夏玉吉，陳華鳳，竇明理，武首薰，何 楠，王 毅*

（1.四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川成都 610097；2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（白酒監(jiān)管技術(shù)），四川成都 610097；3.四川大學(xué)，四川成都 610000）

獸藥殘留是目前食品安全監(jiān)管的重要內(nèi)容，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，能夠快速識(shí)別動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留，已廣泛應(yīng)用于食品安全監(jiān)管。沙羅拉納[1]是一類作用于γ-氨基丁酸受體的新型驅(qū)蟲藥[2]，與其他驅(qū)蟲藥相比，這類藥物具有吸收迅速、作用時(shí)間長(zhǎng)（可持續(xù)12 周）[3]、代謝率低的特點(diǎn)（半衰期為10～14 d[4]），容易在肉及肉制品中殘留。肝臟是這類藥物的主要代謝器官，且肝臟基質(zhì)復(fù)雜，常規(guī)凈化效果不佳，因此選擇肝臟作為代表基質(zhì)研究樣品的前處理，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，并對(duì)方法的耐用性進(jìn)行考察。

分析方法的耐用性是指分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室一般不易控制或不能保持完全一致的微小條件變化的敏感性[5]。《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制術(shù)語(yǔ)和定義》（GB/T 32467—2015）和《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）都對(duì)分析方法建立時(shí)開(kāi)展耐用性試驗(yàn)有嚴(yán)格的要求，但這些標(biāo)準(zhǔn)中并未給出具體的試驗(yàn)方案，僅有的幾篇文獻(xiàn)也只報(bào)道了耐用性試驗(yàn)在重金屬檢測(cè)[6-8]以及氣相色譜測(cè)定環(huán)境污染物等領(lǐng)域的應(yīng)用，未見(jiàn)耐用性試驗(yàn)在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析領(lǐng)域的報(bào)道。本試驗(yàn)首先建立沙羅拉納的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，再以W.J.尤登教授的耐用性試驗(yàn)為基礎(chǔ)，利用PASW Statistics 18 軟件設(shè)計(jì)正交表，考察10 個(gè)微小影響因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，再運(yùn)用t檢驗(yàn)、因素差值與標(biāo)準(zhǔn)差比較等兩種統(tǒng)計(jì)方法對(duì)耐用性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究結(jié)果將為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜領(lǐng)域開(kāi)展耐用性試驗(yàn)的因素選擇、方案設(shè)計(jì)提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1290/6460 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀，電子天平XS105DU，高速離心機(jī)HERAEUS MULTIFUGE X3R，渦旋混合儀 IKA MS 3。

沙羅拉納標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100 μg·mL-1；甲醇、乙腈、甲酸銨均為色譜純；PRiME HLB 固相萃取柱150 mg/3 mL；陰性豬肝樣品。

1.2 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流 動(dòng) 相A 為5 mmol·L-1甲酸銨水，流動(dòng)相B 為甲醇，洗脫程序梯度為0 ～2.0 min，體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇；5.0 ～7.0 min，體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇；7.1 ～10.0 min，體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜參數(shù)如下。大氣壓電噴霧離子源（API-ESI）；MRM 模式；干燥氣溫度：350 ℃； 干燥氣流量：5 L·min-1；霧化氣壓力：45 psi；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流量：11 L·min-1；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；噴嘴電壓：500 V；增益電壓：300 V。MRM 測(cè)定參數(shù)為正模式，母離子（m/z）581，定量離子（m/z）444，定性離子（m/z）416，去簇電壓均為150 V，碰撞能量均為15 V。

1.3 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的樣品2.00 g 至50 mL 具塞離心管內(nèi)，加入10 mL 乙腈，渦旋1 min，超聲15 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上層清液過(guò)PRiME HLB 固相萃取小柱，收集流出液，40 ℃氮吹至近干，1 mL 甲醇定容，過(guò)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，直接注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。

1.4 耐用性實(shí)驗(yàn)方案

1.4.1 因素選擇

本次試驗(yàn)主要考察10 個(gè)微小因素（用A～J表示），每個(gè)因素設(shè)計(jì)了兩個(gè)水平，利用PASW Statistics 18 軟件設(shè)計(jì)正交表（表1）。

