胡鯉萍，魏 嫻，蔡芳芳，林燕蕓，劉玲英

廈門(mén)長(zhǎng)庚醫(yī)院，福建 廈門(mén) 361028

沙門(mén)菌是影響人類(lèi)生態(tài)行為活動(dòng)的重要傳染病病原菌之一，是引起感染性腹瀉的常見(jiàn)病原菌，其普遍存在于自然界中，主要通過(guò)食物和水源引起人類(lèi)感染，能引起傷寒、副傷寒或非傷寒性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，每年沙門(mén)菌感染的病例約有9 000 萬(wàn)，其中死亡人數(shù)近15萬(wàn)人［1-2］。沙門(mén)菌感染呈現(xiàn)明顯的季節(jié)分布［2］，由于沙門(mén)菌血清型非常復(fù)雜，根據(jù)沙門(mén)菌O相抗原和H 相抗原的不同組合，WKLM 抗原表將沙門(mén)菌分為2 500 多個(gè)血清型［3］，準(zhǔn)確對(duì)沙門(mén)菌血清分型就顯得尤為重要。目前，臨床上常用于治療沙門(mén)菌病的藥物主要為三代頭孢和氟荃喹諾酮類(lèi)，但隨著這些抗生素的大量使用，世界各地均出現(xiàn)了大量三代頭孢和氟荃喹諾酮類(lèi)耐藥的沙門(mén)菌［4-5］，給臨床治療沙門(mén)菌病和食品安全帶來(lái)巨大壓力。本研究選取2021年廈門(mén)長(zhǎng)庚醫(yī)院分離的沙門(mén)菌株進(jìn)行血清學(xué)分型、藥物敏感性試驗(yàn)及對(duì)β-內(nèi)酰胺和氟荃喹諾酮相關(guān)耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和分析，了解其流行狀況、病原學(xué)特征以及初步分析β-內(nèi)酰胺和氟荃喹諾酮的耐藥機(jī)制，為沙門(mén)菌病的防控及臨床科學(xué)用藥提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

選取2021年1—12月廈門(mén)長(zhǎng)庚醫(yī)院腹瀉病例糞便培養(yǎng)的沙門(mén)菌分離株，共計(jì)50株。

1.2 主要儀器和試劑

沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）平板、麥康凱平板、沙門(mén)菌血清（寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司，丹麥SSI）、VITEK 2 COMPACT 及配套的革蘭陰性菌（Gramnegative，GN）生化鑒定卡及藥敏卡（法國(guó)梅里埃GN13）。

1.3 方法

1.3.1 菌株的鑒定 將腹瀉患者糞便標(biāo)本接種于SS和麥康凱平板上，置于35 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，挑取疑似菌落，分離純化，并經(jīng)VITEK 2生化鑒定，符合沙門(mén)菌屬的進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 血清鑒定 根據(jù)WHO推薦的沙門(mén)菌O&H抗原標(biāo)準(zhǔn)化鑒定流程進(jìn)行菌株血清型鑒定，并送至福建省疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌室進(jìn)行復(fù)核確認(rèn)。

1.3.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 沙門(mén)菌對(duì)13種抗菌藥物（氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和復(fù)方磺胺甲噁唑）的耐藥性由藥敏卡（法國(guó)梅里埃GN13）測(cè)定，折點(diǎn)判斷依據(jù)2019年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)［6］。多重耐藥菌（MDR）定義：至少同時(shí)耐3種和（或）以上不同類(lèi)型抗菌藥物。

1.4 耐藥基因篩查

1.4.1 模板制備 采用熱裂解法，挑取數(shù)個(gè)純菌培養(yǎng)的新鮮菌落于100 μL 純水中，制成懸濁液。100 ℃煮沸10 min，12 000 r /min離心3 min，取上清作為反應(yīng)模板，-20 ℃保存以備用。

1.4.2 聚合酸鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)體系及條件 PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，其中2×Taq PCR MasterMix （TaKaRa 公司）10 μL，上下游引物（10 μmoL /L ）各1 μL，DNA 模板4 μL，dd H2O 4 μL。PCR 反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃30 s，50～57 ℃30 s，72 ℃30～60 s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳條帶與目標(biāo)預(yù)計(jì)大小一致的送測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離時(shí)間與人群分布特征

2021 年醫(yī)院共分離沙門(mén)菌共50 株，均來(lái)源于臨床病例，其中男29例，女21例。1—12月各月份均有沙門(mén)菌檢出，其中，5—10 月份檢出率較高，呈現(xiàn)夏秋季節(jié)性分布特征，見(jiàn)圖1。

