種技術與傳統(tǒng)育種技術結合,可提高育種效率、完善性狀評價體系。此外,中華絨螯蟹高質量基因組和遺傳圖譜的相繼公布,也為其現(xiàn)代分子育種奠定了基礎。

1 中華絨螯蟹傳統(tǒng)育種方法與現(xiàn)狀

1.1 選擇育種

選擇育種是一種傳統(tǒng)有效的新品種培育方法,通過對群體的反復選擇淘汰、優(yōu)中選優(yōu),培育出符合選育目標的優(yōu)良個體[8]。該方法能夠分離并固定優(yōu)良性狀,保留有益的變異,提高中華絨螯蟹的經(jīng)濟性狀,提純和復壯其品種[9]。中華絨螯蟹的選育主要有群體選育、配套系選育和家系選育等。群體選育是挑選表現(xiàn)型優(yōu)良的中華絨螯蟹群體作為基礎群,逐代根據(jù)生長速度、體型特征、抗逆性等選育指標選種選配[10]。迄今為止,已通過群體選育培育出了4個新品種(中華絨螯蟹“長江1號”、“長江2號”、“光合1號”、“諾亞1號”)。配套系育種是將擁有某種經(jīng)濟性狀和遺傳特性的品系或選育系進行配組繁育,聚合培育出具有父本和母本優(yōu)良經(jīng)濟性狀的一種育種方法,中華絨螯蟹“江海21號”為國內首例中華絨螯蟹配套系新品種[11]。吳廉等[12]比較了正、反交兩個配套組合與親本群體的遺傳多樣性后,發(fā)現(xiàn)配套系育種可以聚合選育系的優(yōu)良性狀,提高種群遺傳多樣性及環(huán)境適應能力。家系選育是通過建立大規(guī)模家系并開展系統(tǒng)性選擇的一種育種方法,已廣泛應用于多種甲殼類動物遺傳育種中[13-14]。2008年江蘇省淡水水產(chǎn)研究所成功突破長江水系大規(guī)格中華絨螯蟹家系構建,并不斷改進技術,于2017年選擇長江水系中華絨螯蟹不同群體的大規(guī)格親蟹構建ES-P2017家系,成功定向構建全同胞家系96個,家系構建成功率達96.00%[15-16]。劉偉等[17]通過建立10個長江系中華絨螯蟹家系,進行系統(tǒng)選擇育種,經(jīng)過LSD多重比較得出不同家系生長性能差異顯著的結論,為中華絨螯蟹家系選育奠定了理論基礎。現(xiàn)階段中華絨螯蟹選擇育種技術體系已經(jīng)較為成熟,選育效果顯著,應用推廣成果突出。

1.1.1 群體選擇與選育指標

目前選育成功的新品種均采用選擇育種方法。中華絨螯蟹“長江1號”是以2000年從國家級江蘇高淳固城湖中華絨螯蟹原種場收集1000組體形特征標準、健康無病的長江水系原種中華絨螯蟹作為基礎群體,以生長速度和個體規(guī)格為選育指標,連續(xù)5代群體選育而成的[4]。 中華絨螯蟹“長江2號”是以2003年從荷蘭引回的萊茵河水系中華絨螯蟹作為基礎群體,將生長速度、個體規(guī)格、形態(tài)特征作為選育指標,通過連續(xù)5代群體選育而成的[4]。中華絨螯蟹“光合1號”是將來自鴨綠江、遼河、海河、黃河4個不同地理群體的遼河水系中華絨螯蟹組建基礎群體,以體質量和規(guī)格為主要選育指標,以外觀形態(tài)為輔助選育指標,經(jīng)過連續(xù)5代選育而成的具有成活率高、抗逆性強、生長速度快等標志性狀的中華絨螯蟹新品種[18]。中華絨螯蟹“諾亞1號”是以2004年挑選的體型健壯、附肢齊全、活力強、性腺發(fā)育良好、背甲淡青色的689只野生親蟹構建選育基礎群體,其中雌蟹365只、雄蟹324只,組建保種核心群體,開展定向對比繁殖培育而成的[19]。中華絨螯蟹“江海21號”是以2004年和2005年從長江干流南京江段采捕的野生中華絨螯蟹、從國家級江蘇高淳長江水系中華絨螯蟹原種場和國家級安徽永言中華絨螯蟹原種場收集的保種群體,構建基礎群體,以生長速度、步足長和額齒尖為選育指標,連續(xù)4代選育而成的[20]。除中華絨螯蟹 “長江2號”[21]外,所有新品種的基礎群體均來自長江、遼河水系。中華絨螯蟹“長江2號”通過引種馴化,選育效果勝過“長江1號”,定向改造了中華絨螯蟹的區(qū)系組成,提高質量和產(chǎn)量,充實育種材料。并且新品種的選育指標也早已不局限于生長速度和個體規(guī)格,開始出現(xiàn)具有高辨識度的形態(tài)特征。