表1 耐用性試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.4.2 檢測(cè)編號(hào)組合

將考察的10 個(gè)因素，按表2 的編號(hào)組合進(jìn)行安排。

表2 檢測(cè)編號(hào)組合

1.4.3 具體檢測(cè)方案

按照表2 的測(cè)試編號(hào)組合，共做12 次檢測(cè)。每次檢測(cè)的條件見(jiàn)表3。

表3 檢測(cè)編號(hào)及條件組合

1.4.4 檢測(cè)分工

實(shí)際檢測(cè)樣品是在陰性豬肝中添加固定濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品制得，上機(jī)測(cè)試液中沙羅拉納濃度約為100 ng·mL-1（10 倍定量限水平）。兩個(gè)人員的檢測(cè)分工見(jiàn)表4。

表4 測(cè)試人員分工安排

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1 超聲提取時(shí)間

提取環(huán)節(jié)，試驗(yàn)考察了超聲提取10 min、15 min、20 min 3 種情況，考察結(jié)果以陰性樣品在定量限水平的加標(biāo)回收率表示，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，超聲提取15 min，沙羅拉納加標(biāo)回收率最高。

表5 不同超聲提取時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

2.1.2 固相萃取小柱選擇

針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)豬肝，前處理凈化環(huán)節(jié)重點(diǎn)考察了固相萃取小柱及提取液，有3 種組合形式見(jiàn)表6，考察結(jié)果以陰性樣品在定量限水平的加標(biāo)回收率表示，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 固相萃取小柱及配套取液優(yōu)化結(jié)果

結(jié)果表明，以乙腈作提取液過(guò)PRiME HLB 小柱，提取凈化效果最佳。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

本文主要考察了3 種色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Waters ACQUITY UPLC HSS T3和Waters ACQUITY BEH C18，結(jié)果如圖1 所示。其中，沙羅拉納采集的兩對(duì)特征離子對(duì)（m/z）為581/416、581/444。流動(dòng)相體系主要考察了液相色譜-質(zhì)譜分析中的常見(jiàn)流動(dòng)相體系，即甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨、甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨、甲醇-0.1%甲酸水，結(jié)果見(jiàn)圖2?？疾旖Y(jié)果表明，3 種色譜柱目標(biāo)物均能實(shí)現(xiàn)較好的分離，且峰形較好；3 種流動(dòng)相體系中甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨流動(dòng)相梯度洗脫峰形最佳，分離效果最好。考慮到Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱在實(shí)驗(yàn)室中較為常備，液相色譜條件最終選取Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱、甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨流動(dòng)相梯度洗脫。

圖1 不同色譜柱條件下的MRM 質(zhì)譜圖

圖2 不同流動(dòng)相體系的MRM 質(zhì)譜圖

2.3 檢出限和定量限

標(biāo)準(zhǔn)曲線采用空白基質(zhì)溶液配制，在0 ～200 ng·mL-1線性關(guān)系良好，y=22.09x+28.32，r2=0.999。檢出限是通過(guò)在空白樣品中添加低濃度水平目標(biāo)組分的方法確定，依據(jù)其定性離子色譜峰的信噪比（S/N）＞3 而測(cè)定的，為2.0 μg·kg-1；定量限是其定性離子色譜峰的信噪比（S/N）＞10 而測(cè)定的，為5.0 μg·kg-1。

2.4 耐用性試驗(yàn)

2.4.1 耐用性試驗(yàn)的因素選擇

實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)中，不能刻意控制的或不能保持完全一致的微小條件很多，包括前處理各環(huán)節(jié)溫度控制、人員、存放時(shí)間、試劑耗材等。在進(jìn)行耐用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)方法的特點(diǎn)，結(jié)合使用的具體情況，合理安排需要考察的微小因素。超聲溫度因素分別為從室溫開(kāi)始（水溫約15 ℃），超聲15 min 后水溫升高至約30 ℃；將超聲儀水溫設(shè)為30 ℃，待溫度平衡后開(kāi)始超聲。濾膜因素：主要考察不同的濾膜是否對(duì)目標(biāo)分析物有吸附，選擇的因素分別為兩個(gè)來(lái)源的濾膜。時(shí)間因素：主要考察批量處理了樣品后，放在進(jìn)樣盤上待進(jìn)樣時(shí)是否會(huì)影響定量分析的準(zhǔn)確性，分別及時(shí)檢測(cè)和間隔3 d 檢測(cè)（安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀最多容許432 個(gè)樣品，每針進(jìn)樣10 min，第一個(gè)樣品與最后一個(gè)樣品間隔72 h，因此定為3 d）。凈化柱批次：批次1 為012839092A，批次2 為013239242B。