圖1 不同月份及性別病例分布情況

2.2 分離株沙門(mén)菌血清群和型分布特征

經(jīng)血清凝集O&H 抗原鑒定試驗(yàn)及查White-Kauffmann表，50 株沙門(mén)菌共分為B、C1、C2-3、D、E1 五個(gè)血清群，9 個(gè)不同的血清型，其中以鼠傷寒沙門(mén)菌占比最高48.00%（24/50），其次為腸炎沙門(mén)菌14.00%（7/50），其他型別的沙門(mén)菌亦有少量檢出，見(jiàn)表1。

表1 50株沙門(mén)菌血清群/型分布特征

2.3 不同年齡沙門(mén)菌血清型分布情況

50 個(gè)檢出沙門(mén)菌病例的年齡分布在2 個(gè)月～90 歲之間，3歲以下兒童檢出率最高，為64.00%（32/50）；3歲以下兒童中檢出最高的血清型為鼠傷寒沙門(mén)菌，占38.00%（19/50），其他各年齡段檢出的沙門(mén)菌血清型分布，見(jiàn)表2。

表2 不同年齡血清型分布情況株

2.4 分離株藥敏情況分布

50株沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林（72.00%）、氨芐西林/舒巴坦（56.00%）、復(fù)方磺胺甲噁唑（36.00%）耐藥率較高；菌株多重耐藥（MDR）率為40.00%。對(duì)頭孢他啶（12.00%）、頭孢曲松（16.00%）、氨曲南（16.00%）、頭孢吡肟（4.00%）、環(huán)丙沙星（22.00%）、左氧氟沙星（12.00%）、呋喃妥因（8.00%）較為敏感；未發(fā)現(xiàn)對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、厄他培南耐藥的菌株，見(jiàn)表3。

表3 50株沙門(mén)菌的藥物敏感性特征

2.5 分離株耐藥基因篩查

2.5.1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶TEM和CTX-M基因 50株沙門(mén)共檢出TEM 基因28 株，占總數(shù)的56.00%（28/50），28 株TEM基因陽(yáng)性菌株均對(duì)氨芐西林耐藥，占氨芐西林耐藥菌株的77.78%（28/36）。CTX-M基因檢出數(shù)為8，占總數(shù)的16.00%（8/50），8 株檢出CTX-M 基因的菌株均對(duì)頭孢曲松和氨曲南耐藥，耐藥表型與耐藥基因型完全一致。另外，8 株檢出CTX-M 基因的菌株中5 株同時(shí)檢出TEM 基因。8 株CTX-M 基因測(cè)序結(jié)果在NCBI 比對(duì)表明，6 株為CTX-M-55型，2株為CTX-M-14型[7-10]。

2.5.2 喹諾酮耐藥區(qū)（QRDR）基因突變與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因（PMQR）50株沙門(mén)中檢出喹諾酮類(lèi)藥物耐藥決定區(qū)（QRDR）存在gyrA 和gyrA 兩個(gè)基因突變類(lèi)型，檢出gyrA基因突變株8株，其中2株同時(shí)發(fā)生parC基因突變。該8株菌株均為環(huán)丙沙星和左氧氟沙星不敏感株，占環(huán)丙沙星不敏感表型的61.54%（8/13）。gyrA 基因突變位點(diǎn)分別為第83和87位氨基酸，突變氨基酸類(lèi)型分別為2株Ser83Tyr、2 株Ser83Phe、2 株Asp87Tyr、2 株Asp87Asn 和2 株Asp87Gly，其中2 株同時(shí)發(fā)生Ser83Phe-Asp87Gly 及parC:Ser80Ile 雙突變。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因（PMQR）aac（6'）-Ib-cr，oqxA，oqxB 在50 株沙門(mén)菌中的檢出率分別為26.00% （13/50），12.00% （6/50）和12.00%（6/50），這些陽(yáng)性基因在環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥株和敏感株中均有檢出[11-13]。

3 討論

沙門(mén)菌是臨床和食品公共衛(wèi)生安全中常見(jiàn)的一種腸道食源性致病菌，可導(dǎo)致人類(lèi)感染傷寒、副傷寒和急性腸胃炎等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)70%～80%細(xì)菌性食物中毒均由沙門(mén)菌引起［14］。禽肉、蛋等食品污染是沙門(mén)菌感染的主要來(lái)源，隨著抗生素的大量使用和濫用，臨床分離株中也出現(xiàn)不同程度的耐藥，尤其是臨床治療沙門(mén)菌的兩類(lèi)常用藥物三代頭孢和氟荃喹諾酮類(lèi)，也出現(xiàn)了大量的耐藥菌株，為此，加強(qiáng)臨床沙門(mén)菌菌株的血清學(xué)分型、耐藥監(jiān)測(cè)及耐藥機(jī)制的研究就具有了重要意義。