1.1.2 選育效果評估

通過選擇育種,中華絨螯蟹“長江1號”生長速度快,2齡成蟹生長速度提高16.7%;形態(tài)特征明顯,背甲寬大于背甲長,呈橢圓形,體型好;規(guī)格整齊,雌、雄體質量變異系數(shù)均小于10%[22]。中華絨螯蟹“長江2號”生長速度提高約19.4%,平均個體規(guī)格增加約18.5%;成蟹養(yǎng)殖群體規(guī)格整齊,雌雄體質量變異系數(shù)均小于10%,遺傳性狀穩(wěn)定[21]。中華絨螯蟹“光合1號”規(guī)格大,成活率高;背甲寬度(額寬、第一側齒寬)較長、背甲厚度(體高)較高,第4步足較短,多態(tài)位點比例降低了2.58%,遺傳性狀穩(wěn)定[23]。中華絨螯蟹“諾亞1號”體型健壯、附肢齊全、活力強、性腺發(fā)育良好;有4個額齒尖,額齒間缺刻深,內額齒間缺刻呈“U”型;生長速度提高19.86%,雄蟹200 g以上比例逾56%,300 g以上比例超過10%;雌蟹150 g以上比例逾42%,200 g以上比例超過12%[19]。中華絨螯蟹“江海21號”生長快、規(guī)格大、產(chǎn)量高;步足長、成活率高、遺傳穩(wěn)定等;生長速度提高17.8%以上,雌蟹150 g、雄蟹200 g以上的大規(guī)格比例可超過50%[20]。由此可見,新品種選育成效顯著,適合應用推廣。

1.2 雜交育種

雜交育種一般指不同品系、品種間,甚至種間、屬間或亞科間個體的交配[23]。利用雜交優(yōu)勢,能夠獲得生長速度、抗病性、品質等養(yǎng)殖性狀優(yōu)于雙親的中華絨螯蟹新品種,或使后代獲得遺傳改良,在品種改良以及生產(chǎn)應用中發(fā)揮作用,是一種基礎有效的育種途徑[24]。目前,研究人員已在中華絨螯蟹雜交育種領域進行了一系列嘗試。彭武漢[25]將中華絨螯蟹分別與“珠江毛蟹”(中華絨螯蟹)、日本絨螯蟹(E.japonica)雜交,均能培育出幼蟹,觀察發(fā)現(xiàn)雜交子代的前緣齒及側齒存在不同程度的變異。此外唐士橋等[26]將綏芬河水系日本絨螯蟹與遼河水系中華絨螯蟹進行雜交試驗,所獲得的雜交一代側缺刻較淺,中缺刻呈V形,后疣突不明顯,沒有明顯的雜種優(yōu)勢,可正常繁育后代。吳旭干等[27-28]將日本絨螯蟹及其雜交子代性腺發(fā)育和生化組成以及遺傳多樣性進行了比較分析,結果表明,絨螯蟹屬不同種間是可雜交的。雖然以上研究尚未發(fā)現(xiàn)具有明顯優(yōu)良性狀的中華絨螯蟹雜交品種,但為絨螯蟹屬的種間雜交提供了實踐基礎,隨著對中華絨螯蟹潛在經(jīng)濟性狀的挖掘,較為成熟的雜交育種技術能更直接地將性狀保留下來。