2.4.2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

W.J.尤登教授采用差值排序的方法來(lái)判別試驗(yàn)中需要嚴(yán)格控制的因素，并規(guī)定差值排在前面一位或兩位的因素要引起重視，梳理沙羅拉納中排名前4的因素差值為檢測(cè)時(shí)間（15.6）、人員（-3.2）、乙腈開(kāi)瓶時(shí)間（-2.69）、進(jìn)樣瓶顏色（2.63），檢測(cè)時(shí)間的差值最大，其余差值相差均不大。沙羅拉納各個(gè)因素的平均結(jié)果及其差值，結(jié)果見(jiàn)表7 ～表9。

表7 沙羅拉納耐用性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)（水平1） 單位：ng·mL-1

表8 沙羅拉納耐用性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)（水平2） 單位：ng·mL-1

表9 沙羅拉納耐用性試驗(yàn)不同水平結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

2.4.3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

（1）t檢驗(yàn)。分別對(duì)排名前4 的因素差值進(jìn)行t檢驗(yàn)[9]。結(jié)果表明，檢測(cè)時(shí)間P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，檢測(cè)時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響較大，檢測(cè)時(shí)應(yīng)當(dāng)及時(shí)檢測(cè)，其他因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響可以忽略，無(wú)需嚴(yán)格控制。

（2）各因素差值與標(biāo)準(zhǔn)差比較。E．H．Steiner 介紹了另外一種評(píng)價(jià)方法，即計(jì)算12 次檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，將各個(gè)因素的差值與標(biāo)準(zhǔn)差s進(jìn)行比較，定量評(píng)價(jià)各個(gè)因素變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響程度。如果差值的絕對(duì)值大于（置信概率P=95%），則可認(rèn)為存在實(shí)際的影響，檢測(cè)中應(yīng)有控制措施。反之則認(rèn)為該因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。計(jì)算出12 次檢測(cè)結(jié)果的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，平均數(shù)=83.56，s=10.47，=14.80。結(jié)果顯示，檢測(cè)時(shí)間（差值=15.60）大于其，即對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，需要嚴(yán)格控制檢測(cè)時(shí)間這一影響因素。

運(yùn)用上述兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)耐用性結(jié)果進(jìn)行定量評(píng)價(jià)是對(duì)W.J.尤登教授的差值排序方法的一個(gè)有效補(bǔ)充，在實(shí)際操作時(shí)二者任選其一就能將試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確量化，可以在簡(jiǎn)單的差值排序后，從眾多因素中準(zhǔn)確找出需要嚴(yán)格控制的影響因素，為檢測(cè)方法開(kāi)展協(xié)同試驗(yàn)提供技術(shù)支撐。同時(shí)，也為液相色譜領(lǐng)域開(kāi)展耐用性試驗(yàn)在因素選擇、方案設(shè)計(jì)和結(jié)果評(píng)價(jià)等方面提供一些參考。

3 結(jié)論

豬肝基質(zhì)復(fù)雜，色譜干擾較大，前處理?xiàng)l件考察了超聲提取時(shí)間、提取溶劑及固相萃取小柱，最終選擇用乙腈超聲提取15 min，PRiME HLB 固相萃取柱進(jìn)行凈化，凈化效果好，色譜干擾較??；液相色譜條件優(yōu)化主要考察了色譜柱、流動(dòng)相體系，最終選擇Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱、甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨流動(dòng)相梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)色譜分離完全。該方法操作過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，選擇性強(qiáng)，靈敏度高，可作為豬肝中沙羅拉納殘留量的檢測(cè)方法。