本研究中回顧性分析樣本醫(yī)院分離的50株沙門(mén)菌株，共分離出5個(gè)血清群（B、C1、C2-3、D、E1），其中以B群為最大占比52.00%（26/50），B群中以鼠傷寒沙門(mén)菌24株為最常見(jiàn)分離株：而D群中主要以腸炎沙門(mén)菌為主要分離株，這與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者研究一致［15-16］。本次分離的菌株中主要來(lái)源于3 歲以下，共分離到32 株（19 株鼠傷寒沙門(mén)菌、3 株腸炎沙門(mén)菌、3 株倫敦沙門(mén)菌、2 株斯坦利沙門(mén)菌、2株里森沙門(mén)菌、1株波茨坦沙門(mén)菌、1株紐波特沙門(mén)菌、1 株明斯特沙門(mén)菌）；60 歲以上有4 株（2 株腸炎沙門(mén)、1株傷寒沙門(mén)菌、1株里森沙門(mén)菌）；來(lái)源于3～60歲的有14株（2株里森沙門(mén)菌、4株鼠傷寒沙門(mén)菌、2株腸炎沙門(mén)菌、1株倫敦沙門(mén)菌、1株波茨坦沙門(mén)菌、1株紐波特沙門(mén)菌、2株肯塔基沙門(mén)菌、1株明斯特沙門(mén)菌）。這可能由于小于3歲以下兒童機(jī)體免疫系統(tǒng)尚處于發(fā)育過(guò)程中，對(duì)沙門(mén)菌抵抗能力比較差，而大于60歲老年人，往往由于基礎(chǔ)性疾病以及身體機(jī)能的下降，也對(duì)沙門(mén)菌抵抗不足，成為沙門(mén)菌主要的攻擊對(duì)象［15］，為此應(yīng)加強(qiáng)嬰幼兒及老年人沙門(mén)菌的健康監(jiān)測(cè)，尤其在一些腹瀉病例中，應(yīng)加強(qiáng)沙門(mén)菌的分離培養(yǎng)。

本次分離的50 株菌株中，對(duì)氨芐西林的耐藥達(dá)72.00%（36/50）、對(duì)氨芐西林/舒巴坦達(dá)56.00%（28/50），而TEM 基因檢出28 株，占總數(shù)的56.00%（28/50），占氨芐西林耐藥菌株的77.78%（28/36），提示氨芐西林的耐藥主要可能由TEM 基因介導(dǎo)。部分氨芐西林耐藥株未檢出TEM基因，可能與其他如AmpC等耐藥基因有關(guān)。50株菌對(duì)頭孢曲松耐藥和氨曲南耐藥率為16.00%（8/50），這與CTX-M 基因的檢出率一樣，且其耐藥表型與耐藥基因型完全一致。這表明三代頭孢耐藥主要由CTX-M 基因介導(dǎo)，這也與菌株對(duì)頭孢他啶耐藥較頭孢曲松較低符合，因?yàn)镃TX-M 酶對(duì)頭孢他啶水解能力較頭孢曲松弱。測(cè)試菌株對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為22.00%（11/50）和12.00%（6/50），gyrA基因突變位點(diǎn)均為83位和87位氨基酸突變，這與陳晶等［5］在武漢社區(qū)沙門(mén)菌中檢出的突變一致。

另外，本研究檢出2株同時(shí)發(fā)生Ser83Phe-Asp87Gly和parC:Ser80Ile 的雙突變株，通常認(rèn)為雙重突變會(huì)介導(dǎo)高水平的喹諾酮耐藥，說(shuō)明本地區(qū)已出現(xiàn)對(duì)喹諾酮高水平的耐藥，應(yīng)引起足夠的重視。所有菌株對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、厄他培南，均為敏感菌株，這與李美華等［16-17］的報(bào)道基本一致。近年來(lái)，沙門(mén)菌多重耐藥率越來(lái)越高，許多菌株呈現(xiàn)出不同的耐藥程度，甚至出現(xiàn)多耐藥現(xiàn)象，本研究分離的50 株菌株中也出現(xiàn)了20 株多重耐藥性菌株，達(dá)40.00%，這也提醒研究者在臨床分離的沙門(mén)菌存在比較嚴(yán)重的多耐藥現(xiàn)狀菌株，可能與患者在出現(xiàn)腹瀉后未及時(shí)就診而自行服用各種抗菌藥物及抗菌藥物有關(guān)［18-21］。

沙門(mén)菌感染是臨床常見(jiàn)的腹瀉病因之一，也是臨床比較棘手的問(wèn)題。為預(yù)防因抗生素的濫用而導(dǎo)致臨床關(guān)注的多重耐藥超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，臨床微生物檢驗(yàn)科應(yīng)加強(qiáng)沙門(mén)菌分離培養(yǎng)、血清分型、耐藥監(jiān)測(cè)及耐藥機(jī)制研究，為控制沙門(mén)菌臨床指導(dǎo)提供依據(jù)。