2 中華絨螯蟹現(xiàn)代育種方法與現(xiàn)狀

我國中華絨螯蟹育種方式正將傳統(tǒng)的選育方法與現(xiàn)代分子遺傳學手段相結合,進行現(xiàn)代育種方式有細胞工程育種、分子標記輔助育種等。

2.1 細胞工程育種

細胞工程育種技術研究目前主要集中在中華絨螯蟹多倍體育種以及性別控制方面。多倍體育種是通過物理、化學以及生物學方法,增加中華絨螯蟹的染色體組至3組及3組以上,改造其遺傳基礎,從而培育出個體大、生長快、抗病力強、成活率高的優(yōu)良品種[29]。實現(xiàn)體外培養(yǎng)是多倍體育種的第一步,但中華絨螯蟹的抱卵特性使受精卵離體培養(yǎng)十分困難[30]。李泰煌等[31-32]以“殺蟹取卵”的人工授精法成功實現(xiàn)了中華絨螯蟹受精卵的體外培養(yǎng);邱高峰等[33-35]已攻克抱卵及體外孵化的難題。體外培養(yǎng)技術的突破為中華絨螯蟹多倍體育種奠定了基礎。陳立僑等[36-37]利用細胞松馳素B處理法誘導出三倍體和四倍體中華絨螯蟹,誘導率高達51.61%和57.89%,這是中華絨螯蟹多倍體育種的首次報道,證明了多倍體育種技術應用于中華絨螯蟹的可行性。崔朝霞等[38]改進方法,運用細胞松弛素B、KCl等化學藥物處理中華絨螯蟹,獲得77.5%的三倍體率和79.8%的四倍體率。但其采用的方法是直接處理含受精卵的母體,未運用體外培養(yǎng)技術。綜上可知,目前中華絨螯蟹的多倍體誘導雖有成功的案例,但其成活率低,且因試劑價格高昂,難以大規(guī)模推廣。細胞工程育種的突破主要圍繞誘導技術的開發(fā)以及存活率的保證,多倍體在其他水產(chǎn)生物中的優(yōu)勢若能呈現(xiàn)于中華絨螯蟹中,在個體的生長性狀或是群體的種質保護上都具有重大意義。

2.2 分子標記輔助育種

分子標記輔助育種是利用與目標性狀緊密相關的分子標記,對具有性狀優(yōu)勢的等位基因或基因型的個體進行選擇育種,將分子生物學、基因組學的研究結果用于品種選育的技術[39-40]。它能在DNA水平上進行選擇,并且選擇的準確性較高,不受環(huán)境影響,大大縮短育種周期。在中華絨螯蟹遺傳育種研究中廣泛應用的分子標記為微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性分子標記。

近年來,微衛(wèi)星標記由于其多態(tài)性好、雜合率高和共顯性遺傳等特點,被廣泛開發(fā)和應用于遺傳圖譜構建[41]、遺傳多樣性分析[42]和物種鑒定[43]等方面。熊良偉等[44]利用60個微衛(wèi)星標記對中華絨螯蟹F1群體的雙親及其子代進行多態(tài)性檢測,并進行了親子遺傳分離類型及連鎖關系分析,成功構建了中華絨螯蟹遺傳連鎖圖譜。遺傳連鎖圖譜的構建是開發(fā)分子標記的一個重要環(huán)節(jié),為中華絨螯蟹的分子標記輔助育種提供服務。吳滟等[45]從30個微衛(wèi)星標記中成功篩選出與中華絨螯蟹生長性狀相關的分子標記,有望應用于輔助選育。

單核苷酸多態(tài)性標記為第3代分子標記,在有關中華絨螯蟹單核苷酸多態(tài)性位點的研究中,Xiao等[46]從轉錄組中開發(fā)驗證了42個單核苷酸多態(tài)性位點,給中華絨螯蟹的遺傳多樣性分析和選擇育種方案提供了理論方向;Qiu等[47]通過SLAF-seq技術鑒定到127 677個單核苷酸多態(tài)性位點,并且將其中的17 680個單核苷酸多態(tài)性位點定位于染色體上,構建了中華絨螯蟹的首張單核苷酸多態(tài)性連鎖圖譜,在研究某一經(jīng)濟性狀時可以尋獲與其關聯(lián)或有作用關系的單核苷酸多態(tài)性位點,為中華絨螯蟹分子標記輔助育種提供了重要依據(jù)。

近年來開發(fā)性別標記、構建高密度遺傳圖譜等已成為中華絨螯蟹性別決定及分化機制研究的手段[48-49]。Cui等[50]利用高密度遺傳連鎖圖譜揭示中華絨螯蟹性別決定機制為ZW/ZZ型。崔朝霞等[51]公開了1種鑒定中華絨螯蟹性別的特異性分子標記,通過對中華絨螯蟹的雌性、雄性基因組重測序數(shù)據(jù)比對,篩選雌性特異性片段,經(jīng)過篩選得到2對引物8227-F1&R1和8227-F23&R23。2對引物均可根據(jù)電泳條帶結果表明雌雄差異,即只有雌性擴增產(chǎn)物能夠產(chǎn)生特異性條帶,據(jù)此成功對中華絨螯蟹進行性別鑒定。陳曉雯等[52]通過中華絨螯蟹雄性特異Etse基因片段標記進行中華絨螯蟹性別鑒定,電泳結果顯示,雄性擴增產(chǎn)物有1條特異性條帶,雌性擴增產(chǎn)物沒有特異性條帶,實現(xiàn)了中華絨螯蟹的性別鑒定,用于滿足定向生產(chǎn)需求。

3 展望及對策

目前我國通過傳統(tǒng)的選擇育種培育出了5個中華絨螯蟹新品種,仍需進一步優(yōu)化肥滿度、成活率等選育指標,關注不同行為學特點(如好斗與溫和)、營養(yǎng)品質、不同環(huán)境適應能力等性狀。隨著現(xiàn)代育種技術的發(fā)展,需要在全基因組選擇育種、單性育種和基因編輯育種等方面實現(xiàn)突破和攻關:

(1)開展全基因組選擇育種研究。隨著中華絨螯蟹全基因組信息的相繼破譯,快速選擇優(yōu)良基因型的全基因組關聯(lián)研究將成為其育種的新方向。而近年中華絨螯蟹病害頻發(fā),嚴重影響其產(chǎn)業(yè)發(fā)展,因此,對中華絨螯蟹抗病相關基因及其功能的研究是防控其重大疾病(白斑病、肝胰腺壞死病、牛奶病、甲殼潰瘍病等)的重要基礎工作?？梢酝ㄟ^構建抗病中華絨螯蟹家系,在全基因組水平上實現(xiàn)抗病分子標記輔助育種,挖掘抗病性狀相關聯(lián)的分子標記,從而選育出抗病中華絨螯蟹新品種。

(2)加強性別控制和單性育種研究。進一步研究中華絨螯蟹性別遺傳特性和性別決定機制,探索其單性(全雌和全雄)育種的路徑和可行性,為后續(xù)中華絨螯蟹單性育種打下基礎。

(3)建立中華絨螯蟹基因編輯技術平臺用于育種。CRISPR/Cas9基因編輯技術是未來中華絨螯蟹育種的方向。將基因編輯應用于實際育種還有許多難點需要攻克,如從蟹類中找到有效遞送基因編輯原件Cas9和sgRNA的方法、尋找調控優(yōu)良性狀或高抗逆性具有遺傳效應的基因等。鑒于部分水生甲殼動物[如脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicavda)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)等][53-55]基因編輯技術的初步成功,對今后建立中華絨螯蟹基因編輯技術平臺提供了參考,為提高育種效率、優(yōu)化種質,最終實現(xiàn)中華絨螯蟹的基因編輯育種提供了方向。

目前制約中華絨螯蟹遺傳育種的關鍵技術是育種材料的保存與評估技術。今后,應加快建立中華絨螯蟹種質資源庫,增設中華絨螯蟹原種場,采取活體保種與DNA樣本保存相結合的方式,充實育種材料;針對不同性狀的評價方法,建立一套精準的適合中華絨螯蟹表型測定方法,貫穿從育種材料選擇和保存、親本選配到新品種育成整個過程。